Methodenartikel

Ruimtelijke profilering van eiwit- en RNA-expressie in weefsel: een benadering om virtuele microdissectie te verfijnen

5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62651

⸱

6 juli 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Genentech, 2Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, 3NanoString Technologies

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor het verfijnen van interessante regio's (ROI's) voor Spatial Omics-technologieën om de micro-omgeving van de tumor beter te karakteriseren en specifieke celpopulaties te identificeren. Voor proteomics-assays kunnen geautomatiseerde aangepaste protocollen de ROI-selectie begeleiden, terwijl transcriptomics-assays kunnen worden verfijnd met behulp van ROI's zo klein als 50 μm.

Samenvatting

Multiplexing maakt de beoordeling van verschillende markers op hetzelfde weefsel mogelijk en biedt tegelijkertijd ruimtelijke context. Spatial Omics-technologieën maken zowel eiwit- als RNA-multiplexing mogelijk door gebruik te maken van respectievelijk foto-splijtbare oligo-gelabelde antilichamen en sondes. Oligo's worden gesplitst en gekwantificeerd van specifieke regio's in het weefsel om de onderliggende biologie op te helderen. Hier toont de studie aan dat geautomatiseerde aangepaste antilichaamvisualisatieprotocollen kunnen worden gebruikt om ROI-selectie te begeleiden in combinatie met ruimtelijke proteomics-assays. Deze specifieke methode vertoonde geen acceptabele prestaties met ruimtelijke transcriptomics-assays. Het protocol beschrijft de ontwikkeling van een 3-plex immunofluorescent (IF) assay voor markervisualisatie op een geautomatiseerd platform, met behulp van tyramide signaalversterking (TSA) om het fluorescerende signaal van een bepaald eiwitdoel te versterken en de antilichaampool te vergroten om uit te kiezen. Het visualisatieprotocol werd geautomatiseerd met behulp van een grondig gevalideerde 3-plex-test om kwaliteit en reproduceerbaarheid te garanderen. Daarnaast werd de uitwisseling van DAPI voor SYTO-kleurstoffen geëvalueerd om beeldvorming van TSA-gebaseerde IF-assays op het ruimtelijke profileringsplatform mogelijk te maken. Daarnaast hebben we het vermogen getest om kleine ROI's te selecteren met behulp van de ruimtelijke transcriptomics-test om het onderzoek van zeer specifieke interessegebieden mogelijk te maken (bijvoorbeeld gebieden die zijn verrijkt voor een bepaald celtype). ROIs van 50 μm en 300 μm diameter werden verzameld, wat overeenkomt met respectievelijk ongeveer 15 cellen en 100 cellen. Monsters werden gemaakt in bibliotheken en gesequenced om het vermogen te onderzoeken om signalen van kleine ROI's en profielspecifieke gebieden van het weefsel te detecteren. We hebben vastgesteld dat ruimtelijke proteomics-technologieën zeer profiteren van geautomatiseerde, gestandaardiseerde protocollen om ROI-selectie te begeleiden. Hoewel dit geautomatiseerde visualisatieprotocol niet compatibel was met ruimtelijke transcriptomics-assays, konden we testen en bevestigen dat specifieke celpopulaties met succes kunnen worden gedetecteerd, zelfs in kleine ROI's met het standaard handmatige visualisatieprotocol.

Inleiding

Vooruitgang in multiplexingtechnieken blijft betere karakteriseringsinstrumenten bieden voor doelen die aanwezig zijn in tumoren. De tumormicro-omgeving (TME) is een complex systeem van tumorcellen, infiltrerende immuuncellen en stroma, waarbij ruimtelijke informatie van cruciaal belang is om mechanismen van interactie tussen biomarkers van belang beter te begrijpen en te interpreteren1. Met opkomende technieken zoals de GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) en 10x Visium kunnen meerdere doelen tegelijkertijd worden gedetecteerd en gekwantificeerd binnen hun ruimtelijke context. Het gebruik van immunofluorescentieprotocollen die weefselvisualisatie vergemakkelijken, kan de ruimtelijke profileringsmogelijkheden van deze technologieën verder verbeteren.

De Spatial Omics-technologie waarop we ons voor deze methodeontwikkeling hebben gericht, bestaat uit ruimtelijke proteomics en transcriptomics-assays waarbij oligonucleotiden via een UV-gevoelige fotocleavable linker aan antilichamen of RNA-sondes worden bevestigd. Histologische dia's worden gelabeld met deze oligo-geconjugeerde antilichamen of sondes en vervolgens afgebeeld op het ruimtelijke profileringsplatform. Vervolgens worden ROIs van verschillende groottes en vormen geselecteerd voor verlichting en worden de fotocleaved oligonucleotiden geaspireerd en verzameld in een 96-well plaat. De fotocleaved oligonucleotiden worden bereid om te worden gekwantificeerd met het Nanostring nCounter-systeem of Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (Figuur 1)4,5.

