Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62671

⸱

21 juni 2021

 ,  ,  , 
1Integrative Omics, Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2Bioproducts Sciences and Engineering Laboratory, Department of Biological Systems Engineering, Washington State University

In dit artikel

Samenvatting

Eiwitthioloxidatie heeft significante implicaties onder normale fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. We beschrijven de details van een kwantitatieve redox proteomics-methode, die gebruik maakt van harsondersteunde vangst, isobare etikettering en massaspectrometrie, waardoor locatiespecifieke identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen van eiwitten mogelijk wordt.

Samenvatting

Reversibele oxidatieve modificaties op eiwitthiolen zijn onlangs naar voren gekomen als belangrijke mediatoren van cellulaire functie. Hierin beschrijven we de gedetailleerde procedure van een kwantitatieve redox proteomics-methode die gebruik maakt van resin-assisted capture (RAC) in combinatie met tandem mass tag (TMT) isobare etikettering en vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) om multiplexed stochiometrische kwantificering van geoxideerde eiwitthiolen op proteoomniveau mogelijk te maken. De site-specifieke kwantitatieve informatie over geoxideerde cysteïneresiduen biedt extra inzicht in de functionele effecten van dergelijke modificaties.

De workflow is aanpasbaar voor vele soorten monsters, waaronder gekweekte cellen (bijv. Zoogdier, prokaryote) en hele weefsels (bijv. Hart, long, spier), die aanvankelijk worden gelyseerd / gehomogeniseerd en waarbij vrije thiolen worden gealkyleerd om kunstmatige oxidatie te voorkomen. De geoxideerde eiwitthiolen worden vervolgens gereduceerd en gevangen door een thiolaffiniteitshars, die de workflowstappen stroomlijnt en vereenvoudigt door de lopende verterings-, etiketterings- en wasprocedures uit te voeren zonder extra overdracht van eiwitten / peptiden. Ten slotte worden de gelabelde peptiden geëlueerd en geanalyseerd door LC-MS / MS om uitgebreide stoichiometrische veranderingen te onthullen die verband houden met thioloxidatie in het hele proteoom. Deze methode verbetert het begrip van de rol van redox-afhankelijke regulatie onder fysiologische en pathofysiologische toestanden gerelateerd aan eiwitthioloxidatie aanzienlijk.

Inleiding

Onder homeostatische omstandigheden genereren cellen reactieve zuurstof-, stikstof- of zwavelsoorten die helpen om processen te vergemakkelijken, zoals metabolisme en signalering 1,2,3, die zich uitstrekken tot zowel prokaryoten als eukaryoten. Fysiologische niveaus van deze reactieve soorten zijn noodzakelijk voor een goede cellulaire functie, ook bekend als 'eustress'1,4. Daarentegen kan een toename van oxidanten die leidt tot een onbalans tussen oxidanten en antioxidanten oxidatieve stress of 'distress'1 veroorzaken, wat leidt tot cellulaire schade. Oxidanten transduceren signalen naar biologische routes door verschillende biomoleculen te modificeren, waaronder eiwitten, DNA, RNA en lipiden. In het bijzonder zijn cysteïneresiduen van eiwitten zeer reactieve plaatsen die vatbaar zijn voor oxidatie als gevolg van de thiolgroep op cysteïne, die reactief is op verschillende soorten oxidanten5. Dit geeft aanleiding tot een breed scala aan reversibele redox-gebaseerde posttranslationele modificaties (PTM's) voor cysteïne, waaronder nitrosylatie (SNO), glutathionylering (SSG), sulfenylering (SOH), persulfidatie (SSH), polysulfidatie (SSnH), acylering en disulfiden. Onomkeerbare vormen van cysteïne-oxidatie omvatten sulfinylering (SO2H) en sulfonylering (SO3H).

Omkeerbare oxidatieve modificaties van cysteïneresiduen kunnen beschermende rollen vervullen om verdere onomkeerbare oxidatie te voorkomen of dienen als signaalmoleculen voor stroomafwaartse cellulaire routes 6,7. De omkeerbaarheid van sommige thiol redox PTM's zorgt ervoor dat cysteïneplaatsen kunnen functioneren als "redoxschakelaars"8,9, waarbij veranderingen in de redoxtoestand van deze sites de eiwitfunctie veranderen om hun rol in voorbijgaande processen te reguleren. De modulerende effecten van redox PTM's10 zijn waargenomen in vele aspecten van eiwitfunctie11, waaronder katalyse12, eiwit-eiwitinteracties13, conformatieverandering14, metaalionencoördinatie15 of farmacologische inhibitorbinding16. Bovendien zijn redox PTM's betrokken bij cysteïneplaatsen van eiwitten die routes reguleren zoals transcriptie17, translatie18 of metabolisme19. Gezien de impact die redox PTM's hebben op de eiwitfunctie en biologische processen, is het belangrijk om de mate van oxidatie te kwantificeren die een cysteïneplaats ondergaat als reactie op een verstoring van de redoxtoestand.

