Method Article

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

DOI:

10.3791/62813

⸱

July 16th, 2021

 ,  ,  , 
1Jefferson Weinberg ALS Center, Thomas Jefferson University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vóór neuronale degeneratie is de oorzaak van motorische en cognitieve tekorten bij patiënten met amyotrofische laterale sclerose (ALS) en /of frontotemporale kwabdementie (FTLD) disfunctie van communicatie tussen neuronen en motorneuronen en spieren. Het onderliggende proces van synaptische transmissie omvat membraandepolarisatie-afhankelijke synaptische blaasjesfusie en de afgifte van neurotransmitters in de synaps. Dit proces vindt plaats door gelokaliseerde calciuminstroom in de presynaptische terminals waar synaptische blaasjes zich bevinden. Hier beschrijft het protocol op fluorescentie gebaseerde live-imaging-methodologieën die op betrouwbare wijze depolarisatie-gemedieerde synaptische blaasjesexocytose en presynaptische terminale calciuminstroomdynamiek in gekweekte neuronen rapporteren.

Met behulp van een styrylkleurstof die is opgenomen in synaptische blaasvliezen, wordt de afgifte van synaptische blaasjes opgehelderd. Aan de andere kant, om calciuminvoer te bestuderen, wordt Gcamp6m gebruikt, een genetisch gecodeerde fluorescerende verslaggever. We gebruiken hoge kaliumchloride-gemedieerde depolarisatie om neuronale activiteit na te bootsen. Om synaptische blaasjesexocytose ondubbelzinnig te kwantificeren, meten we het verlies van genormaliseerde styrylkleurstoffluorescentie als functie van de tijd. Onder vergelijkbare stimulatieomstandigheden, in het geval van calciuminstroom, neemt de fluorescentie van Gcamp6m toe. Normalisatie en kwantificering van deze fluorescentieverandering worden op dezelfde manier uitgevoerd als het styrylkleurstofprotocol. Deze methoden kunnen worden gemultiplext met transfectie-gebaseerde overexpressie van fluorescerend gelabelde mutante eiwitten. Deze protocollen zijn uitgebreid gebruikt om synaptische disfunctie te bestuderen in modellen van FUS-ALS en C9ORF72-ALS, met behulp van primaire knaagdier corticale en motorische neuronen. Deze protocollen maken gemakkelijk een snelle screening van verbindingen mogelijk die de neuronale communicatie kunnen verbeteren. Als zodanig zijn deze methoden niet alleen waardevol voor de studie van ALS, maar voor alle gebieden van neurodegeneratief en ontwikkelingsneurowetenschappelijk onderzoek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het modelleren van amyotrofische laterale sclerose (ALS) in het laboratorium wordt uniek uitdagend gemaakt vanwege de overweldigend sporadische aard van meer dan 80% van de gevallen1, in combinatie met het enorme aantal genetische mutaties waarvan bekend is dat ze ziekteveroorzakend zijn2. Desondanks delen alle gevallen van ALS het verenigende kenmerk dat er vóór regelrechte neuronale degeneratie disfunctionele communicatie is tussen presynaptische motorneuronen en postsynaptische spiercellen3,4. Klinisch gezien, als patiënten de connectiviteit van de resterende bovenste en onderste motorneuronen verliezen, presenteren ze zich met kenmerken van neuronale hyper- en hypoexcitabiliteit gedurende de ziekte5,6,7,8,9, als gevolg van complexe onderliggende moleculaire veranderingen in deze synapsen, die wij, als ALS-onderzoekers, proberen te begrijpen.

Meerdere transgene modellen hebben aangetoond dat verslechtering en desorganisatie van de neuromusculaire junctie optreden met de expressie van ALS-oorzakelijke genetische mutaties, waaronder SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 en TDP4317,18,19 door morfologische beoordelingen, waaronder evaluatie van synaptische boutons, wervelkolomdichtheden en pre / postsynaptische organisatie. Mechanistisch gezien, sinds de baanbrekende artikelen van Cole, Hodgkin en Huxley in de jaren 1930, is het ook mogelijk geweest om synaptische reacties te evalueren door middel van elektrofysiologische technieken in in vitro celkweek of weefselschijfpreparaten20. Door deze strategieën hebben veel modellen van ALS synaptische transmissietekorten aangetoond. Een gemuteerde variant van TDP43 veroorzaakt bijvoorbeeld een verhoogde vuurfrequentie en verlaagt de actiepotentiaaldrempel in NSC-34 (ruggenmerg x neuroblastoom hybride cellijn 34) motorneuronachtige cellen21. Deze zelfde variant veroorzaakt ook disfunctionele synaptische transmissie op de neuromusculaire junctie (NMJ) vóór het begin van gedragsmotorische tekorten in een muismodel22. Eerder werd aangetoond dat mutante FUS-expressie resulteert in verminderde synaptische transmissie bij de NMJ in een drosophila-model van FUS-ALS vóór locomotorische defecten11. Een recent rapport met geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van C9orf72-expansiedragers onthulde een vermindering van de gemakkelijk vrij te geven pool van synaptische blaasjes23. Al met al benadrukken deze studies en andere het belang van het opbouwen van een uitgebreider begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan synaptische signalering in ziekterelevante modellen van ALS. Dit zal cruciaal zijn in het begrijpen van de pathobiologie van ALS en het ontwikkelen van potentiële therapeutische doelen voor patiënten.

