Methodenartikel

Op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof/deuteriumuitwisseling voor conformatiekarakterisering van eiwitten met top-down massaspectrometrie

2.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62672

⸱

8 juni 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, 2Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, 3Department of Chemistry, University of British Columbia

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof / deuteriumuitwisseling (HDX) -benadering in combinatie met top-down massaspectrometrie. Deze benadering karakteriseert het verschil in hogere-orde structuren tussen verschillende eiwitsoorten, inclusief eiwitten in verschillende toestanden en verschillende proteoformen, door gelijktijdige differentiële HDX en elektroforetische scheiding uit te voeren.

Samenvatting

Het oplossen van conformatie-heterogeniteit van meerdere eiwittoestanden die naast elkaar bestaan in oplossing blijft een van de belangrijkste obstakels bij de karakterisering van eiwittherapieën en de bepaling van de conformatietransitieroutes die cruciaal zijn voor biologische functies, variërend van moleculaire herkenning tot enzymatische katalyse. Waterstof/deuterium uitwisseling (HDX) reactie in combinatie met top-down massaspectrometrische (MS) analyse biedt een middel om eiwit hogere orde structuren en dynamica te karakteriseren op een conformer-specifieke manier. Het conformatie-oplossend vermogen van deze techniek is sterk afhankelijk van de efficiëntie van het scheiden van eiwittoestanden op het intacte eiwitniveau en het minimaliseren van het resterende niet-gedeutereerde protische gehalte tijdens de HDX-reacties.

Hier beschrijven we een op capillaire elektroforese (CE) gebaseerde variant van de HDX MS-benadering die tot doel heeft de conformatieresolutie te verbeteren. In deze benadering ondergaan eiwitten HDX-reacties terwijl ze migreren door een gedeutereerde achtergrondelektrolytoplossing (BGE) tijdens de capillaire elektroforetische scheiding. Verschillende eiwittoestanden of proteoformen die naast elkaar bestaan in oplossing kunnen efficiënt worden gescheiden op basis van hun verschillende lading-tot-grootteverhoudingen. Het verschil in elektroforetische mobiliteit tussen eiwitten en protische oplosmiddelmoleculen minimaliseert het resterende niet-gedeutereerde oplosmiddel, wat resulteert in een bijna volledige deutererende omgeving tijdens het HDX-proces. De doorstroom microviale CE-MS-interface maakt efficiënte elektrospray-ionisatie van de geëlueerde eiwitsoorten mogelijk na een snelle menging met de blus- en denaturerende modifieroplossing aan de uitlaat van de sproeier. De online top-down MS-analyse meet het wereldwijde deuteratieniveau van de geëlueerde intacte eiwitsoorten en vervolgens de deuteratie van hun gasfasefragmenten. Dit artikel demonstreert deze benadering in differentiële HDX voor systemen, inclusief de natuurlijke eiwitvarianten die naast elkaar bestaan in melk.

Inleiding

Het onderscheiden van eiwitsoorten in verschillende conformatie-, bindings- of modificatietoestanden en het karakteriseren van hun structurele verschillen zijn belangrijk voor het monitoren van de routes van overgangen tussen deze soorten die betrokken zijn bij biologische gebeurtenissen, variërend van moleculaire herkenning tot enzymatische katalyse, en het begrijpen van de mechanismen die aan deze gebeurtenissen ten grondslag liggen. Conventionele biofysische technieken bieden geen volledige oplossing vanwege de beperkingen zoals onvoldoende resolutie en verlies van dynamische informatie in oplossing. Waterstof/deuteriumuitwisseling in combinatie met massaspectrometrie (HDX MS) is een techniek die de structurele en conformationele kenmerken van eiwitten labelt met deuterium (2H) via de uitwisseling tussen labiele waterstofatomen van eiwitten en 2H uit de opzettelijk geïntroduceerde 2H2O-oplossing. Protonen die betrokken zijn bij waterstofbinding of die worden gesekwestreerd uit het oplosmiddel in het eiwitinterieur wisselen niet gemakkelijk1 uit. Omdat de wisselkoers op een verwisselbare locatie dus sterk afhankelijk is van zijn betrokkenheid bij structuren van hogere orde, kunnen de eiwitstructuren met hoge ruimtelijke resolutie worden onthuld door MS die de mate en snelheid van 2H-opname onderzoekt op basis van de verschillende atoommassa's tussen 1H en 2H. In de afgelopen decennia is HDX MS een buitengewoon succesvolle techniek geworden voor het bestuderen van eiwitconformaties en -dynamica2.