De identificatie van cysteïneplaatsen met veranderde redoxtoestanden is gericht op de vergelijking van de oxidatietoestand op het locatiespecifieke niveau tussen normale en verstoorde omstandigheden. Vouwveranderingsmetingen worden vaak gebruikt om te bepalen welke sites aanzienlijk zijn gewijzigd, omdat dit gebruikers helpt te interpreteren welke cysteïnesites fysiologisch significant kunnen zijn voor het onderzoek. Als alternatief geven stoichiometrische metingen van omkeerbare thioloxidatie over een specifiek monstertype een algemeen beeld van de fysiologische toestand met betrekking tot cellulaire oxidatie, een belangrijke meting die vaak over het hoofd wordt gezien en onderbenut. Modificatie stoichiometrie is gebaseerd op het kwantificeren van het percentage gemodificeerde thiol als verhouding tot totaal eiwit thiol (gemodificeerd en ongewijzigd)20,21. Als gevolg hiervan bieden stoichiometrische metingen een nauwkeurigere meting dan vouwverandering, vooral bij gebruik van massaspectrometrie. De betekenis van de toename van oxidatie kan gemakkelijker worden vastgesteld door stoichiometrie te gebruiken om de PTM-bezetting van een bepaalde cysteïneplaats te bepalen. Een 3-voudige toename van thioloxidatie kan bijvoorbeeld het gevolg zijn van een overgang van slechts 1% naar 3% of zo groot als 30% tot 90%. Een 3-voudige toename van oxidatie voor een site die slechts 1% bezetting heeft, kan weinig invloed hebben op de functie van een eiwit; een 3-voudige toename voor een site met 30% bezetting in rusttoestand kan echter meer substantieel worden beïnvloed. Stoichiometrische metingen, wanneer uitgevoerd tussen totaal geoxideerde thiolen en specifieke oxidatieve modificaties, waaronder eiwitgluutathionylering (SSG) en nitrosylering (SNO), kunnen verhoudingen en kwantitatieve informatie onthullen met betrekking tot specifieke modificatietypen.

Omdat reversibele thioloxidatie typisch een posttranslationele modificatie met een lage abundantie is, zijn er meerdere benaderingen ontwikkeld voor de verrijking van eiwitten die deze modificaties bevatten uit biologische monsters. Een vroege aanpak bedacht door Jaffrey en anderen, genaamd de biotine switch techniek (BST)22, omvat meerdere stappen waarbij ongewijzigde thiolen worden geblokkeerd door alkylering, reversibel gemodificeerde thiolen worden gereduceerd tot ontluikende vrije thiolen, ontluikende vrije thiolen worden gelabeld met biotine en de gelabelde eiwitten worden verrijkt door streptavidin affiniteit pulldown. Deze techniek is in veel studies gebruikt om SNO en SSG te profileren en kan worden aangepast om te onderzoeken op andere vormen van reversibele thioloxidatie23,24. Hoewel BST is gebruikt om te onderzoeken op verschillende vormen van omkeerbare thioloxidatie, is een zorg bij deze aanpak dat verrijking wordt beïnvloed door de niet-specifieke binding van niet-geïnbiotinyleerde eiwitten aan streptavidin. Een alternatieve aanpak die in ons laboratorium is ontwikkeld, genaamd resin-assisted capture (RAC)25,26 (figuur 1), omzeilt de kwestie van verrijking van thiolgroepen via het biotine-streptavidin-systeem.

Na de reductie van reversibel geoxideerde thiolen, worden eiwitten met ontluikende vrije thiolen verrijkt met de thiolaffiniteitshars, die covalent vrije thiolgroepen vangt, waardoor meer specifieke verrijking van cysteïnebevattende eiwitten mogelijk is dan BST. Het koppelen van RAC aan de multiplexingkracht van de recente vooruitgang in isobare etikettering en massaspectrometrie creëert een robuuste en gevoelige workflow voor de verrijking, identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen op proteoombreed niveau. Recente ontwikkelingen in massaspectrometrie hebben een veel diepere profilering van het thiol redoxproteoom mogelijk gemaakt, waardoor het begrip van zowel de oorzaak als het gevolg van eiwitthioloxidatieis toegenomen 27. De informatie die wordt verkregen uit locatiespecifieke kwantitatieve gegevens maakt verdere studies mogelijk van de mechanistische effecten en downstream-effecten van omkeerbare oxidatieve modificaties28. Het gebruik van deze workflow heeft inzicht gegeven in de fysiologische effecten van omkeerbare cysteïne-oxidatie met betrekking tot normale fysiologische gebeurtenissen zoals veroudering, waarbij de niveaus van SSG verschilden met betrekking tot leeftijd. De verouderingseffecten op SSG werden gedeeltelijk omgekeerd met behulp van SS-31 (elamipretide), een nieuw peptide dat de mitochondriale functie verbetert en de SSG-niveaus bij oudere muizen verlaagt, waardoor ze een SSG-profiel hebben dat meer lijkt op jonge muizen29.