Methoden van stroom- en spanningsklemcellen zijn van onschatbare waarde geweest bij het bepalen van membraaneigenschappen zoals geleiding, rustmembraanpotentiaal en kwantitatief gehalte van individuele synapsen20,24. Een van de belangrijkste beperkingen van elektrofysiologie is echter dat het technisch uitdagend is en slechts inzichten biedt van een enkel neuron tegelijk. Live-cell confocale microscopie, gekoppeld aan specifieke fluorescerende probes, biedt de mogelijkheid om de synaptische transmissie van neuronen op een spatiotemporale manier te onderzoeken25,26,27. Hoewel het geen directe maat is voor neuronale prikkelbaarheid, kan deze fluorescentiebenadering een relatieve meting bieden van twee moleculaire correlaties van synaptische functie: synaptische blaasjesafgifte en calciumtransiënten op synaptische terminals.

Wanneer een actiepotentiaal het presynaptische terminale gebied van neuronen bereikt, worden calciumtransiënten geactiveerd, waardoor de overgang van een elektrisch signaal naar het proces van afgifte van neurotransmitters wordt vergemakkelijkt28. Spanningsafhankelijke calciumkanalen gelokaliseerd in deze gebieden reguleren de calciumsignalering strak om de kinetiek van de afgifte van neurotransmitters te moduleren29. De eerste gerapporteerde fluorescentie-gebaseerde opnames van calciumtransiënten werden uitgevoerd met behulp van de dual-golflengte indicator Fura-2 AM of de single golflengte kleurstof Fluo-3 AM30,31,32. Hoewel deze kleurstoffen destijds veel nieuw inzicht boden, lijden ze aan verschillende beperkingen, zoals niet-specifieke compartimentering in cellen, actief of passief kleurstofverlies van gelabelde cellen, fotobleeken en toxiciteit als ze gedurende langere tijd worden afgebeeld33. In het afgelopen decennium zijn genetisch gecodeerde calciumindicatoren de werkpaarden geworden voor het in beeld brengen van verschillende vormen van neuronale activiteit. Deze indicatoren combineren een gemodificeerd fluorescerend eiwit met een calciumchelatoreiwit dat snel van fluorescentie-intensiteit wisselt na de binding van Ca2+ ionen34. De toepassing van deze nieuwe indicatoren is enorm, waardoor een veel eenvoudigere visualisatie van intracellulaire calciumtransiënten mogelijk is, zowel in vitro als in vivo instellingen. Een familie van deze genetisch gecodeerde verslaggevers, bekend als GCaMP, wordt nu op grote schaal gebruikt. Deze indicatoren bevatten een C-terminaal calmodulin-domein, gevolgd door groen fluorescerend eiwit (GFP), en worden afgetopt door een N-terminaal calmodulin-bindend gebied35,36. Calciumbinding aan het calmodulinedomein veroorzaakt een interactie met het calmoduline-bindende gebied, wat resulteert in een conformationele verandering in de algehele eiwitstructuur en een aanzienlijke toename van de fluorescentie van het GFP-deel35,36. In de loop der jaren heeft deze familie van verslaggevers verschillende evoluties ondergaan om verschillende uitlezingen mogelijk te maken voor bepaalde calciumtransiënten met specifieke kinetiek (langzaam, gemiddeld en snel), elk met enigszins verschillende eigenschappen37,38. Hier is het gebruik van de reporter GcaMP6 benadrukt, waarvan eerder is aangetoond dat het enkelvoudige actiepotentialen en dendritische calciumtransiënten detecteert in neuronen, zowel in vivo als in vitro37.

Calciumtransiënten in het presynaptische gebied veroorzaken synaptische blaasjesfusiegebeurtenissen, waardoor neurotransmitterafgifte in de synaps en initiatie van signaleringsgebeurtenissen in de postsynaptische cel worden veroorzaakt28,39. Synaptische blaasjes worden zowel snel vrijgegeven als gerecycled, omdat de cel homeostatisch een stabiel celmembraanoppervlak en gemakkelijk vrij te geven pool van fusie-capabele membraangebonden blaasjes onderhoudt40. De hier gebruikte styrylkleurstof heeft een affiniteit met lipidemembranen en verandert specifiek de emissie-eigenschappen op basis van de ordening van de omringende lipideomgeving41,42. Het is dus een ideaal hulpmiddel voor het labelen van het recyclen van synaptische blaasjes en het volgen van deze blaasjes als ze later worden vrijgegeven na neuronale stimulatie41,42. Het protocol dat is gegenereerd en geoptimaliseerd is een aanpassing van de concepten die aanvankelijk door Gaffield en collega's zijn beschreven, waardoor we in de loop van de tijd continu styryl dye-gelabelde synaptische vesicle puncta kunnen visualiseren41.