In de klassieke bottom-up benadering van HDX MS wordt het ensemble van eiwitsoorten in verschillende conformatie-, bindings- of modificatietoestanden proteolyseerd zonder scheiding op het intacte eiwitniveau, waardoor het onhaalbaar is om individuele soorten te karakteriseren door de resulterende proteolytische fragmenten met ingewikkelde deuteriuminhoud te analyseren. In de top-down benadering daarentegen geven verschillende eiwittoestanden of proteoformen die verschillende deuteriumgehalten hebben opgenomen aanleiding tot meerdere verdelingen van intacte eiwitmassa's in een MS-scan. Hierdoor kunnen individuele soorten worden gescheiden door massaselectie van ionen die overeenkomen met elke massaverdeling met behulp van een goed massafilter (zoals een quadrupool) en de karakterisering van hun conformatieverschillen in de daaropvolgende tandem MS-analyse 3,4,5,6. De efficiëntie van het scheiden van eiwittoestanden of proteoformen in deze strategie wordt echter beperkt door de mate van verschil in hun overeenkomstige massaverdelingen.

Capillaire elektroforese (CE) biedt een middel om eiwitsoorten te scheiden op basis van hun verschillende ladingen en hydrodynamische afmetingen in de oplossingsfase met een hoog rendement7. De combinatie van CE met HDX biedt extra scheiding van eiwittoestanden of proteoformen in de oplossingsfase. Bovendien maakt het kleine volume van het CE-capillair het gebruik van een volledig gedeutereerde oplossing als achtergrondelektrolytoplossing (BGE), d.w.z. de lopende buffer, waardoor het capillair wordt weergegeven als een HDX-reactor voor eiwitmonsters. Vanwege het verschil in elektroforetische mobiliteit tussen eiwitten en protische reagentia in het elektroforeseproces, resulteert het uitvoeren van HDX tijdens CE in een bijna volledige deutererende omgeving voor de eiwitanalyten met minimale resterende niet-gedeutereerde inhoud, waardoor de gevoeligheid van de structurele analyse met behulp van HDX-gegevens wordt verbeterd. Als zodanig ontwikkelden we een CE-gebaseerde differentiële HDX-benadering in combinatie met top-down MS om eiwitstructuren van hogere orde te karakteriseren op een toestands- of proteoform-specifieke manier8.

Dit artikel beschrijft protocollen voor deze aanpak door de stappen van materiaalvoorbereiding, experimentele procedure en gegevensanalyse te beschrijven. Factoren die van invloed kunnen zijn op de prestaties van de methode of de gegevenskwaliteit worden vermeld in korte notities. De hier gepresenteerde representatieve resultaten omvatten differentiële HDX-gegevens van mengsels van verschillende eiwitten en natuurlijke varianten van runder- β-lactoglobuline (β-lg), het belangrijkste wei-eiwit dat aanwezig is in melk9. We demonstreren scheidingsefficiëntie, reproduceerbaarheid en 2H-labelingprestaties van de twee overvloedige varianten van β-lg, d.w.z. A en B10,11 tijdens de CE-gebaseerde HDX en variantspecifieke karakterisering van hun conformaties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Gebruik waar mogelijk hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) of MS-klasse reagentia om de verontreinigingen die de MS-analyse kunnen verstoren, te minimaliseren. Raak de CE-MS-interface tijdens de meting niet met blote handen aan om de mogelijkheid van een elektrische schok veroorzaakt door de elektroforetische spanning of elektrosprayspanning te voorkomen.