Van pathofysiologische aandoeningen die worden toegeschreven aan blootstelling aan nanodeeltjes is aangetoond dat SSG betrokken is bij een macrofaagmodel van muizen. Met behulp van RAC in combinatie met massaspectrometrie toonden de auteurs aan dat SSG-niveaus direct gecorreleerd waren met de mate van oxidatieve stress en aantasting van de macrofaagfagocytische functie. De gegevens onthulden ook pathway-specifieke verschillen in reactie op verschillende gemanipuleerde nanomaterialen die verschillende graden van oxidatieve stress induceren30. De methode heeft ook zijn nut bewezen bij prokaryote soorten, waar het werd toegepast om de effecten van dagcyclussen in fotosynthetische cyanobacteriën met betrekking tot thioloxidatie te bestuderen. Brede veranderingen in thioloxidatie in verschillende belangrijke biologische processen werden waargenomen, waaronder elektronentransport, koolstoffixatie en glycolyse. Bovendien werd door orthogonale validatie bevestigd dat verschillende belangrijke functionele locaties werden gewijzigd, wat suggereert dat deze regulerende rollen van deze oxidatieve modificaties6.

Hierin beschrijven we de details van een gestandaardiseerde workflow (figuur 1), die het nut van de RAC-benadering aantoont voor de verrijking van totale geoxideerde cysteïnethiolen van eiwitten en hun daaropvolgende etikettering en stoichiometrische kwantificering. Deze workflow is geïmplementeerd in studies naar de redoxtoestand in verschillende monstertypen, waaronder celculturen 27,30 en hele weefsels (bijv. skeletspieren, hart, longen)29,31,32,33. Hoewel het hier niet is opgenomen, is het RAC-protocol ook gemakkelijk aan te passen voor het onderzoek naar specifieke vormen van omkeerbare redoxmodificaties, waaronder SSG, SNO en S-acylering, zoals eerder vermeld 25,29,34.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle in het protocol beschreven procedures met betrekking tot dierlijke of menselijke monsters/weefsels werden goedgekeurd door en volgden de institutionele richtlijnen van de ethische commissie voor onderzoek bij mens en dier.

1. Homogenisatie/lysis van het monster

  1. Ingevroren weefselmonsters
    1. Gehakt bevroren weefsel (~ 30 mg) op een glazen microscoop glaasje op droogijs met behulp van een vooraf gechilleerd scheermesje en een tang. Breng het gehakte weefsel over in een vooraf gegraveerde buis van 5 ml rondbodempolystyreen met 700 μL buffer A (zie tabel 1) en incubeer gedurende 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht.
    2. Verstoor het weefsel gedurende 30 s of totdat het volledig is gehomogeniseerd met een handgezogenheidshomogenisator. Leg de monsters op ijs en laat het schuim nog 10 minuten zakken.
      OPMERKING: Een aluminium bakplaat geplaatst op droogijs biedt een stabiel werkoppervlak en platform voor de eerste verwerking / gehakt van het weefsel.
  2. U kunt ook aanhangende celculturen gebruiken in 100 mm kweekschalen als uitgangsmateriaal.
    1. Houd de cellen op ijs en gebruik een serologische pipet om de cellen tweemaal te spoelen met 10 ml ijskoude PBS met 100 mM NEM.
    2. Lyseer de cellen door 1 ml koude homogenisatie/ lysisbuffer toe te voegen en krachtig te schrapen met een stijve celschraper. Breng het lysaat over in een centrifugebuis van 2 ml met behulp van een micropipette.
      OPMERKING: Spoelbuffer en lysisbuffer kunnen worden geschaald op basis van kweekvaten van verschillende grootte. Meestal zijn 2-5 miljoen cellen nodig; dit varieert echter afhankelijk van de lysis-efficiëntie en eiwitopbrengst voor specifieke celtypen. Homogenisatiebuffer kan zonder NEM worden bereid voor monsters die worden geanalyseerd op totale thiolen.
  3. Breng het resulterende homogenaat (stap 1.1.2 of 1.2.2) over in een centrifugebuis van 2 ml met behulp van een micropipette en centrifugeer op volle snelheid (≥16.000 × g) bij 4 °C gedurende 10 minuten.
  4. Breng het supernatant (~ 700 μL of ~ 1 ml voor celkweek) over met behulp van een micropipette naar een conische microcentrifugebuis van 5 ml en incubeer gedurende 30 minuten bij 55 °C in het donker met schudden bij 850 tpm.
  5. Voeg met behulp van een glazen serologische pipet 4 ml ijskoude aceton toe aan de monsters en incubeer bij -20 °C 's nachts voor precipitatie van eiwit en verwijdering van overtollig N-ethylmaleimide.