Hier worden twee gerelateerde op fluorescentie gebaseerde methodologieën beschreven, die op betrouwbare wijze specifieke cellulaire gebeurtenissen rapporteren die betrokken zijn bij synaptische transmissie. Protocollen zijn gedefinieerd om de dynamiek van depolarisatie-gemedieerde presynaptische terminale calciuminstroom en synaptische blaasjesexocytose in gekweekte neuronen te onderzoeken. Hier zijn methoden en representatieve resultaten gericht op het gebruik van primaire knaagdiercorticale of motorneuronen als het in vitro modelsysteem, zoals er gepubliceerde studies zijn met behulp van deze celtypen43,44. Deze methoden zijn echter ook van toepassing op gedifferentieerde menselijke i3 corticale neuronen45, omdat we ook succes hebben gehad met beide protocollen in de momenteel lopende experimenten in ons laboratorium. Het algemene protocol wordt geschetst in een stapsgewijs lineair formaat, weergegeven in figuur 1. Kortom, om de calciumdynamiek in neurieten te bestuderen, worden volwassen neuronen getransfecteerd met plasmide-DNA om de fluorescerende reporter GCaMP6m tot expressie te brengen onder een Cytomegalovirus (CMV) promotor37,46. Getransfecteerde cellen hebben een laag niveau van basale groene fluorescentie, die toeneemt in de aanwezigheid van calcium. Regio's van belang worden gespecificeerd om fluorescentieveranderingen tijdens onze manipulatie te volgen. Hierdoor kunnen sterk ruimtelijk en temporeel gelokaliseerde fluctuaties in calcium worden gemeten37,46. Voor het evalueren van synaptische vesikelfusie en -afgifte worden volwassen neuronen geladen met styrylkleurstof die is opgenomen in synaptische blaaskelmembranen terwijl ze worden gerecycled, hervormd en opnieuw geladen met neurotransmitters in presynaptische cellen41,42,43,47,48. De huidige kleurstoffen die voor dit doel worden gebruikt, labelen synaptische blaasjes langs neurieten en worden gebruikt als een proxy voor deze regio's in live-imaging-experimenten, zoals werd aangetoond door co-kleuring van styrylkleurstof en synaptotagmin door Kraszewski en collega's49. Hier zijn representatieve afbeeldingen van vergelijkbare kleuringen opgenomen die ook zijn uitgevoerd (figuur 2A). Eerdere onderzoekers hebben dergelijke kleurstoffen uitgebreid gebruikt om synaptische blaasjesdynamica op de neuromusculaire kruising en hippocampale neuronen te rapporteren48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Door punctategebieden van met kleurstof beladen blaasjes te selecteren en door de afname van de fluorescentie-intensiteit na afgifte van het blaasje te monitoren, kunnen de functionele synaptische transmissiecapaciteit en de temporele dynamiek van afgifte na stimulatie worden bestudeerd43. Voor beide methoden wordt een medium met een hoge concentratie kaliumchloride gebruikt om cellen te depolariseren om neuronale activiteit na te bootsen. Beeldparameters worden gespecificeerd om intervallen van minder dan een seconde vast te leggen die een basislijnnormalisatie omvatten, gevolgd door onze stimulatie-opnameperiode. Fluorescentiemetingen op elk tijdstip worden bepaald, genormaliseerd naar de achtergrond en gekwantificeerd over de experimentele periode. Calciuminstroom gemedieerde GCaMP6m fluorescentie toename of effectieve synaptische vesikel exocytose styryl kleurstof afgifte fluorescentie afname kan worden gedetecteerd door middel van deze strategie. Gedetailleerde methodologische instellingen en parameters voor deze twee protocollen en een discussie over hun voordelen en beperkingen worden hieronder beschreven.

figure-introduction-1
Figuur 1: Visuele weergave van het algemene protocolproces. (1) Isoleer en kweek primaire knaagdierneuronen in vitro tot het gekozen rijpingstijdpunt. (2) Introduceer GCaMP DNA of styrylkleurstof als verslaggevers van synaptische activiteit. (3) Stel het beeldvormingsparadigma in met behulp van live-imaging uitgeruste confocale microscoop en bijbehorende software. Begin de registratieperiode van de basislijn. (4) Terwijl cellen nog steeds live-image capture ondergaan, stimuleren neuronen via hoge KCl-badperfusie. (5) Beoordeel fluorescentie-intensiteitsmetingen in de loop van de tijd om calciumtransiënten of synaptische blaasjesfusie te meten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprocedures die in deze studie werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Jefferson University.

1. Primaire kweek van neuronen uit de embryonale rattenschors

OPMERKING: Primaire corticale neuronen worden geïsoleerd uit E17.5 rattenembryo's zoals eerder beschreven57,58. Er lijkt geen strain bias te bestaan met het succes van dit kweekprotocol. Deze methode wordt hieronder kort beschreven. De vorige aangegeven artikelen moeten worden vermeld voor volledige details.