1. Materiaalvoorbereiding

  1. Modificatie van gesmolten silica capillair voor CE
    1. Bereid een 5% (m/w) hydroxypropylcellulose (HPC)-oplossing door HPC-poeder (molecuulgewicht [MW]: 100 kDa) op te lossen in water met continu roeren bij kamertemperatuur op een magneetroerder gedurende ~ 12 uur of totdat vaste deeltjes volledig zijn verdwenen12. Verwijder alle zichtbare luchtbellen met een ultrasoonapparaat.
    2. Monteer een gesmolten silicaglascapillair (binnendiameter [ID]: 50 μm, buitendiameter [OD]: 360 μm) van ongeveer 85 cm lengte in een CE-instrument. Spoel het capillair door continu een organisch oplosmiddel, zoals aceton13, te injecteren met behulp van de autosampler van CE bij een infusiedruk van 40 psi gedurende 10-15 minuten.
    3. Vul het gereinigde capillair met HPC-oplossing met behulp van de autosampler bij een infusiedruk van 40 psi (wat vaak ~ 40 minuten duurt). Injecteer lucht in het hpc-gevulde capillair bij 40 psi om een vrije luchtstroom in het capillair te garanderen, aangegeven door de luchtbellen die uit het capillair worden uitgestoten bij onderdompeling in water.
    4. Bak het hpc-gecoate capillair in een temperatuurprogrammeerbare oven (idealiter de temperatuurgeregelde kolomoven van een temperatuurgeprogrammeerde gaschromatograaf) met stikstofgas (25 psi) dat door het capillair stroomt, volgens het temperatuurprogramma in figuur 1.
    5. Koel de oven af tot kamertemperatuur voordat je het capillair eruit haalt. Gebruik dit HPC-gemodificeerde capillair voor CE-scheiding.

figure-protocol-1
Figuur 1: Een aanbevolen temperatuurprogramma voor capillair bakken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Achtergrondelektrolytoplossing (BGE) en modifieroplossing8
    1. Bereid 1-10 ml BGE in de gewenste concentratie (bijv. 10 mM) door de juiste hoeveelheid ammoniumacetaat op te lossen in 2 H2O. Plaats 200μL-aliquots BGE in afzonderlijke BGE-injectieflacons en sluit de injectieflacons af met parafilm om de HDX-reactie tussen BGE en waterdamp in de lucht te minimaliseren.
    2. Bereid 10 ml van een modifieroplossing met 75% (v/v) methanol en 25% (v/v) water, waarbij de pH is aangepast tot 2,5 met mierenzuur.
      OPMERKING: Gebruik 2H2O en gedeutereerde methanol om de modificerende oplossing te bereiden als de deuteriumatomen in de zijketens en onbeschermde ruggengraatamiden moeten worden bewaard voor detectie door MS.
  2. Ontzouten van eiwitmonsters
    1. Bereid een ammoniumacetaatoplossing in niet-gedeutereerd water in de gewenste concentratie.
      OPMERKING: Een concentratie van minder dan 100 mM wordt aanbevolen om een hoge elektrische stroom tijdens elektroforese en het resulterende Joule-verwarmingseffect te voorkomen.
    2. Stel indien nodig de pH van de ammoniumacetaatoplossing op het gewenste niveau aan met mierenzuur (voor pH < 6,8) of ammoniumhydroxide (voor pH > 6,8).
    3. Vervang de oorspronkelijke buffers van de eiwitoplossing door een ammoniumacetaatoplossing (bereid in niet-gedeutereerd water met de gewenste concentratie; pH aangepast tot 7,5 met ammoniumhydroxide) door ten minste vijf opeenvolgende concentraties en verdunningsstappen bij 4 °C met behulp van een centrifugaalfilter met een juiste MW-afsnijding.
      OPMERKING: De eiwitmonsters die moeten worden ontzouten, kunnen afkomstig zijn van eerdere productieprocedures (bijv. Zuivering of formulering) of bereid door het gelyofiliseerde eiwitpoeder op te lossen. De "zouten" die in deze stap uit de monsteroplossingen moeten worden verwijderd, hebben in het algemeen betrekking op alle kleine ionen of moleculen die niet vluchtig zijn. Hoewel deze soorten tijdens het elektroforeseproces efficiënt van eiwitten kunnen worden gescheiden, wordt deze stap aanbevolen om te voorkomen dat de elektroforetische resolutie in gevaar wordt gebracht en zo de verontreiniging van de massaspectrometer wordt geminimaliseerd. Wanneer eiwitanalyten moeten worden gestabiliseerd door specifieke zouten of additieven, neem ze dan op in het BGE.
    4. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een microvolume UV-Vis spectrofotometer.

2. Werking van CE-gebaseerde HDX MS-analyse

OPMERKING: De massaspectrometer die in deze benadering wordt gebruikt, moet zijn uitgerust met een massaanalysator met ultrahoge resolutie, zoals een Fourier-transformatie ion cyclotronresonantie (FTICR) of orbitrap, een massafilter, zoals een quadrupool die massaselectie van voorloperionen voor fragmentatie en elektronoverdrachtdissociatie (ETD) of elektronenvangstdissociatie (ECD) mogelijk maakt om top-downanalyse uit te voeren met betrouwbare tandem MS-gegevens (idealiter isotopisch opgeloste signalen van fragmentionen).