2. Harsondersteunde afvang

  1. Was de neergeslagen eiwitkorrels tweemaal met aceton door gedurende 10 minuten te centrifugeren op 20.500 × g bij 4 °C, de aceton te decanteren, eventuele resterende aceton te verwijderen met behulp van een micropipette en 3 ml verse, ijskoude aceton toe te voegen met behulp van een glazen serologische pipet. Keer meerdere keren om om te mengen. Laat de pellets na de tweede wasbeurt 1-2 minuten aan de lucht drogen, zorg ervoor dat u niet te veel droogt, omdat resuspensie moeilijk kan worden.
  2. Voeg met behulp van een micropipette 1 ml buffer B toe (zie tabel 1) en verzacht het eiwit met herhaalde ultrasoonapparaat gedurende 15-30 s per keer met behulp van een badsonicator met een vermogen van 250 W en korte vortexing. Meet de eiwitconcentratie met behulp van de bicinchonininezuur (BCA) assay volgens het protocol van de fabrikant.
  3. Om de eiwitconcentraties in monsters te standaardiseren voor verdere verwerking en volledige verwijdering van NEM te garanderen, brengt u 500 μg eiwit over naar een centrifugaalfilter van 0,5 ml 10 kDa met behulp van een micropipette en past u het aan een laatste volume van 500 μL aan met resuspensiebuffer.
  4. Centrifugeer bij 14.000 × g bij kamertemperatuur totdat het volume in het centrifugaalfilter minder dan 100 μL bedraagt. Verzamel de monsters door het filter in een opvangbuis om te keren. Centrifugeer bij 1.000 × g gedurende 2 minuten en stel het in op een eindvolume van 500 μL met buffer C (zie tabel 1).
  5. Verminder de eiwitthiolen door 20 μL van 500 mM dithiothreitol (DTT) met behulp van een micropipette toe te voegen tot een eindconcentratie van 20 mM en de monsters gedurende 30 minuten bij 37 °C te incuberen tijdens het schudden bij 850 rpm.
  6. Breng de monsters na reductie met behulp van een micropipette over op 0,5 ml 10 kDa centrifugaalfilters en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 14.000 × g bij kamertemperatuur of totdat het volume in het centrifugaalfilter minder dan 100 μL bedraagt. Voeg buffer D (zie tabel 1) toe om het volume in het centrifugaalfilter op 500 μL te brengen.
    1. Herhaal de centrifuging en toevoeging aan 500 μL in stap 2.6 drie keer en verzamel na de vierde centrifugatie de monsters door het filter in een verzamelbuis om te keren en gedurende 2 minuten te centrifugeren bij 1.000 × g .
  7. Meet de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-test volgens het protocol van de fabrikant.
  8. Bereid tijdens deze bufferuitwisseling de thiolaffiniteitshars voor door de juiste hoeveelheid hars (30 mg/monster) te wegen met behulp van een microbalans en over te brengen naar een centrifugebuis van 50 ml. Voeg vervolgens met behulp van een serologische pipet water toe voor een uiteindelijke concentratie van 30 mg / ml hars en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met agitatie voor een goede hydratatie van de hars.
    OPMERKING: De hierboven genoemde thiolaffiniteitshars is door de fabrikant stopgezet. Een mogelijke vervanging voor deze thiolaffiniteitshars is in de handel verkrijgbaar. Deze vervanging heeft echter een bijna 5-voudig minder bindingscapaciteit (zie Aanvullende informatie). Als alternatief kan de thiolaffiniteitshars worden gesynthetiseerd met behulp van 2-(pyridyldithio) ethylaminehydrochloride en N-hydroxysuccinimide-geactiveerde hars (zie Aanvullende informatie).
    1. Na hydratatie van de hars plaatst u de spinkolommen op een vacuümspruitstuk en brengt u 500 μL van de harsbrij met behulp van een micropipette over naar elke kolom. Breng vacuüm aan voor het verwijderen van water; herhaal deze stap eenmaal om in totaal 30 mg hars per kolom te verkrijgen. U kunt ook centrifugeren op 1.000 × g gedurende 2 minuten in plaats van hiervoor het vacuümspruitstuk en alle harswas- en elutiestappen te gebruiken.
      OPMERKING: Het snijden van het uiteinde van een pipetpunt van 1000 μL om de boring te vergroten, helpt bij de overdracht van de hars. Het is belangrijk om te tritureren tussen pipetteren om ervoor te zorgen dat de hars gesuspendeerd blijft en homogene en gelijke hoeveelheden hars worden overgebracht naar elke kolom.
    2. Was de hars door 500 μL ultrapuur water toe te voegen met een micropipette en vacuüm toe te passen voor het verwijderen van het water; herhaal dit 5 keer. Was de hars vervolgens 5 keer met 500 μL buffer E (zie tabel 1).
      OPMERKING: Als alternatief kan centrifugatie bij 1.000 x g gedurende 2 minuten worden gebruikt in plaats van een vacuümspruitstuk voor alle volgende wasstappen. Alle lopende wasstappen worden uitgevoerd met een volume van 500 μL. Voeg bij het toevoegen van wasbuffers aan de kolom voorzichtig toe met voldoende kracht om de hars volledig te resuspenderen terwijl spatten en verlies van hars worden vermeden; dit maakt het mogelijk om hars volledig en efficiënt te wassen.
  9. Breng met behulp van een micropipette 150 μg eiwit van elk gereduceerd monster over naar een nieuwe buis en pas het aan tot een eindvolume van 120 μL buffer C (zie tabel 1). Breng de eiwitoplossing met behulp van een micropipette over op een verstopte spinkolom met de hars, plaats de dop op de kolom en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met schudden bij 850 tpm.
  10. Was de hars vijf keer met 25 mM HEPES, pH 7,0; 8 M ureum; gevolgd door vijf keer met 2 M NaCl; gevolgd door vijf keer met 80% acetonitril (ACN) met 0,1% trifluorazijnzuur (TFA); en ten slotte vijf keer met 25 mM HEPES, pH 7,7, zoals beschreven in stap 2.8.2 en vervang de stekker.
    OPMERKING: Monsters kunnen hier worden geëlueerd voor analyse op eiwitniveau (bijv. SDS-polyacrylamide gel-elektroforese (SDS-PAGE), western blot) zoals beschreven in stap 4.1.