  1. Euthanaseer zwangere vrouwelijke ratten door CO2-inhalatie gevolgd door secundaire bevestiging door cervicale dislocatie.
  2. Oogst embryo's en isoleer de hersenen in ijskoude 20 mM HEPES-gebufferde Hank's balanced salt solution (HBSS). Van de buitenste cortexschaal, scheiden en vervolgens striatum en hippocampi weggooien. Verzamel cortices.
  3. Gebruik een fijne tang om hersenvliezen uit cortices te verwijderen. Om dit te doen, houdt u de cortex op zijn plaats met één paar gesloten tangen met zachte druk.
    OPMERKING: Met het tweede paar tang in de tweede hand, knijp hersenvliezen. Pel hersenvliezen weg met rollende beweging met geknepen paar. Verplaats met de gesloten tang en herhaal indien nodig totdat de hersenvliezen volledig zijn verwijderd.
  4. Incubeer cortices met 10 μg/ml papaïne in HBSS gedurende 4 minuten bij 37 °C.
  5. Was drie keer in HBSS en trituraleer vervolgens 5-10 keer voorzichtig met een vuurgepolijste glazen Pasteur-pipet om een homogene celsuspensie te verkrijgen.
    OPMERKING: Vermijd bubbels; de pipet in de celsuspensie te houden.
  6. Plaatneuronen op 100 μg / ml poly-D-lysine gecoate 35 mm glazen bodemschalen met een dichtheid van 75.000 cellen / schotel in neurobasaal medium met B27-supplement (2%) en penicilline-streptomycine.

2. Primaire kweek van motorneuronen uit het ruggenmerg van embryonale ratten

OPMERKING: Primaire motorneuronen worden bereid uit E13.5 rattenembryo's zoals eerder beschreven, met weinig wijzigingen59,60. Er lijkt geen strain bias te bestaan met het succes van dit kweekprotocol. Deze methode wordt hieronder kort beschreven. Naar de voorgaande artikelen moet worden verwezen voor volledige details.

  1. Euthanaseer zwangere vrouwelijke ratten zoals in stap 1.1.
  2. Ontleed 10-20 ruggenmerg van embryo's en breek mechanisch in kleine fragmenten met behulp van twee paar tangen om respectievelijk te knijpen en te trekken.
  3. Incubeer in 0,025% trypsine gedurende 8 minuten, gevolgd door toevoeging van DNase bij 1 mg/ml.
  4. Centrifugeer door een 4% w/v BSA-kussen bij 470 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C zonder onderbreking.
  5. Centrifugeer gepelletiseerde cellen gedurende 55 minuten bij 830 x g bij 4 °C zonder rem door een 10,4% (v/v) dichtheidsgradiëntmedium (zie materiaaltabel). Draag de motorneuronenband voort op de visuele interface.
    OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat alle cellen worden vastgelegd, gebruikt u fenolvrije media voor de dichtheidsgradiëntstap en fenolbevattende media voor alle andere stappen. De interface van het dichtheidsverloop en de dissociatiemedia is gemakkelijk te herkennen op basis van het kleurverschil.
  6. Draai verzamelde banden door nog eens 4% w/v BSA-kussen bij 470 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C zonder onderbreking.
  7. Resuspend gezuiverde motorneuronen in volledig neurobasaal medium met B27 supplement (2%), glutamine (0,25%), 2-mercaptoethanol (0,1%), paardenserum (2%), en penicilline-streptomycine.
  8. Plaatneuronen op 100 μg/ml poly-lysine en 3 μg/ml laminine-gecoate coverslips met een dichtheid van 50.000 cellen/35 mm glasbodemschaal.

3. Neuronale transfecties

OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd voor neuronen die GCaMP-calciumbeeldvorming zullen ondergaan en / of neuronen waarin een exogene DNA-plasmide of RNA van belang wordt geïntroduceerd voorafgaand aan synaptische evaluatie. Styrylkleurstof wordt daarentegen vlak voor de beeldvormingssessie geladen en wordt behandeld in rubriek 6. De onderstaande samenvatting is het transfectieprotocol dat wordt gebruikt voor primaire knaagdierneuronen in de gepresenteerde voorbeelden, maar het kan gemakkelijk worden aangepast en geoptimaliseerd aan de behoeften van de gebruiker.