  1. Optimalisatie van CE- en MS-instellingen
    1. Voer een pilot MS-meting uit met behulp van een standaard elektrospray-ionisatiebron (ESI) door het voorgeladen monster uit een met metaal bekleed borosilicaatglascapillair (het "statische" nanoESI-schema) of het continu geïnfundeerde monster van een metaalzender te spuiten om de MS-instellingen te optimaliseren voor het meten van intacte eiwitten (MS1) en hun gasfasefragmenten (MS2). Fragmenteer de eiwitsoort van belang door massaselectie van het ensemble van zijn ionen in een enkele ladingstoestand, gevolgd door ETD of ECD van de voorloperionen.
      OPMERKING: De essentiële instellingen omvatten de parameters die van invloed zijn op desolvatie, de massaselectie van voorloperionen (om interferentie van andere soorten te voorkomen) en fragmentatie-efficiëntie. Zowel het midden als de breedte van het massaselectievenster moeten worden verhoogd om overeen te komen met de resulterende massaverdeling van de analytionen na HDX. Omdat het elutievenster van een eiwitsoort in CE meestal varieert van 0,5 minuten tot 2 minuten, beoordeelt u de fragmentatie-efficiëntie op basis van MS2-scans die zich in een vergelijkbaar tijdvenster hebben verzameld. De optimale waarden van deze parameters zijn eiwitspecifiek; lezers worden verwezen naar eerder gepubliceerde rapporten voor voorbeeldige instellingen 8,14.
    2. Voer een pilot CE-meting uit met behulp van een CE-instrument uitgerust met een optische detector, d.w.z. een fotodiode array (PDA) detector of een UV-detector om de CE-instellingen te optimaliseren voor de scheiding van de eiwitsoort en de migratietijden, wat gelijk is aan de HDX-reactietijden.
      OPMERKING: Deze stap is optioneel afhankelijk van de beschikbaarheid van de optische detector van CE. Bij afwezigheid van een optische detector kunnen de CE-instellingen worden geoptimaliseerd met CE-MS na voltooiing van paragraaf 2.2, volgens de instructies beschreven in punt 2.3. De essentiële instellingen omvatten parameters die van invloed zijn op de scheidingsefficiëntie, piekvormen die worden weergegeven in elektroferogrammen en elutietijden.
  2. Voorconditionering van de CE-HDX opstelling
    1. Reinig de doorstroommicroviale CE-MS-interface met een mengsel van 50% methanol, 49% water en 1% mierenzuur (v / v) met behulp van ultrasone trillingen gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Na montage van het HPC-gemodificeerde capillair op een CE-instrument, spoelt u het capillair met BGE gedurende 10 minuten met behulp van de autosampler en laat u het capillair gevuld met BGE.
    3. Verkrijg een juiste lengte van ongewijzigd gesmolten silica capillaire buizen (ID: 50 μm, OD: 360 μm) als de infusiebuis voor de modifier-oplossing. Sluit de modifierbuis aan op een gasdichte glazen spuit met een stompe punt met behulp van een unie en de juiste sleeve, en spoel de slang met de modifier-oplossing met behulp van een infusiepomp gedurende ten minste 10 minuten.
    4. Plaats de uitlaten van de HPC-gecoate CE-capillaire en modifierbuizen, die zijn geladen met overeenkomstige oplossingen, in de gereinigde CE-MS-interface, zoals geïllustreerd in figuur 2.
    5. Vervroeg de spuit voor de infusie met de modifier handmatig of met de infusiepomp om ervoor te zorgen dat de modifier-oplossing de punt van de interface bereikt. Monteer de geassembleerde CE-MS-interface op een nanoESI-bronbehuizing van een massaspectrometer.