3. Tryptische vergisting op hars en TMT-etikettering

  1. Bereid voldoende gemodificeerde trypsineoplossing van sequencingkwaliteit voor 6-8 μg per monster door deze op te lossen in een concentratie van 0,5 μg/μL in buffer C (zie tabel 1), zodat het uiteindelijke volume ten minste 120 μL per monster toelaat. Voeg met behulp van een micropipette 120 μL van deze trypsine-oplossing toe aan de monsters en incubeer een nacht bij 37 °C met schudden bij 850 tpm.
    OPMERKING: Om de verteringsefficiëntie te verhogen, kan de volgende dag een extra verteringsstap worden opgenomen door de trypsine-oplossing te verwijderen en te vervangen door een verse oplossing en de spijsvertering gedurende 2 uur voort te zetten.
  2. Was de hars vijf keer met 25 mM HEPES, pH 7,0; gevolgd door vijf keer 2 M NaCl; gevolgd door vijf keer met 80% ACN met 0,1% TFA; gevolgd door driemaal met 25 mM HEPES, pH 7,7. Was de hars ten slotte twee keer met 50 mM triethylammoniumbicarbonaatbuffer (TEAB) en vervang de plug.
  3. Bereid TMT-etiketteringsreagentia voor door ze eerst te laten opwarmen tot kamertemperatuur voordat ze kort worden afgecentrifugeerd met behulp van een centrifuge van 16.000 × g. Voeg 150 μL watervrij ACN toe aan elke injectieflacon met TMT-etiketteringsreagens met behulp van een micropipette. Incubeer de injectieflacons bij kamertemperatuur op een thermomixer die gedurende 5 minuten op 850 tpm is ingesteld om het reagens volledig op te lossen. Kort vortex en spin naar beneden bij 16.000 × g om het reagens te verzamelen.
  4. Voeg met behulp van een micropipette 40 μL 100 mM TEAB toe aan de gewassen hars, voeg vervolgens 70 μL van het opgeloste TMT-reagens toe en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met schudden bij 850 tpm. Bewaar eventueel achtergebleven TMT-reagens bij -80 °C.
    OPMERKING: Let op de afzonderlijke TMT-labels die aan elk biologisch monster zijn toegewezen (figuur 1).
  5. Was de hars vijf keer met 80% ACN met 0,1% TFA, drie keer met 100 mM ammoniumbicarbonaatbuffer (ABC), pH 8,0 en tweemaal met water zoals eerder beschreven en vervang de plug.

4. Peptide-elutie

  1. Eluteer de gelabelde peptiden door 100 μL van 20 mM DTT in 100 mM ABC, pH 8,0, aan elke kolom toe te voegen met behulp van een micropipette en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een thermomixer ingesteld op 850 rpm.
    OPMERKING: Na de toevoeging van DTT zal de hars klonteren. De hars kan worden verstoord met een pipetpunt om klonten te breken en de volledige elutie van de peptiden te garanderen.
  2. Plaats na deze incubatie de kolom op een vacuümspruitstuk dat bedoeld is voor vastefase-extractie (SPE), breng vacuüm aan en elueerde de monsters in een microcentrifugebuis van 5 ml. Herhaal deze stap eenmaal.
  3. Voeg ten slotte 100 μL 80% ACN toe met 0,1% TFA, incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en eluut in dezelfde centrifugebuis van 5 ml. Verzamel alle fracties in dezelfde microcentrifugebuis van 5 ml.
    OPMERKING: Om monsterverlies te voorkomen, moeten buizen met een lage binding worden gebruikt voor elutie en moeten volumes op of onder een volume van 4,0 ml worden gehouden voor een enkele buis van 5 ml.
  4. Plaats de geëlueerde monsters in een vacuümconcentrator tot ze droog zijn. Bewaar de droge peptiden bij -80 °C en resuspen ze later.
    OPMERKING: Monsters kunnen ook afzonderlijk worden geëlueerd en een aliquot kan worden verwijderd en geanalyseerd door SDS-PAGE voor analyse op peptideniveau voordat de monsters worden gecombineerd.

