Een niet-invasieve methode voor het genereren van het cyclische belastingsgeïnduceerde intra-articulaire kraakbeenlaesiemodel van de rattenknie

Summary

Hier presenteren we het cyclische belasting-geïnduceerde intra-articulaire kraakbeenlaesiemodel van de rattenknie, gegenereerd door 60 cyclische compressies over 20 N, resulterend in schade aan het femorale condylaire kraakbeen bij ratten.

Abstract

De pathofysiologie van primaire artrose (OA) blijft onduidelijk. Een specifieke subclassificatie van artrose in relatief jongere leeftijdsgroepen is echter waarschijnlijk gecorreleerd met een geschiedenis van gewrichtskraakbeenschade en ligamentavulsie. Chirurgische diermodellen van artrose van de knie spelen een belangrijke rol bij het begrijpen van het begin en de progressie van posttraumatische artrose en helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor deze ziekte. Niet-chirurgische modellen zijn echter onlangs overwogen om traumatische ontstekingen te voorkomen die de evaluatie van de interventie kunnen beïnvloeden.

In deze studie werd een intra-articulaire kraakbeenlaesie ratmodel geïnduceerd door in vivo cyclische drukbelasting ontwikkeld, waardoor onderzoekers (1) de optimale grootte, snelheid en duur van de belasting konden bepalen die focale kraakbeenschade zou kunnen veroorzaken; (2) posttraumatische spatiotemporale pathologische veranderingen in chondrocytenvitaliteit te beoordelen; en (3) de histologische expressie evalueren van destructieve of beschermende moleculen die betrokken zijn bij de aanpassings- en reparatiemechanismen tegen gewrichtsdrukbelastingen. Dit rapport beschrijft het experimentele protocol voor deze nieuwe kraakbeenlaesie in een rattenmodel.

Introduction

Traditioneel wordt anterieure kruisband (ACL) transsectie of destabilisatie van de mediale meniscus als optimaal beschouwd voor het onderzoeken van posttraumatische artrose (PTOA) bij kleine dieren. In de afgelopen jaren zijn niet-invasieve cyclische compressiemodellen gebruikt om PTOA te bestuderen. Dit model was oorspronkelijk ontworpen om de cancellous botrespons op mechanische belasting¹ te onderzoeken en werd vervolgens aangepast als een niet-chirurgisch diermodel voor PTOA-studies 2,3,4,5,6. De reden is om het gewrichtskraakbeen te laten botsen door een periodieke externe kracht toe te passen, die een reeks ontstekingsreacties veroorzaakt. Dit model is echter alleen toegepast op muizen en de juiste omvang van de belasting op grotere dieren is niet besproken.

Een ander probleem met het vorige model is dat het protocol met een hoog volume te veel cycli omvatte, wat overmatige verdikking van het subchondrale bot veroorzaakte, een ongewenste bijwerking, in verschillende monsters⁷. Daarom werd een nieuwe methode van cyclische compressie ontwikkeld met de juiste magnitude voor grote dieren en een bijwerking met een lagere belasting⁸. Het algemene doel van het huidige artikel is om het protocol van het niet-invasieve cyclische compressiemodel bij ratten te beschrijven en de representatieve resultaten van kraakbeendegeneratie te observeren. Het huidige protocol zou lezers helpen die geïnteresseerd zijn in de toepassing van het niet-invasieve cyclische compressiemodel op ratten.

Protocol

Het protocol werd goedgekeurd door de Animal Research Committee van de Universiteit van Kyoto (goedkeuringsnummer: Med kyo 17616).