figure-protocol-2
Figuur 2: Schematische illustratie van de CE-gebaseerde HDX MS-opstelling. Dit cijfer is gewijzigd van8. Afkortingen: BGE = achtergrond elektrolytoplossing; CE = capillaire elektroforese; MS = massaspectrometrie; HDX = waterstof/deuterium uitwisseling; ESI = elektrospray ionisatie; FTICR = Fourier-transformatie ion cyclotron resonantie; ETD = elektronoverdrachtdissociatie; ECD = elektronvangstdissociatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Gelijktijdige CE-scheiding, HDX-reactie en MS-analyse
    OPMERKING: Gedeutereerd BGE wordt aanbevolen om binnen 1 dag na het ontzegelen te worden gebruikt.
    1. Breng een spuitspanning van 3-5 kV aan op de CE-MS-interface.
    2. Begin met het infunderen van de modifier-oplossing met de infusiepomp met een debiet van 0,1 tot 10 μL/min en zorg voor een stabiele elektrospray aan de punt van de CE-MS-interface.
    3. Plaats de injectieflacon met de BGE in de autosampler en gebruik deze in stap 2.3.4 om blanco-elektroferogrammen en blanco massaspectra te verkrijgen.
    4. Injecteer de monsteroplossing met behulp van de autosampler bij 2 psi en gedurende een juiste duur om de injectie van een gewenste hoeveelheid van het monster mogelijk te maken. Schat het injectievolume met behulp van de relatie tussen het injectievolume en de injectieparameters15 gedefinieerd door vergelijking (1).
      figure-protocol-3 (1)
      Waarbij Vinj het injectievolume is, Δp de druk van de injectie, dc de binnendiameter van het capillair, A de doorsnede van het capillair, tinj de duur van de injectie, η de viscositeit van de vloeistof in het capillair is en L de lengte van het capillair.
    5. Start de CE-scheiding door een elektroforetische spanning van 30 kV en infusiedruk van 0 tot 2 psi toe te passen en verkrijg het elektroferogram. Begin ondertussen met het verzamelen van de MS-gegevens in de chromatografische modus, waarbij de ionenstroomgrafiek wordt verkregen als functie van de tijd en de bijbehorende MS-scans niet automatisch worden gecombineerd in een enkel spectrum.
      OPMERKING: Eiwitten ondergaan een spontane HDX-reactie op het punt van contact met 2H2 O-moleculenin BGE tijdens hun elektroforetische migratie in deze stap. De optische detectie voor CE kan naast de MS-detectie worden gebruikt. Aangezien detectie op de kolom vereist dat een bepaalde lengte van de polyimidecoating aan het uiteinde van het gesmolten silicacapillair wordt verwijderd, moet extra zorg worden besteed aan het voorkomen van capillaire schade tijdens de montage van de CE-MS-interface.
    6. Sla het lege elektroferogram en massaspectra op als referenties.
      OPMERKING: Lege gegevens moeten worden gebruikt voor het oplossen van problemen in plaats van aftrekken van de basislijn.
    7. Plaats de injectieflacons met de monsterflacons met de gewenste concentraties van de eiwitmonsteroplossingen in de autosampler. Verkrijg de elektroferogrammen en massaspectra voor de eiwitmonsters volgens stap 2.3.4-2.3.5. Verzamel een voldoende aantal MS-scans om MS1-spectra van de elektroforetisch gescheiden en 2H-gelabelde eiwitsoorten te verkrijgen.
    8. Voer tandem MS-metingen uit voor de soort van belang, hetzij na het verkrijgen van de MS1-spectra binnen dezelfde run of in een volgende, afzonderlijke run.
    9. Pas indien nodig de migratietijden/HDX-reactietijden aan door de infusiedruk of de lengte van het CE-capillair te wijzigen. Als de HDX-reactietijd korter moet zijn dan de migratietijd, gebruik dan de eerder beschreven aanpak8, die zowel gedeutereerde als niet-gedeutereerde BGE in het capillair gebruikt tijdens het CE-proces.
    10. Spoel het CE-capillair met BGE bij een druk van 20 psi gedurende ten minste 10 minuten na elke meting.
    11. Na voltooiing van de experimenten reinigt u de CE-MS-interface en alle slangen voor opslag.
    12. Verkrijg een dataset van het HDX "eindpunt"-monster (dat kan worden bereid met behulp van eerder beschreven benaderingen 6,16) met MS in directe infusiemodus.
      OPMERKING: Deze stap is alleen vereist wanneer een gedeutereerde modifier-oplossing wordt gebruikt voor CE-gebaseerde HDX.

