Methodenartikel

Ruimtelijke profilering van eiwit- en RNA-expressie in weefsel: een benadering om virtuele microdissectie te verfijnen

DOI:

10.3791/62651

⸱

6 juli 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Genentech, 2Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, 3NanoString Technologies

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een protocol voor het verfijnen van interessante regio's (ROI's) voor Spatial Omics-technologieën om de micro-omgeving van de tumor beter te karakteriseren en specifieke celpopulaties te identificeren. Voor proteomics-assays kunnen geautomatiseerde aangepaste protocollen de ROI-selectie begeleiden, terwijl transcriptomics-assays kunnen worden verfijnd met behulp van ROI's zo klein als 50 μm.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multiplexing maakt de beoordeling van verschillende markers op hetzelfde weefsel mogelijk en biedt tegelijkertijd ruimtelijke context. Spatial Omics-technologieën maken zowel eiwit- als RNA-multiplexing mogelijk door gebruik te maken van respectievelijk foto-splijtbare oligo-gelabelde antilichamen en sondes. Oligo's worden gesplitst en gekwantificeerd van specifieke regio's in het weefsel om de onderliggende biologie op te helderen. Hier toont de studie aan dat geautomatiseerde aangepaste antilichaamvisualisatieprotocollen kunnen worden gebruikt om ROI-selectie te begeleiden in combinatie met ruimtelijke proteomics-assays. Deze specifieke methode vertoonde geen acceptabele prestaties met ruimtelijke transcriptomics-assays. Het protocol beschrijft de ontwikkeling van een 3-plex immunofluorescent (IF) assay voor markervisualisatie op een geautomatiseerd platform, met behulp van tyramide signaalversterking (TSA) om het fluorescerende signaal van een bepaald eiwitdoel te versterken en de antilichaampool te vergroten om uit te kiezen. Het visualisatieprotocol werd geautomatiseerd met behulp van een grondig gevalideerde 3-plex-test om kwaliteit en reproduceerbaarheid te garanderen. Daarnaast werd de uitwisseling van DAPI voor SYTO-kleurstoffen geëvalueerd om beeldvorming van TSA-gebaseerde IF-assays op het ruimtelijke profileringsplatform mogelijk te maken. Daarnaast hebben we het vermogen getest om kleine ROI's te selecteren met behulp van de ruimtelijke transcriptomics-test om het onderzoek van zeer specifieke interessegebieden mogelijk te maken (bijvoorbeeld gebieden die zijn verrijkt voor een bepaald celtype). ROIs van 50 μm en 300 μm diameter werden verzameld, wat overeenkomt met respectievelijk ongeveer 15 cellen en 100 cellen. Monsters werden gemaakt in bibliotheken en gesequenced om het vermogen te onderzoeken om signalen van kleine ROI's en profielspecifieke gebieden van het weefsel te detecteren. We hebben vastgesteld dat ruimtelijke proteomics-technologieën zeer profiteren van geautomatiseerde, gestandaardiseerde protocollen om ROI-selectie te begeleiden. Hoewel dit geautomatiseerde visualisatieprotocol niet compatibel was met ruimtelijke transcriptomics-assays, konden we testen en bevestigen dat specifieke celpopulaties met succes kunnen worden gedetecteerd, zelfs in kleine ROI's met het standaard handmatige visualisatieprotocol.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vooruitgang in multiplexingtechnieken blijft betere karakteriseringsinstrumenten bieden voor doelen die aanwezig zijn in tumoren. De tumormicro-omgeving (TME) is een complex systeem van tumorcellen, infiltrerende immuuncellen en stroma, waarbij ruimtelijke informatie van cruciaal belang is om mechanismen van interactie tussen biomarkers van belang beter te begrijpen en te interpreteren1. Met opkomende technieken zoals de GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) en 10x Visium kunnen meerdere doelen tegelijkertijd worden gedetecteerd en gekwantificeerd binnen hun ruimtelijke context. Het gebruik van immunofluorescentieprotocollen die weefselvisualisa....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle menselijke weefsels werden verkregen van commerciële biobanken of geaccrediteerde weefselbanken onder garantie dat de juiste goedkeuring en geïnformeerde toestemming van de Institutional Review Board werden verkregen.