Celverdelingen variëren binnen weefsels en het vermogen om specifieke locaties van cellen te karakteriseren met behulp van geselecteerde markers en verschillende ROI-groottes is van groot belang om de weefselomgeving volledig te begrijpen en specifieke kenmerken te identificeren. In de hier genoemde Spatial Omics-technologie maakt het standaard visualisatieprotocol gebruik van direct geconjugeerde antilichamen en is het een handmatig protocol. De standaardmarkers om onderscheid te maken tussen tumor en stroma zijn panCytokeratine (panCK) en CD45 6,7, maar aanvullende markers zijn nodig om specifieke celpopulaties van belang te targeten. Bovendien mist het gebruik van direct geconjugeerde fluorescerende antilichamen amplificatie, wat de selectie van antilichamen beperkt tot overvloedige markers. Bovendien zijn handmatige testen onderhevig aan meer variabiliteit dan geautomatiseerde workflows8. Daarom is het wenselijk om een aanpasbaar, geautomatiseerd en versterkt visualisatieprotocol te hebben voor ROI-selectie.

Hier toont de studie aan dat, voor ruimtelijke proteomics-assays, TSA-technologie kan worden gebruikt voor visualisatieprotocollen op een geautomatiseerd platform, wat resulteert in een meer gerichte en gestandaardiseerde test. Bovendien maken op TSA gebaseerde assays het gebruik van low-expressing markers mogelijk, waardoor het bereik van doelen die kunnen worden geselecteerd voor visualisatie wordt vergroot. Een 3-plex assay voor panCK, FAP en Antibody X werd ontwikkeld met behulp van een geautomatiseerd platform waar panCK en FAP werden gebruikt om onderscheid te maken tussen respectievelijk tumor en stroma. Antilichaam X is een stromaal eiwit dat vaak voorkomt in tumoren, maar de biologie en impact ervan op de immuniteit tegen tumoren zijn niet volledig begrepen. Het karakteriseren van de immuuncontextuur in gebieden die rijk zijn aan antilichaam X kan zijn rol in antitumorimuniteit en therapeutische respons ophelderen, evenals het potentieel als medicijndoelwit.

Hoewel aangepaste geautomatiseerde TSA-visualisatiepanelen succesvol bleken te zijn voor ruimtelijke proteomics-assays, kon de toepassing van deze assays voor ruimtelijke transcriptomics-assays niet worden bevestigd. Dit is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan de reagentia en het protocol dat wordt gebruikt voor de geautomatiseerde visualisatieprotocollen, die de RNA-integriteit in gevaar lijken te brengen. Erkennen dat een geautomatiseerd etiketteringsprotocol voor visualisatiemarkers kan worden gebruikt voor ruimtelijke proteomics-assays, maar niet voor ruimtelijke transcriptomics-assays, biedt belangrijke richtlijnen voor Spatial Omics-technologietestontwerpen.

Bovendien toont de studie aan dat de ruimtelijke transcriptomics-test kan worden gebruikt om doelen te profileren in regio's met een diameter van slechts 50 μm, of ongeveer 15 cellen. Twee ROIs van verschillende grootte werden geselecteerd om het vermogen van de test te testen om ook transcripties in kleine ROI's te detecteren. Voor elke interesseregio werden oligo's die overeenkomen met 1.800 mRNA-doelen verzameld en in bibliotheken gemaakt volgens het protocol van het spatial profiling platform. Bibliotheken werden individueel geïndexeerd, vervolgens gepoold en gesequenced. Dit maakte de evaluatie mogelijk van zowel de pooling-efficiëntie als het vermogen om specifieke celpopulaties in kleine ROI's te identificeren.

Dit artikel toont aan dat voor ruimtelijke proteomics-assays een geautomatiseerd protocol om ROI-selectie op specifieke markers van belang te begeleiden, kan worden gebruikt om selectief de ondervraging van relevante weefselgebieden te richten en de ruimtelijke omgeving van het weefsel te karakteriseren. Verder tonen we aan dat kleinere ROIs kunnen worden gebruikt voor ruimtelijke transcriptomische assays om specifieke celpopulaties te detecteren en te karakteriseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle menselijke weefsels werden verkregen van commerciële biobanken of geaccrediteerde weefselbanken onder garantie dat de juiste goedkeuring en geïnformeerde toestemming van de Institutional Review Board werden verkregen.