  1. Transfecties voor gekweekte primaire corticale neuronen treden op op dag 12 in vitro (DIV 12), terwijl motorneuronen op dag 7 in vitro worden getransfecteerd (DIV 7).
    OPMERKING: Alle volgende stappen vinden plaats in een aseptische bioveiligheidskast.
  2. Transfecteer 500 ng GCaMP6m met transfectiereagens in een volumeverhouding van 1:2. Voeg voor co-transfecties in totaal 1,25 μg totaal DNA/schotel toe, met behoud van deze VERHOUDING DNA en reagens.
    OPMERKING: In de getoonde experimentele voorbeelden is 750 ng ALS/FTD-gerelateerd plasmide van belang getransfecteerd om C9orf72-ALS-gebonden dipeptiden, mutant FUS-eiwit, enz. tot expressie te brengen. Zorg ervoor dat de fluorescerende tag van het co-getransfecteerde plasmide niet conflicteert met het FITC-kanaal van GCaMP-beeldvorming. Evenzo, als u styrylkleurstofbeeldvorming uitvoert, zorg er dan voor dat het co-getransfecteerde plasmide niet conflicteert met het TRITC-kanaal van beeldvorming. Het gebruik van synaptophysin-GCaMP3 is even effectief in dit protocol. Transfecteer daarom dezelfde hoeveelheid van dit plasmide en volg alle stappen zoals gewoonlijk in rubriek 7.
  3. Incubeer het DNA-transfectiereagenscomplex bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
  4. Voeg het geïncubeerde complex voorzichtig druppelsgewijs toe aan neuronen met werveling. Breng de schaal terug naar de CO2-incubator bij 37 °C gedurende 45-60 min.
  5. Verwijder het volledige kweekmedium dat het DNA-transfectiereagenscomplex bevat en vervang het door een 50-50 door volumepreparaat van voorgeconditioneerde en verse neuronale media. Plaats vervolgens cellen terug in de CO2-incubator gedurende 48 uur totdat ze worden afgebeeld.

4. Bereiding van bufferoplossingen en styrylkleurstofvoorraadoplossing

  1. Maak lage en hoge aCSF-oplossingen vers voordat u de beeldvorming gebruikt met behulp van de ingrediënten in tabel 1. Filter beide bufferoplossingen voor gebruik.
    OPMERKING: CaCl2 dihydraat kan Ca(OH)2 vormen bij opslag. Gebruik voor maximale werkzaamheid altijd een recent geopende container. Als dit niet mogelijk is, om Ca(OH)2 van het buitenoppervlak te verwijderen en maximale oplosbaarheid te garanderen, mogen oplossingen gedurende 5 minuten vóór toevoeging van CaCl2 koolzuurhoudend worden gemaakt met gasvormig CO2 . Als deze stap wordt genomen, past u de pH van de resulterende oplossing aan om een pH-waarde van 7,4 te behouden, omdat overmatige carbonatatie zal resulteren in Ca (HCO3) 2-vorming .
Lage KCL aCSF buffer (pH 7,40 tot 7,45)
ReagensConcentratie
Hepes10 meter
NaCl140m
Kcl5 meter
Glucose10 meter
CaCl2 2H2O2 meter
MgCl2 4H2O1mm
Hoge KCL aCSF buffer (pH 7,40 tot 7,45)
ReagensConcentratie
Hepes10 meter
NaCl95 meter
Kcl50 meter
Glucose10 meter
CaCl2 2H2O2 meter
MgCl2 4H2O1mm

Tabel 1: Samenstelling van kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) buffers. Deze tabel bevat de ingrediënten voor het bereiden van lage en hoge KCl kunstmatige cerebrospinale vloeistofbuffers die worden gebruikt bij het afbeelden en stimuleren van neuronen. Zie rubriek 4 voor bereidingsinstructies.

  1. Bereid styryl dye stock-oplossing door een injectieflacon van 100 μg kleurstof te nemen en deze te reconstitueren tot een voorraadconcentratie van 10 mM met gedestilleerd water of neurobasaal medium.

5. Microscoop en perfusiesysteem instellen

OPMERKING: Voor het afbeelden van petrischalen met glazen bodem heeft een omgekeerde confocale fluorescentiemicroscoop de voorkeur vanwege de flexibiliteit van perfusie en voor het gebruik van een olie-onderdompelingsobjectief met een hoog numeriek diafragma. Raadpleeg de tabel met materialen voor de confocale microscoop, camera en objectieven die worden gebruikt voor het afbeelden van voorbeelden die worden beschreven in de sectie Representatieve resultaten .