5. Peptide-alkylering en ontzilting/sanering

  1. Resuspendeer de gedroogde peptiden door een klein volume van 100 mM ABC-buffer, pH 8,0 (niet groter dan 500 μL), toe te voegen met behulp van een micropipette. Gebruik herhaalde ultrasoonapparaat gedurende 15-30 s per keer met behulp van een badsonicator met een vermogen van 250 W en vortex om op te lossen en over te brengen naar een buis van 2 ml.
    OPMERKING: Het volume van 100 mM ABC, pH 8,0 dat moet worden toegevoegd, is gebaseerd op het volume dat nodig is om de DTT te resuspenderen bij een molariteit van 150 mM. Gebruikers moeten de hoeveelheid DTT in hun steekproef bepalen op basis van wat oorspronkelijk in stap 4.1 is toegevoegd.
  2. Voeg voldoende geconcentreerde stamoplossing (600 mM) jodoacetamide (IAZ) opgelost in ABC toe met behulp van een micropipette om een 1:4 molaire verhouding van DTT:IAZ te bereiken en incubeer de monsters bij RT gedurende 1 uur met schudden bij 850 tpm.
  3. Verzuur de monsters tot pH-< 3 door geconcentreerde TFA (10%) toe te voegen met behulp van een micropipette en monsterontzilting uit te voeren met behulp van omgekeerde fasereiniging volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Plaats de schone peptiden in een vacuümconcentrator tot ze droog zijn. Bewaar de droge peptiden bij -80 °C tot verdere analyse.

6. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie

  1. Resuspendeer de gedroogde peptiden door herhaalde ultrasoonapparaat gedurende 15-30 s per keer met behulp van een badsonicator met een output van 250 W en vortexing in 20-40 μL water met 3% ACN. Bepaal de peptideconcentratie door een BCA-test uit te voeren volgens het protocol van de fabrikant.
  2. Scheid de monsters door omgekeerde fase LC en MS/MS zoals eerder beschreven6 en noteer de MS1-spectra over het m/z-bereik van 400-2000. Zorg ervoor dat hoogenergetische botsingsdissociatie (HCD) wordt gebruikt om informatie over de ionenintensiteit van reporters te verkrijgen voor de analyse van isobarisch gelabelde peptiden. Zie de methodensecties van eerdere rapporten voor meer informatie over instrumentruncondities27,30 en de analyse van MS-gegevens27,31.
    OPMERKING: Verschillende LC-MS/MS-systemen of -instellingen kunnen worden gebruikt om de peptidemonsters te analyseren. De dekking en gevoeligheid van peptide-identificatie is afhankelijk van het specifieke systeem en de gebruikte instellingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voltooiing van het protocol zal resulteren in zeer specifieke verrijking van voorheen geoxideerde cysteïnebevattende peptiden, vaak met >95% specificiteit 27,35,36. Verschillende belangrijke stappen van het protocol vereisen echter speciale aandacht, bijvoorbeeld de initiële blokkering van vrije thiolen voorafgaand aan monsterlysis / homogenisatie, die kunstmatige oxidatie en niet-specifieke verrijking van kunstmatig geoxideerde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Harsondersteunde afvang is gebruikt in een verscheidenheid aan monstertypen en biologische systemen voor het onderzoek naar oxidatieve modificaties van cysteïneresiduen 25,29,30. Deze methode maakt de evaluatie van monsters op meerdere niveaus en uitlezingen mogelijk, waaronder eiwitten en peptiden met behulp van SDS-PAGE en western blot-analyse, evenals individuele cysteïnesites met behulp van massaspectrometrie. Ongeacht het m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten, financieel of anderszins.