OPMERKING: Het protocol wordt uitgevoerd met behulp van de Discovery Ultra en de GeoMx Digital Spatial Profiler. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over reagentia, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.

1. Geautomatiseerd visualisatieprotocol voor ruimtelijke proteomics-assays

  1. Programma autostainer om fluorescerende ....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geautomatiseerd visualisatieprotocol om ROI-selectie te begeleiden
In dit artikel presenteren we het gebruik van een geautomatiseerd, aangepast TSA-gebaseerd IF-protocol om het weefsel te visualiseren en specifieke ROI's te selecteren. De ontwikkeling van visualisatiepanels met behulp van melanoom en de menselijke normale huid als controleweefsels bestond uit epitoopstabiliteitstests, fijnafstemming van markerintensiteiten en bleedthrough-beoordeling door één uit controles weg te laten. Om te testen o.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tot op heden worden direct geconjugeerde fluorescerende antilichamen in een handmatig protocol het meest gebruikt als visualisatiepanelen voor ruimtelijke proteomics of ruimtelijke transcriptomics-assays 9,10. Het gebruik van direct geconjugeerde fluorescerende antilichamen kan echter een uitdaging zijn voor minder overvloedige markers, waardoor de selectie van geschikte antilichamen wordt beperkt. Dit protocol laat zien dat het labelen van visualisatiemarkers ka.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan en Sandra Rost zijn werknemers en aandeelhouders van Genentech, een lid van de Roche Group. Andere bedrijven die deel uitmaken van Roche produceren reagentia en instrumenten die in dit manuscript worden gebruikt. Ciara Martin is een fulltime medewerker van NanoString Technologies Inc, dat reagentia en instrumenten produceert die in dit manuscript worden gebruikt.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen Thomas Wu voor het verwerken van NGS-bestanden. We bedanken James Ziai voor de resultatendiscussies en manuscriptbeoordeling en Meredith Triplet en Rachel Taylor voor interne manuscriptrevisie.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10x Tris buffered saline (TBS)Cell Signaling Technologies12498SVerdund tot 1x TBS in DEPC behandeld water
Antibody X (niet bekend gemaakt)antilichaam verduisterd vanwege vertrouwelijkheid
DEPC-behandeld waterThermoFisherAM9922Een ander kan worden gebruikt
DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1)Ventana950-500
DISCOVERY Cy5 KitVentana760-238Aangeduid als Cy5
DISCOVERY FAM KitVentana760-243Aangeduid als FAM
DISCOVERY Goat Ig BlockVentana760-6008Aangeduid als Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRPVentana760-4310Aangeduid als OMap anti-Ms HRP
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRPVentana760-4311Aangeduid als OMap anti-Rb HRP
DISCOVERY Rhodamine 6G KitVentana760-244Aangeduid als Rhodamine 6G
DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation SystemVentana05 987 750 001 / N750-DISU-FSAangeduid als autostainer in het manuscript
FAP [EPR20021] AntibodyAbcamAb207178
GeoMx Digital Spatial ProfilerNanoStringGMX-DSP-1YAangeduid als ruimtelijk profileringsplatform in het manuscript
VochtontvochtenderSimportM920-2Een ander kan worden gebruikt
Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] AntibodyAbcamAb27988
ProLong Gold Antifade MountantThermoFisherP36934
PythonPythonStatistische analyse
Reaction Buffer (10x)Ventana950-300
Statistische analysesoftwareGraphPadPrism 7Statistische analyse
SYTO 64ThermoFisherS11346
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Ventana950-223
Ventana Antibody Diluent met CaseïneVentana760-219Aangeduid als gespecificeerde verdunning in het manuscript
Ventana Primary antibody dispenserVentanaCatalogusnummer is afhankelijk van het dispensernummer

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572(2020).
  2. Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Spatiale omicsspatiale proteomicaspatiale transcriptomicaregio van interessemultiplex immunofluorescentietyramide signaalversterkinggeautomatiseerd visualisatieprotocoleiwitexpressieprofileringRNA expressieprofileringformaline gefixeerd paraffin ingebed

Gerelateerde artikelen