  1. Voer alle experimenten uit bij 37 °C met constante 5% CO2-niveaus met behulp van een incubatorsysteem-gekoppelde stage mount.
  2. Beheer beeldacquisitie met behulp van confocale software. Optimaliseer acquisitie-instellingen aan het begin van de beeldvormingssessie om excitatievermogen en versterking te kiezen om optimale visualisatie van signalen zonder fotobleaching te garanderen.
    1. Houd het excitatievermogen, de belichtingstijd, de detectorwinst en de framesnelheid constant voor alle monsters. Voer time-lapse-beeldvorming uit met een beeldverhouding van 512 x 512 en een framesnelheid van 2 afbeeldingen / s om kleurverbleking te minimaliseren.
      OPMERKING: Hoewel puncta duidelijk zichtbaar moet zijn, moet de laserintensiteit zo laag mogelijk worden ingesteld om bleken en fototoxiciteit te voorkomen. Stel het confocale diafragma in op de smalste instelling om een optimale resolutie van fluorescerende puncta in neurieten te bereiken. De belichtingstijd is ingesteld op 200 ms of minder, consistent voor alle monsters. De maximale beeldsnelheid van de gebruikte camera was 2 beelden/s. Bij gebruik van een snellere camera kunnen er meer foto's worden gemaakt. Indien mogelijk moeten temporele beeldvormingsinstellingen worden gekozen.
  3. Selecteer de volgende fluorescentie-excitatie/dichroïcum/emissiefiltercombinaties voor beeldvorming met behulp van confocale software: Gcamp6m/Gcamp3 met RESPECTIEVELIJK FITC en styrylkleurstof met TRITC.
  4. Gebruik de perfecte focusfunctie van de confocale imaging acquisition software tijdens time-lapse imaging om z-drift te voorkomen.
    OPMERKING: Vanwege de hoge snelheid van beeldvorming wordt een enkel vlak in beeld gebracht. Het is erg belangrijk om het ontbreken van z-drift tijdens het experiment te waarborgen.
  5. Selecteer het tabblad Tijd in het deelvenster voor het verwerven van afbeeldingen om de opnameperioden en -intervallen in te stellen.
    1. Stel fase # 1 in op interval 500 ms, duur 3 - 5 min.
    2. Stel fase # 2 in op interval 500 ms, duur 5 min.
      OPMERKING: Fase #1 komt overeen met baseline opname, Fase #2 met de stimulatieperiode, respectievelijk.
  6. Monteer zwaartekrachtperfusieapparatuur voor aCSF met behulp van een klepregelsysteem en een kanaalspruitstuk.
    1. Laad hoge KCl (zie tabel 1) in een spuit van 50 ml aan de bovenkant van het apparaat, met slangen die door het systeem lopen. Stel het debiet in op 1 ml/min.
  7. Plaats een glazen schaal van 35 mm met neuronen op het confocale beeldvormingsstadium, waarbij het uiteinde van de perfusieslang aan de rand van de schotel wordt geplaatst. Kies het veld voor beeldvorming.

6. Styryl kleurstof beeldvorming van synaptische vesikel release

  1. Incubeer cellen in lage KCl aCSF (zie tabel 1) gedurende 10 min bij 37 °C, 48 uur na transfectie.
  2. Laad primaire corticale of motorneuronen op petrischalen met glazen bodem met styrylkleurstof.
    1. Verwijder lage KCl aCSF door aspiratie.
    2. Gebruik een pipet om neuronen in het donker te laden met 10 μM styrylkleurstof in aCSF met 50 mM KCl gedurende 5 minuten.
    3. Verwijder de beladingsoplossing en bad neuronen in lage KCl aCSF gedurende 10 minuten om niet-specifieke kleurstofbelasting te elimineren.
  3. Plaats de 35 mm glazen bodemschaal op het beeldvormingsstadium en observeer vervolgens onder een 20x luchtobjectief of 40x olie-onderdompelingsobjectief van een omgekeerde confocale microscoop.
    OPMERKING: Gebruik GFP-fluorescentie om getransfecteerde cellen te lokaliseren in het geval van cellen die co-getransfecteerd zijn met een GFP-gelabeld plasmide.
  4. Exciteer styrylkleurstof met behulp van een 546 nm laser, verzamel emissie met behulp van een 630-730 nm (TRITC) bandpassfilter.
  5. Selecteer het beeldvormende veld en stel perfect scherp. Maak vervolgens een enkel stilstaand beeld met brightfield-, TRITC- en fluorescentiemarkerkanalen om neuronale grenzen te markeren.
  6. Start Run Now in de acquisitiesoftware. Voer de basale opname gedurende 3-5 minuten uit om variaties in kleurstofintensiteit uit te sluiten, indien aanwezig (fase # 1).
    OPMERKING: Het is essentieel om ervoor te zorgen dat elke afname van de kleurstofintensiteit te wijten is aan het vrijkomen van synaptische blaasjes en niet aan passieve kleurstofdiffusie of fotobleaching. Deze 3-5 minuten durende pre-stimulatieperiode zou moeten resulteren in een stabiel en gehandhaafd kleurintensiteitsniveau. De laatste 30 s van deze registratie zullen worden gebruikt om een gemiddelde basislijn fluorescentiewaarde voor elke ROI te bepalen. Alvorens experimentele omstandigheden te evalueren, kan ook een extra niet-stimulatieconditie van ongeveer 10 minuten continue opname met behulp van de beoogde acquisitie-instellingen worden uitgevoerd om stabiele fluorescentiewaarden te garanderen met behulp van de laserinstellingen gedurende een langere periode.
  7. Bij de schakelaar naar fase #2 activeert u op de knop voor het perfusiesysteem. Laat vervolgens constant 50 mM KCl doordrenken naar neuronen om het lossen van kleurstof te vergemakkelijken (fase # 2).
    1. Voer opnames uit voor 300 s na KCl-toevoeging. Hierna stopt de acquisitie; activeer de uitschakelaar voor het perfusiesysteem.
  8. Sla het experiment op en analyseer gegevens met behulp van confocale software zoals beschreven in sectie 8 hieronder.
    OPMERKING: Het experiment kan op dit punt worden gestopt en de analyse kan later worden uitgevoerd. In het geval dat cellen geen transfectie nodig hebben voor de expressie van eiwitten van belang, kan dit protocol op elk moment in vitro worden uitgevoerd wanneer wordt geprobeerd de functionaliteit van synaptische ontlading te onderzoeken. Na een test van controlecellen om een goede synaptische ontlading te garanderen, moet de experimentator blind worden gemaakt voor de genetische of farmacologische omstandigheden van elke geteste schotel om vertekening te minimaliseren.