OPMERKING: Het protocol wordt uitgevoerd met behulp van de Discovery Ultra en de GeoMx Digital Spatial Profiler. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over reagentia, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.

1. Geautomatiseerd visualisatieprotocol voor ruimtelijke proteomics-assays

  1. Programma autostainer om fluorescerende visualisatie antilichamen toe te passen
    1. Klik in de autostainer software op de homeknop en kies Protocollen. Klik vervolgens op Protocollen maken /bewerken en selecteer RUO DISCOVERY Universal als de procedure.
    2. Klik op First Sequence > Deparaffinization > Depar v2. Kies voor Gemiddelde temperatuur 72 graden C, klik vervolgens op Voorbehandeling en selecteer Celconditionering en CC1 Reservoir. Kies voor Zeer hoge temperatuur 100 graden C, klik vervolgens op CC1 8 Min en klik verder totdat CC1 64 Min is geselecteerd.
    3. Klik op Inhibitor > DISCOVERY Inhibitor en kies voor Incubatietijd 8 Minuten. Klik vervolgens op Antibody > High Temp Ab Incubation; kies voor Lage temperatuur 37 ° C; kies voor Antilichaam het antilichaamnummer op het etiket van de dispenser (Antilichaam 6 in dit voorbeeld); selecteer voor Plus Incubatietijd 32 minuten.
      OPMERKING: Dit protocol heeft drie verschillende antilichaamnummers. Het eerste antilichaam is FAP, het tweede is Pan-Cytokeratine en het derde is Antilichaam X.
    4. Klik op Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, kies vervolgens voor Antibody Blocking gt Ig Block en kies voor Incubatietijd 4 Minuten. Selecteer vervolgens in Multimer HRP Reagentia OMap anti-Rb HRP en kies voor Incubatietijd 16 minuten. Klik vervolgens op Cy5 en kies voor Lange incubatietijd 0 uur 8 min.
    5. Klik op Dual Sequence en kies Antibody Denaturation, selecteer vervolgens Antibody Denature CC2-1 en kies voor Very High Temperature 100 Deg C. Zorg ervoor dat de incubatietijd 8 min is. Klik vervolgens op DS Inhibitor en selecteer Neutraliseren.
    6. Klik op DS Antibody en kies voor Very Low Temperature 37 Deg C. Kies vervolgens in Antilichaam het antilichaamnummer op het etiket van de dispenser (Antilichaam 3 in dit voorbeeld) en selecteer voor Plus Incubatietijd 32 minuten.
    7. Klik op DS Multimer HRP en kies DS Multimer HRP Blocker. Selecteer vervolgens voor Antilichaamblokkering de optie Gt Ig-blok en kies voor Incubatietijd 4 minuten. Selecteer vervolgens op Multimer HRP-reagens OMap anti-Ms HRP en kies voor Incubatietijd 16 minuten. Klik vervolgens op DS Rhodamine 6G en kies voor Lange incubatietijd 0 uur 8 min.
    8. Klik op Triple Stain en selecteer TS Antibody Denaturation, selecteer vervolgens Antibody Denature CC2-2 en selecteer voor Very High Temperature 100 Deg C. Zorg ervoor dat de incubatietijd 8 min is. Klik vervolgens op TS Inhibitor en selecteer TS Neutralize.
    9. Klik op TS-antilichaam en selecteer voor Zeer lage temperatuur 37 °C. Selecteer vervolgens in Antilichaam het antilichaamnummer op het etiket van de dispenser (Antilichaam 7 in dit voorbeeld) en selecteer voor Plus Incubatietijd 32 minuten.
    10. Klik op TS Multimer HRP en kies TS Multimer HRP Blocker. Selecteer vervolgens voor Antilichaamblokkering de optie Gt Ig-blok en kies voor Incubatietijd 4 minuten. Selecteer vervolgens in Multimer HRP Reagentia OMap anti-Rb HRP en kies voor Incubatietijd 16 minuten. Klik vervolgens op TS FAM en kies voor Lange incubatietijd 0 uur 8 min.
    11. Voeg een titel toe aan het protocol. Selecteer een protocolnummer, voeg een opmerking toe en klik op Actief gevolgd door Opslaan.