Dankbetuigingen

Delen van het werk werden ondersteund door NIH Grants R01 DK122160, R01 HL139335 en U24 DK112349

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochlorideMed Chem ExpressHY-101794Reagens voor in-house resin synthese
2.0 mL LoBind centrifuge tubesEppendorf22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubesEppendorf30108310
5.0 mL round bottom tubesFalcon352054
AcetoneFisher ScientificA949-1
AcetonitrileSigma Aldrich34998
Activated Thiol–Sepharose 4BSigma AldrichT8512Mogelijke vervanger voor thiol-affiniteit resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filterMillipore SigmaUFC5010BK
Ammonium bicarbonateSigma Aldrich09830
Bicinchonicic acid (BCA)Thermo Scientific23227Eiwit Assay Reagens
CentrifugeEppendorf5810R
CentrifugeEppendorf5415R
Dithiothreitol (DTT)Thermo Scientific20291
EDTASigma AldrichE5134
HEPES bufferSigma AldrichH4034
HomogenizerBioSpec Products985370
Iodoacetimide (IAA)Sigma AldrichI1149
N-ethylmaleimideSigma Aldrich4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast FlowCytiva17-0906-01Reagens voor in-house resin synthese
QIAvac 24 Plus vacuum manifoldQiagen19413
Sodium chlorideSigma AldrichS3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma AldrichL6026
SonicatorBranson1510R-MT
Spin columnsThermo Scientific69705
Strata C18-E reverse phase columnsPhenomenex8B-S001-DAKPeptide desalting
ThermomixerEppendorf5355
Thiopropyl Sepharose 6BGE Healthcare17-0420-01Thiol-affiniteit resin; *De productie van Thiopropyl Sepharose 6B resin is gestopt door de fabrikant (zie protocol voor details).
TMT isobaric labels (16 plex)Thermo ScientificA44522Peptide labeling reagens; beschikbaar in meerdere formaten
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)Sigma AldrichT7408
Trifluoroacetic acid (TFA)Sigma AldrichT6508
Triton X-100Sigma AldrichT8787
TrypsinPromegaV5820
UreaSigma AldrichU5378
Vacufuge Plus speedvacEppendorf22820001vacuum concentrator
Vortex mixerScientific IndustriesSI-0236
```

Referenties

  1. Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
  2. Adams, L., Franco, M. C., Estevez, A. G. Reactive nitrogen species in cellular signaling. Experimental Biology and Medicine. 240 (6), 711-717 (2015).
  3. Olson, K. R. The biological legacy of sulfur: A roadmap to the future. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 252, 110824(2021).
  4. Sies, H. Oxidative eustress: on constant alert for redox homeostasis. Redox Biology. 41, 101867(2021).
  5. Poole, L. B. The basics of thiols and cysteines in redox biology and chemistry. Free Radical Biology & Medicine. 80, 148-157 (2015).
  6. Guo, J., et al. Proteome-wide light/dark modulation of thiol oxidation in cyanobacteria revealed by quantitative site-specific redox proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (12), 3270-3285 (2014).
  7. Shi, X., Qiu, H. Post-translational S-nitrosylation of proteins in regulating cardiac oxidative stress. Antioxidants. 9 (11), 1051(2020).
  8. Fra, A., Yoboue, E. D., Sitia, R. Cysteines as redox molecular switches and targets of disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 167(2017).
  9. Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants & Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
  10. Go, Y. M., Jones, D. P. The redox proteome. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26512-26520 (2013).
  11. Bak, D. W., Bechtel, T. J., Falco, J. A., Weerapana, E. Cysteine reactivity across the subcellular universe. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 96-105 (2019).
  12. Skryhan, K., et al. The role of cysteine residues in redox regulation and protein stability of Arabidopsis thaliana starch synthase 1. PLoS One. 10 (9), 0136997(2015).
  13. Su, Z., et al. Global redox proteome and phosphoproteome analysis reveals redox switch in Akt. Nature Communications. 10 (1), 5486(2019).
  14. Liebthal, M., Schuetze, J., Dreyer, A., Mock, H. -P., Dietz, K. -J. Redox conformation-specific protein-protein interactions of the 2-cysteine peroxiredoxin in Arabidopsis. Antioxidants. 9 (6), 515(2020).
  15. Pace, N. J., Weerapana, E. Zinc-binding cysteines: diverse functions and structural motifs. Biomolecules. 4 (2), 419-434 (2014).
  16. Schwartz, P. A., et al. Covalent EGFR inhibitor analysis reveals importance of reversible interactions to potency and mechanisms of drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 173(2014).
  17. Sevilla, E., Bes, M. T., González, A., Peleato, M. L., Fillat, M. F. Redox-based transcriptional regulation in prokaryotes: revisiting model mechanisms. Antioxidants & Redox Signaling. 30 (13), 1651-1696 (2018).
  18. Topf, U., et al. Quantitative proteomics identifies redox switches for global translation modulation by mitochondrially produced reactive oxygen species. Nature Communications. 9 (1), 324(2018).
  19. Gao, X. -H., et al. Discovery of a redox thiol switch: implications for cellular energy metabolism. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (5), 852-870 (2020).