7. Fluorescentie beeldvorming van Gcamp6m calciumtransiënten

  1. Transfect primaire knaagdier corticale neuronen gekweekt op 35 mm glazen bodemschalen met 500 ng Gcamp6m zoals aangegeven in rubriek 3.
    OPMERKING: Indien gewenst, co-transfect neuronen met een plasmide van belang met een fluorescerende tag in het rode of ver-rode bereik.
  2. Incubeer neuronen met een lage KCl aCSF gedurende 15 min 48 h na transfectie en monteer vervolgens de schotel op het beeldvormingsplatform.
  3. Visualiseer GCaMP6m-fluorescentie met behulp van een FITC-filter (488 nm) en een 20x- of 40x-objectief.
  4. Selecteer het beeldvormende veld en stel perfect scherp. Neem vervolgens een enkel stilstaand beeld met brightfield-, FITC- en fluorescentiemarkerkanalen om neuronale grenzen te markeren.
  5. Start Run Now in de acquisitiesoftware. Voer de nulmeting gedurende 5 minuten uit en perfuseer vervolgens met aCSF die 50 mM KCL bevat op dezelfde manier als beschreven in rubriek 6 voor styrylkleurstofexperimenten.
    OPMERKING: Het doel van deze beeldvorming is het meten van geëvoceerde calciumtransiënten. Als een neuron basale vuuractiviteit en calciumfluxen heeft tijdens de pre-stimulatieperiode, wordt het niet gebruikt in data-analyse. In plaats daarvan worden alleen cellen met stabiele achtergrondfluorescentie gebruikt. Poststimulatieperioden kunnen ook worden verlengd tot 60 minuten voor calciumtransiënten, met of zonder extra continue hoge KCl-perfusie.
  6. Sla het experiment op en analyseer gegevens met behulp van confocale software zoals beschreven in sectie 8 hieronder. Het experiment kan op dit punt worden gestopt en de analyse kan later worden uitgevoerd.
    OPMERKING: Als de cellen geen transfectie nodig hebben voor de expressie van eiwitten van belang, kan dit protocol op elk moment in vitro worden uitgevoerd bij het onderzoeken van calciumtransiënten. Na een test van controlecellen om de meting van calciumtransiënten te garanderen, moet de experimentator blind zijn voor de genetische of farmacologische omstandigheden van elk getest gerecht om vertekening te minimaliseren.

8. Beeldanalyse

  1. Open time-lapse-afbeeldingen met confocale software.
  2. Afbeeldingen in time-lapse-reeksen uitlijnen met de opdrachtenreeks : Afbeelding | Verwerking | Sluit huidig document uit. Selecteer Uitlijnen op het eerste frame.
  3. Selecteer interessegebieden (ROI's) langs neurieten met behulp van het ROI-selectiegereedschap, een boonvormig pictogram aan de rechterkant van het afbeeldingskader (figuur 3B). Markeer ook een ROI die de fluorescentie-intensiteit op de achtergrond vertegenwoordigt.
    OPMERKING: ROIs worden geselecteerd door gebieden van duidelijk gescheiden puncta te kiezen langs neuronale sporen die worden aangegeven door het heldere stilstaande beeld. Ten minste vijf ROIs per neuron worden gekozen voor analyse. De ROI op de achtergrond wordt gekozen in een gebied van het gezichtsveld dat geen neurieten bevat.
  4. Meet ruwe fluorescentie in de loop van de tijd voor geselecteerde ROI's met behulp van de volgende opdrachtenreeks: Meet | Tijdmeting.
    1. Start de functie Meten in het bovenste gedeelte van het deelvenster Tijdmeting . Een grafische weergave van ruwe fluorescentie in de tijd (figuur 3C) en kwantitatieve gegevens worden beide gegenereerd.
      OPMERKING: Elk gegevenspunt vertegenwoordigt de ruwe fluorescentie voor die ROI voor het frame dat is gekoppeld aan dat specifieke gemeten tijdspunt.
  5. Exporteer ruwe fluorescentie-intensiteiten naar de spreadsheetsoftware.
  6. Analyseer elke ROI onafhankelijk. Normaliseer eerst gegevens door de ROI-intensiteit op de achtergrond af te trekken van de ROI van interesse-intensiteit op elk tijdstip.
    1. Neem de ruwe fluorescentiewaarde van de achtergrond-ROI op elk specifiek tijdstip en trek dit af van de ROI van de ruwe intensiteitswaarde van rente op dat moment.
      OPMERKING: Dit wordt gedaan voor de gehele opnameperiode, zowel basale als stimulatiefasen.
  7. Bepaal de gemiddelde ROI van rente-intensiteit voor de laatste 30 s van de basislijn.
    1. Gemiddelde van de genormaliseerde ruwe basale waarden gegenereerd in stap 8.6 van de laatste 30 s van de basale opnameperiode van 3-5 minuten.
      OPMERKING: De gehele periode van basale opname kan worden gebruikt om deze waarde te genereren. Naarmate deze waarde echter stabiliseert en wordt gehandhaafd, zijn de 60-tijdspunten van de laatste 30 s van voldoende steekproefgrootte om het geheel weer te geven.
  8. Vergelijk deze basislijnwaarde met de genormaliseerde intensiteitswaarde op elk tijdstip, waardoor een verandering in fluorescentiewaarde (ΔF) wordt gegenereerd.
    1. Neem de waarde uit stap 8.7 en trek de gemiddelde fluorescerende basislijnwaarde af. Doe dit en de daaropvolgende stappen voor de gehele opnameperiode, zowel basale als stimulatiefasen.
  9. Bereken deze verandering met betrekking tot de uitgangsfluorescentiewaarde, waardoor een verandering in fluorescentie/basisfluorescentie (ΔF/F) wordt gegenereerd. Neem hiervoor de waarde uit stap 8.8 en deel deze door de gemiddelde fluorescerende basislijnwaarde.
  10. Stel ten slotte de beginpuntwaarde in op 1, zodat stijgingen of dalingen in de loop van de tijd gemakkelijk grafisch kunnen worden gevisualiseerd.
    1. Neem de waarde die is gegenereerd in stap 8.9 en voeg 1 toe.
      OPMERKING: Wanneer dit correct wordt gedaan, moeten de 30 s van de waarden van de basislijnperiode in de buurt van de waarde van 1 zweven. In cellen die effectief synaptische inhoud vrijgeven, zou deze waarde van 1 naar 0 moeten gaan na het begin van de stimulatie. Een voorbeeld van stap 6-9 is weergegeven in figuur 3E.