  2. Dia's voorbereiden, etiketten afdrukken en de autostainerrun starten
    1. Bakverkoper kocht FFPE (Formaline-fixed, paraffine-embedded) menselijke weefselsecties in een oven op 70 °C gedurende 20-60 min. Terwijl dia's worden gebakken, drukt u etiketten af door te klikken op Label maken in de autostainer-software. Klik vervolgens op Protocollen, selecteer het protocolnummer en klik op Sluiten/Afdrukken. Voeg relevante informatie toe aan het dialabel en klik op Afdrukken.
    2. Haal dia's uit de oven en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur (RT). Pas de eerder afgedrukte protocollabels toe op de bijbehorende dia's.
    3. Laad navulbare antilichaamdispensers met antilichamen volgens het antilichaamlabelnummer dat in stap 1.1 is toegewezen. Gebruik in dit protocol antilichaam 6 voor FAP bij 1 μg/ml, gebruik antilichaam 3 voor pancytokeratine bij 0,1 μg/ml en gebruik antilichaam 7 voor antilichaam X bij 2,5 μg/ml. Verdun elk antilichaam in het opgegeven verdunningsmiddel en primeer de navulbare antilichaamdispensers.
    4. Verzamel de hierboven genoemde voorgevulde reagensdispensers voor blokkering, detectie en versterking en plaats ze op een reagenslade. Laad dia's in de dialades (tot 30 dia's per run) en klik op Running gevolgd door Yes. Merk op dat DAPI niet wordt gebruikt voor nucleaire counterstaining.
    5. Bevestig het begin van de run door de looptijd van de autostainer-software te controleren. Het protocol duurt ~ 11 uur voor voltooiing en kan 's nachts worden uitgevoerd.
    6. Zorg er de volgende dag voor dat de run wordt voltooid door groene knipperende lampjes op de schuifladesleuven te observeren. Haal vervolgens de dia's van het instrument en spoel de dia's krachtig af in 1x reactiebuffer totdat de vloeibare coverslipoplossing volledig is verwijderd.
  3. Ruimtelijk profileringsplatformprotocol voor proteomics-assay
    1. Volg het ruimtelijke proteomics-protocol dat in de onderstaande notitie wordt aangegeven. Neem de volgende wijzigingen in het protocol op om de geautomatiseerde labelingprocedure met 3 plexen in te schakelen.
    2. Voer stap 1.2.1-1.2.6 uit de dag voordat u het ruimtelijke proteomics-protocol start en ga direct naar de antigeen ophaalstap van het ruimtelijke proteomics-protocol na het uitvoeren van stap 1.2.6. Laat de visualisatieprocedure weg die wordt beschreven in het proteomics-protocol voor ruimtelijke profilering.
    3. Vervang SYTO 13 door SYTO 64 bij 5000 nM om fluorofoorintegratie mogelijk te maken. Verdun SYTO 64 in 1x TBS en incubeer gedurende 15 minuten in een vochtigheidskamer.
    4. Selecteer bij het instellen van de scanparameters in het ruimtelijke profileringsplatform de filters en scherpstelkanalen op basis van de fluoroforen die in het visualisatiepaneel worden gebruikt om 3-plex-integratie mogelijk te maken. Gebruik FITC voor DISCOVERY FAM en stel de blootstelling in op 200 ms, gebruik Cy3 voor DISCOVERY Rhodamine 6G en stel de blootstelling in op 200 ms, gebruik Texas Red voor SYTO 64 en stel de blootstelling in op 50 ms (specificeer dit als het focuskanaal) en gebruik ten slotte Cy5 voor DISCOVERY Cy5, stel de blootstelling in op 200 ms, en sla wijzigingen op.
      OPMERKING: Gedetailleerde instructies van het proteomics-protocol voor ruimtelijke profilering zijn te vinden op het tabblad Ondersteuning van de officiële website door Documentatie > gebruikershandleidingen te selecteren. Zoek hier naar het eiwitprotocol voor nCounter met Bond RX.