3. Data-analyse

  1. Analyse van CE-gegevens
    1. Gebruik een van de volgende plots als het elektroferogram om de elektroforetische kenmerken te bepalen, inclusief het aantal pieken, migratietijden en scheidingsefficiëntie: (a) UV-absorptie versus migratietijd, verkregen door de optische detector van het CE-instrument (indien beschikbaar); b) de totale ionenstroomgrafiek (TIC) die door de lidstaten is verkregen; c) de geëxtraheerde ionenstroomgrafiek (EIC/XIC) die door de lidstaten is verkregen.
      OPMERKING: EIC/XIC biedt de optimale signaal/ruisverhouding (S/N), in het algemeen, onder de bovengenoemde formaten van elektroferogrammen. Het is opmerkelijk dat zelfs bij afwezigheid van instrumentele vooroordelen, terwijl UV-absorptie evenredig is met de massaconcentratie van eiwitten, het MS-signaal evenredig is met de molaire concentratie. Daarom is het redelijk om verschillen in piekpatronen tussen CE- en MS-afgeleide elektroferogrammen waar te nemen.
    2. Gebruik het gebied onder de curve (AUC) van de pieken die in de elektroferogrammen worden weergegeven voor semi-kwantificering. Gebruik voor monsters met eiwitcomplexen de eerder beschreven aanpak17 om de massaconcentratiegegevens af te leiden uit de TIC/EIC-elektroferogrammen.
  2. Analyse van ms-gegevens
    1. Verkrijg de MS1- en MS2-spectra door de MS1- en MS2-scans te combineren die respectievelijk binnen de overeenkomstige elutievensters zijn verkregen.
    2. Bepaal de massa's van het intacte eiwit (M (intact eiwit)) en fragmenten met een van de volgende twee methoden.
      1. Bereken de gemiddelde massa's van de ionen die aanleiding geven tot de isotopisch opgeloste signaalclusters.
      2. Gebruik het midden van de Gauss-achtige krommen die het gevolg zijn van de aanpassing van de overeenkomstige isotopische enveloppen6.
    3. Gebruik software zoals Biopharma Finder, ProSight18 of MASH Suite19 om de massalijst van de fragmentionen te genereren en te identificeren.
  3. Analyse van HDX-gegevens
    1. Bepaal het totale deuteratieniveau van een intacte eiwitsoort met behulp van vergelijking (2).
      figure-protocol-4 (2)
      waarbij M (2H) of M (1H) atoomgewichten van 2H of 1H zijn. Het sterretje geeft de gegevens van de steekproef met 2H-labels aan.
    2. Bepaal de cumulatieve bescherming of cumulatieve deuteratie van backbone-amiden van een specifiek segment.
      1. Gebruik voor gegevens die zijn verkregen met een gedeutereerde modifieroplossing vergelijkingen (3) en (4) om het cumulatieve beschermingsniveau te bepalen.
        figure-protocol-5 (3)
        figure-protocol-6 (4)
        Waarbij P(Sk(N)) de totale bescherming is van het N-eindsegment dat residuen van 1 tot en met k omvat, P(Sm(C)) de totale bescherming van het C-eindsegment dat bestaat uit m residuen, M (2H) of M (1H) atoomgewichten van 2H of 1H zijn en M (ci) of M (zi) de molecuulgewichten van ci - of zi-ionen .
        OPMERKING: Het dubbele sterretje geeft de gegevens van het HDX-voorbeeld van het "eindpunt" aan.
      2. Gebruik voor gegevens die zijn verkregen met een niet-gedeutereerde modifieroplossing vergelijkingen (5) en (6) om het cumulatieve deuteratieniveau te bepalen.
        figure-protocol-7 (5)
        figure-protocol-8 (6)
        waarbij D(Sk(N)) de cumulatieve deuteriumopname is van het N-terminale segment dat residuen van 1 tot en met k omvat; D(Sm(C)) = de cumulatieve deuteriumopname van het C-terminale segment dat m-residuen omvat.
    3. Bepaal het deuteratieniveau bij een lokale backbone-amidegroep
      1. Gebruik voor gegevens die zijn verkregen met een gedeutereerde modifieroplossing vergelijkingen (7), (8), (9), (10) en (11) om het lokale beschermingsniveau te bepalen.
        voor gegevens afgeleid van c-ionen
        figure-protocol-9 (7)
        voor gegevens afgeleid van z-ionen
        figure-protocol-10 (8)
        Waarbij P(Ri) de bescherming is van een ruggengraatamide bij residu i, en het subscript "totaal" het totale residunummer van het eiwit aanduidt.
        Voor residuplaatsen waar latere fragmentionen ontbraken, wijst u P(Ri) toe met behulp van vergelijkingen (9) en (10).
        voor gegevens afgeleid van c-ionen
        figure-protocol-11 (9)
        voor gegevens afgeleid van z-ionen
        figure-protocol-12 (10)
        Bepaal vervolgens het deuteratieniveau D(Ri) bij een lokale backbone-amidegroep met behulp van vergelijking (11).
        figure-protocol-13(11)
      2. Gebruik voor gegevens die zijn verkregen met een niet-gedeutereerde modifieroplossing vergelijkingen (12), (13), (14) en (15) om het lokale beschermingsniveau te bepalen.
        voor gegevens afgeleid van c-ionen
        figure-protocol-14(12)
        voor gegevens afgeleid van z-ionen
        figure-protocol-15(13)
        Waarbij D(Ri) de bescherming is van een ruggengraatamide bij residu i, en het subscript "totaal" het totale residunummer van het eiwit aanduidt.
        Voor residuplaatsen waar latere fragmentionen ontbraken, wijst u D(Ri) toe met behulp van vergelijkingen (14) en (15).
        voor gegevens afgeleid van c-ionen
        figure-protocol-16 (14)
        voor gegevens afgeleid van z-ionen
        figure-protocol-17 (15)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het veranderen van de infusiedruk van BGE maakt het mogelijk om zowel de scheidingsefficiëntie als de migratietijd aan te passen, wat overeenkomt met de HDX-reactietijd van de te scheiden eiwitten (figuur 3). Een lagere infusiedruk resulteert in een betere scheiding van CE-pieken ten koste van de duur van het experiment (figuur 3A). Een langere migratie/HDX-reactietijd resulteert in een hogere mate van deuteratie van de eiwitanalyten (figuur...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De doelstellingen van het coaten van de binnenwand van het CE-capillair omvatten het minimaliseren van de elektroosmotische stroom en eiwitabsorptie tijdens het CE-proces13. Hoewel elektroosmotische stroming gunstig is voor conventionele CE-analyse van kleine moleculen vanwege het vermogen om neutrale of tegengesteld geladen soorten naar de detector te rijden, brengt het de scheidingsefficiëntie van eiwitsoorten met vergelijkbare groottes en nettoladingen in oplossing in gevaar. Het coaten van het...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