  20. Prus, G., Hoegl, A., Weinert, B. T., Choudhary, C. Analysis and interpretation of protein post-translational modification site stoichiometry. Trends in Biochemical Sciences. 44 (11), 943-960 (2019).
  21. Zhang, T., Gaffrey, M. J., Li, X., Qian, W. J. Characterization of cellular oxidative stress response by stoichiometric redox proteomics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (2), 182-194 (2021).
  22. Jaffrey, S. R., Erdjument-Bromage, H., Ferris, C. D., Tempst, P., Snyder, S. H. Protein S-nitrosylation: a physiological signal for neuronal nitric oxide. Nature Cell Biology. 3 (2), 193-197 (2001).
  23. Alcock, L. J., Perkins, M. V., Chalker, J. M. Chemical methods for mapping cysteine oxidation. Chemical Society Reviews. 47 (1), 231-268 (2018).
  24. Li, R., Kast, J. Biotin switch assays for quantitation of reversible cysteine oxidation. Methods in Enzymology. 585, 269-284 (2017).
  25. Guo, J., et al. Resin-assisted enrichment of thiols as a general strategy for proteomic profiling of cysteine-based reversible modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
  26. Liu, T., et al. High-throughput comparative proteome analysis using a quantitative cysteinyl-peptide enrichment technology. Analytical Chemistry. 76 (18), 5345-5353 (2004).
  27. Duan, J., et al. Stochiometric quantification of the thiol redox proteome of macrophages reveals subcellular compartmentalization and susceptibility to oxidative perturbations. Redox Biology. 36, 101649(2020).
  28. Mitchell, A. R., et al. Redox regulation of pyruvate kinase M2 by cysteine oxidation and S-nitrosation. Biochemical Journal. 475 (20), 3275-3291 (2018).
  29. Campbell, M. D., et al. Improving mitochondrial function with SS-31 reverses age-related redox stress and improves exercise tolerance in aged mice. Free Radical Biology & Medicine. 134, 268-281 (2019).
  30. Duan, J., et al. Quantitative profiling of protein S-glutathionylation reveals redox-dependent regulation of macrophage function during nanoparticle-induced oxidative stress. ACS Nano. 10 (1), 524-538 (2016).
  31. Wang, J., et al. Protein thiol oxidation in the rat lung following e-cigarette exposure. Redox Biology. 37, 101758(2020).
  32. Kramer, P. A., et al. Fatiguing contractions increase protein S-glutathionylation occupancy in mouse skeletal muscle. Redox Biology. 17, 367-376 (2018).
  33. Chiao, Y. A., et al. Late-life restoration of mitochondrial function reverses cardiac dysfunction in old mice. Elife. 9, 55513(2020).
  34. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S-acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
  35. Su, D., et al. Quantitative site-specific reactivity profiling of S-nitrosylation in mouse skeletal muscle using cysteinyl peptide enrichment coupled with mass spectrometry. Free Radical Biology & Medicine. 57, 68-78 (2013).
  36. Su, D., et al. Proteomic identification and quantification of S-glutathionylation in mouse macrophages using resin-assisted enrichment and isobaric labeling. Free Radical Biology & Medicine. 67, 460-470 (2014).
  37. Searle, B. C., Yergey, A. L. An efficient solution for resolving iTRAQ and TMT channel cross-talk. Journal of Mass Spectrometry. 55 (8), 4354(2020).
  38. Duan, J., Gaffrey, M. J., Qian, W. J. Quantitative proteomic characterization of redox-dependent post-translational modifications on protein cysteines. Molecular BioSystems. 13 (5), 816-829 (2017).
  39. Behring, J. B., et al. Spatial and temporal alterations in protein structure by EGF regulate cryptic cysteine oxidation. Science Signaling. 13 (615), 7315(2020).
  40. Shakir, S., Vinh, J., Chiappetta, G. Quantitative analysis of the cysteine redoxome by iodoacetyl tandem mass tags. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (15), 3821-3830 (2017).
  41. Gorin, G., Martic, P. A., Doughty, G. Kinetics of the reaction of N-ethylmaleimide with cysteine and some congeners. Archives of Biochemistry and Biophysics. 115 (3), 593-597 (1966).
  42. Hsu, M. -F., et al. Distinct effects of N-ethylmaleimide on formyl peptide- and cyclopiazonic acid-induced Ca2+ signals through thiol modification in neutrophils. Biochemical Pharmacology. 70 (9), 1320-1329 (2005).
  43. Li, R., Huang, J., Kast, J. Identification of total reversible cysteine oxidation in an atherosclerosis model using a modified biotin switch assay. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2026-2035 (2015).
  44. Wang, J., et al. Integrated dissection of cysteine oxidative post-translational modification proteome during cardiac hypertrophy. Journal of Proteome Research. 17 (12), 4243-4257 (2018).
  45. Patra, K. K., Bhattacharya, A., Bhattacharya, S. Molecular dynamics investigation of a redox switch in the anti-HIV protein SAMHD1. Proteins. 87 (9), 748-759 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Redox proteomicathiol affiniteitharsLC MS MS analysetryptische digestieWestern blotSDS PAGEcyste neoxidatie
Harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.