2. ROI-selectie voor ruimtelijke transcriptomics-assays

  1. Bak FFPE cel pellet secties in een oven ingesteld op 70 °C gedurende 20-60 min. Volg het NGS-protocol van het ruimtelijke profileringsplatform dat in de onderstaande notitie wordt aangegeven en scan dia's op het ruimtelijke profileringsplatform, waarbij maten van 50 μm en 300 μm worden geselecteerd. De volgende aanbeveling wordt benadrukt voor de ruimtelijke transcriptomics-test:
    1. Als bij het voorbereiden van de bibliotheek verschillende formaten ROI's zijn geselecteerd, verzamelt u ROIs van vergelijkbare grootte om één bibliotheek per grootte te maken. Dit is om ervoor te zorgen dat voldoende sequencingdieptes worden bereikt voor alle ROI's zonder vertekening van de grootte.
      OPMERKING: Gedetailleerde instructies van het ruimtelijke profileringsplatform zijn te vinden op het officiële tabblad Ondersteuning van de website door Documentatie > gebruikershandleidingen te selecteren. Zoek hier naar het RNA-protocol voor NGS-toepassingen met Bond RX.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Geautomatiseerd visualisatieprotocol om ROI-selectie te begeleiden
In dit artikel presenteren we het gebruik van een geautomatiseerd, aangepast TSA-gebaseerd IF-protocol om het weefsel te visualiseren en specifieke ROI's te selecteren. De ontwikkeling van visualisatiepanels met behulp van melanoom en de menselijke normale huid als controleweefsels bestond uit epitoopstabiliteitstests, fijnafstemming van markerintensiteiten en bleedthrough-beoordeling door één uit controles weg te laten. Om te testen o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Tot op heden worden direct geconjugeerde fluorescerende antilichamen in een handmatig protocol het meest gebruikt als visualisatiepanelen voor ruimtelijke proteomics of ruimtelijke transcriptomics-assays 9,10. Het gebruik van direct geconjugeerde fluorescerende antilichamen kan echter een uitdaging zijn voor minder overvloedige markers, waardoor de selectie van geschikte antilichamen wordt beperkt. Dit protocol laat zien dat het labelen van visualisatiemarkers ka...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan en Sandra Rost zijn werknemers en aandeelhouders van Genentech, een lid van de Roche Group. Andere bedrijven die deel uitmaken van Roche produceren reagentia en instrumenten die in dit manuscript worden gebruikt. Ciara Martin is een fulltime medewerker van NanoString Technologies Inc, dat reagentia en instrumenten produceert die in dit manuscript worden gebruikt.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen Thomas Wu voor het verwerken van NGS-bestanden. We bedanken James Ziai voor de resultatendiscussies en manuscriptbeoordeling en Meredith Triplet en Rachel Taylor voor interne manuscriptrevisie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10x Tris buffered saline (TBS)Cell Signaling Technologies12498SVerdund tot 1x TBS in DEPC behandeld water
Antibody X (niet bekend gemaakt)antilichaam verduisterd vanwege vertrouwelijkheid
DEPC-behandeld waterThermoFisherAM9922Een ander kan worden gebruikt
DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1)Ventana950-500
DISCOVERY Cy5 KitVentana760-238Aangeduid als Cy5
DISCOVERY FAM KitVentana760-243Aangeduid als FAM
DISCOVERY Goat Ig BlockVentana760-6008Aangeduid als Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRPVentana760-4310Aangeduid als OMap anti-Ms HRP
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRPVentana760-4311Aangeduid als OMap anti-Rb HRP
DISCOVERY Rhodamine 6G KitVentana760-244Aangeduid als Rhodamine 6G
DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation SystemVentana05 987 750 001 / N750-DISU-FSAangeduid als autostainer in het manuscript
FAP [EPR20021] AntibodyAbcamAb207178
GeoMx Digital Spatial ProfilerNanoStringGMX-DSP-1YAangeduid als ruimtelijk profileringsplatform in het manuscript
VochtontvochtenderSimportM920-2Een ander kan worden gebruikt
Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] AntibodyAbcamAb27988
ProLong Gold Antifade MountantThermoFisherP36934
PythonPythonStatistische analyse
Reaction Buffer (10x)Ventana950-300
Statistische analysesoftwareGraphPadPrism 7Statistische analyse
SYTO 64ThermoFisherS11346
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Ventana950-223
Ventana Antibody Diluent met CaseïneVentana760-219Aangeduid als gespecificeerde verdunning in het manuscript
Ventana Primary antibody dispenserVentanaCatalogusnummer is afhankelijk van het dispensernummer

Referenties

  1. Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572(2020).
  2. Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
  3. McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
  4. NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022).
  5. NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022).
  6. McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
  7. McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
  8. Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
  9. Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783(2020).
  10. Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
  11. Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
  12. Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
  13. Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448(2020).
  14. Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
  15. Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
  16. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  17. Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
  18. Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020).
  19. Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456(2021).
  20. Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
  21. Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Spatiale omicsspatiale proteomicaspatiale transcriptomicaregio van interessemultiplex immunofluorescentietyramide signaalversterkinggeautomatiseerd visualisatieprotocoleiwitexpressieprofileringRNA expressieprofileringformaline gefixeerd paraffin ingebed

Gerelateerde artikelen