D. D. Y. Chen is een van de oprichters van het Knowledge for Health Institute for Biomolecules, dat de doorstroom microviale CE-MS-interface commercialiseert. Andere auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). De auteurs kregen ook steun van het Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, China; Jiangsu Collaborative Innovation Center van Biomedische Functionele Materialen; en Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials aan de Nanjing Normal University, China.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ammoniumacetaatFisher ChemicalA/3446/50≥99%
CESI 8000 plus capillaire elektroforese systeemSciex, USA
centrifugeEppendorf5406000097
centrifugaalfilterMerckUFC20102410 kDa cutoff
deuteriumoxideEnergy ChemicalE09000199,9 % D
mierenzuurAcros Organics 270480250
glas capillair van gesmolten silicaPolymicro Technologies1068150017ID 50μm, OD 360μm
gaschromatografieAgilentGC6890N
zoutezuurSigma Aldrich258148
hydroxypropylcelluloseAladdinH113415MW 100000
magnetische roerdersDLAB8030101212
methanolFisher ChemicalA456-4MS-kwaliteit
microvolume UV-Vis spectrofotometerDeNovix84677JK7731
myoglobineSigma AldrichM1882
Orbitrap Fusion Lumos massaspectrometerThermo Fisher Scientific, USA
PA 800 Plus farmaceutische analyse CE-systeemBeckman Coulter, USA
Q Exactive UHMR massaspectrometerThermo Fisher Scientific, Duitsland
natriumhydroxideSigma AldrichS5881
ubiquitineSigma AldrichU6253
ultrasone apparatuurSCIENTZSB-5200
β-lactoglobulineSigma AldrichL0130

Referenties

  1. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169(2020).
  2. Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
  3. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
  4. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).
  5. Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
  6. Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
  7. Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
  8. Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
  9. Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
  10. Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).
  11. Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
  12. Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
  13. Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
  14. Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
  15. Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille's law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
  16. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  17. Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
  18. Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
  19. Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
  20. Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
  21. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  22. Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
  23. Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173(2019).
  24. Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
  25. Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

EiwitconformatieEiwittherapeuticaElektroforetische ScheidingDeuteriummarkeringElectrospray ionisatieEiwitvariantenFragmentionanalyse

Gerelateerde artikelen