1. Voer in vivo cyclische compressie uit op de rattenknie

1. Anesthesie bij proefdieren induceren
   1. Anesthesie induceren bij een 12 weken oude Wistar-rat (256,8 ± 8,7 g) door inhalatie van 5% isofluraanoplossing in de anesthesiebox.
   2. Intraperitoneaal injecteren van een mengsel van drie anesthetica⁹, waaronder medetomidine, midazolam en butorfanol, bij 2 mg/kg van het lichaamsgewicht van de rat en scheer het gebied rond het rechter kniegewricht. Bevestig voldoende verdoving door gebrek aan pedaalreflex tot een teenknijper.
2. Monteer de verdoofde rat op het fixatieapparaat.
   1. Plaats de verdoofde rat liggend op zijn buik op de bodemplaat (figuur 1), met de rechterknie bevestigd aan een klein stukje hars met een holle groef. Plaats de rechter achterpoot in de heupverlenging, knieflexie en enkelverlengingsposities, met de knie gebogen op ongeveer 140 °. Plaats de hiel van de rat op de wigvormige groef op het beweegbare armatuur.
   2. Verplaats de fixatie-inrichting naar het spannings-/trektestinstrument (zie de materiaaltabel). Nadat u er zeker van bent dat er geen contacten zijn met de loadcel, opent u de besturingssoftware voor het testen van het spannings-/trekbeproevingsinstrument (Materiaaltabel) en klikt u op de knop Kalibratie . Bevestig na kalibratie de bovenkant van het frame voorzichtig aan de loadcel. Om het kniegewricht nauw aan het frame te houden, draait u de draaiknop op het beweegbare operationele hoofdpaneel langzaam in totdat de voorbelasting 5 N bereikt.
3. Bouw een laadmethode en stel de druktest in.
   1. Klik in het hoofdmenu op Een nieuwe methode maken | Systeemlabel . Stel testmodus in op Cyclus en Testtype op Compressie. Klik op het sensorlabel en selecteer het tabblad Test om te controleren of de limiet binnen 60 N ligt. Selecteer daarnaast het tabblad Lijn en controleer of de limiet binnen 500 mm ligt.
      OPMERKING: De bovenstaande stap stopt de bewerking onmiddellijk als er een grote verplaatsing op het spanningspunt is.
   2. Selecteer onder het label Testcontrole de optie Oorsprong van groei om het hoofdprogramma te starten met 0,3%/volledige schaal. Van de vier secties in een laadcyclus stelt u de slagsnelheid in controle in de^1e en^3e secties in op 1 mm / s. Stel de maximale testkracht in de^2e sectie in op 20 N en de minimale testkracht in de^4e sectie op 5 N. Stel "de duur van de wacht" in op 0,5 s voor de piekbelasting en 10 s voor de minimale belasting (figuur 2).
      OPMERKING: Aangezien deze stap elke cyclus definieert, moet u ervoor zorgen dat de gewrichtsoppervlakken met elkaar in contact staan en met een redelijke snelheid bewegen en dat de beweging wordt gehandhaafd.
   3. Controleer op het tabblad Vooraf laden onder aan de pagina of Aan is aangevinkt, de snelheid van doorbuiging is ingesteld op 100 mm/min en de maximale kracht is 5 N. Stel in het label Specimen het materiaal in als metaal.
      OPMERKING: Deze gedetailleerde instellingen kunnen specifiek zijn voor elke fabrikant.
   4. Selecteer in het hoofdmenu onder het gedeelte Methode en test selecteren de methode die zojuist is gebouwd en klik op Start om de test te starten.
      OPMERKING: De tabel onderaan toont de werkelijke metingen van de piekbelasting en verplaatsing.
   5. Stel het aantal cycli in op 60.
      OPMERKING: De hele laadsessie omvat 60 cycli, die ongeveer 12 minuten duurt. In de controlegroep ondergingen ratten 5 N voorbelasting gedurende 12 minuten voorbelasting onder dezelfde omstandigheden.
4. Breng na het laden de rat terug naar zijn kooi en controleer tot volledig herstel. Houd een licht-donker schema van 12-12 uur aan in de kooi met voldoende ruimte en voedsel ad libitum. Na de vereiste experimentele perioden offert u de ratten op met een overdosis van het mengsel van de drie anesthetica die intraperitoneaal of koolstofdioxide-inhalatie zijn geïnjecteerd voor analyse (1 h-8 weken).

Results

Een representatief resultaat van de kortetermijnveranderingen (1 h en 12 h) in de levensvatbaarheid van chondrocyten in monsters die werden onderworpen aan 20 N cyclische belasting werd verkregen. Zoals te zien is in figuur 3, nam het aantal dode chondrocyten (rode fluorescentie) toe na 12 uur na het trauma. Omgekeerd bleef het aantal levende chondrocyten (groene fluorescentie) afnemen, waarbij sommige monsters geen levende chondrocyten in het getroffen gebied bevatten.

Discussion

Voor het eerst laat het huidige protocol zien hoe een model van door belasting geïnduceerde kraakbeenlaesie op de laterale femorale condylus bij ratten kan worden vastgesteld, vergelijkbaar met het intra-articulaire schademodel bij kleinere knaagdieren zoals de muis². Het belastingsprotocol bij muizen veroorzaakte echter ernstige osteofytvorming en kruisbandlaesies, wat niet ideaal was voor het evalueren van de effecten van cyclische compressie. Het huidige protocol creëerde een focale kraakbeenla...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic Apparatus voor Kleine Dieren	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
Autograph AG-X	Shimadzu Corp	N.A.	Precisie Universele / Trektester
Fluoview FV10i microscoop	Olympus Corp	N.A.	Een volledig geautomatiseerde confocale laser-scanning microscoop
ISOFLURANE Inhalatieoplossing	Pfizer Japan Inc.	(01)14987114133400
LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher Scientific Japan Inc	L3224	Een snelle en eenvoudige tweekleurige test om de levensvatbaarheid van cellen te bepalen
TRAPEZIUM X Software	Shimadzu Corp	N.A.	Dataverwerkingssoftware voor Autograph AG-X