9. Data-analyse

OPMERKING: De experimentator kan worden losgekoppeld van experimentele omstandigheden om gegevens op de juiste manier te bundelen voor analyse. Gebruik een steekproefgrootte van ten minste 10 neuronen per aandoening uit elk van de drie onafhankelijke experimenten. Overweeg alleen neuronen voor opname als ten minste vijf ROI-regio's kunnen worden aangewezen. Dit niveau van experimentele replicatie was voldoende in gepubliceerde studies om een diepgaand verlies van synaptische ontlading aan te tonen in ALS-gerelateerde poly-GA-bevattende cellen versus GFP-controles (zie Representatieve resultaten). Als echter een subtieler fenotype wordt waargenomen, kan het aantal biologische en / of technische replicaties door de gebruiker worden geoptimaliseerd.

  1. Gebruik alle berekende ΔF/F-waarden in de loop van de tijd van ROIs van een bepaalde experimentele toestand en bepaal een gemiddelde ΔF/F-waarde voor elk tijdstip samen met een SEM.
  2. Plot gegevens met behulp van een grafische en statistische softwareprogramma in xy-formaat, waarbij x de verstreken tijd is en y de ΔF / F-waarde is berekend in stap 9.1. Presenteer alle waarden als gemiddelde ± SEM.
  3. Om statistische significantie te bepalen, gebruikt u de student t-test voor het vergelijken van twee groepen en eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA), gevolgd door Tukey's posthoc-analyse voor het vergelijken van drie of meer groepen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na de succesvolle implementatie van het bovenstaande protocol worden representatieve resultaten getoond voor een typisch styryl dye synaptisch vesikel release experiment. Gekweekte primaire corticale neuronen van ratten werden geladen met kleurstof met behulp van de methode beschreven in rubriek 6. De specificiteit van de kleurstofbelasting werd bepaald door co-labeling met synaptische blaasblaasmarker synaptofysine. Een meerderheid van de styrylkleurstof positieve puncta zijn co-positief voor deze marker (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drie stappen die beide beschreven methoden gemeen hebben, zijn van cruciaal belang voor experimenteel succes en kwantificeerbare uitkomsten. Ten eerste is de voorbereiding van verse aCSF vóór elke ronde van experimenten essentieel, volgens de bijgevoegde instructies. Als u dit niet doet, kan dit een geschikte neuronale depolarisatie voorkomen. Een monster van onbehandelde controleneuronen moet voortdurend worden getest voordat experimentele groepen worden gestimuleerd om een goede cellulaire depolarisatie te garanderen e...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen de huidige en voormalige leden van het Jefferson Weinberg ALS Center bedanken voor kritische feedback en suggesties voor het optimaliseren van deze technieken en hun analyses. Dit werk werd ondersteund door financiering van de NIH (RF1-AG057882-01 en R21-NS0103118 tot D.T.), de NINDS (R56-NS092572 en R01-NS109150 tot P.P), de Muscular Dystrophy Association (D.T.), het Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), de Family Strong 4 ALS foundation en de Farber Family Foundation (B.K.J., K.K. en P.P).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
20x air objectiveNikonVoor beeldvorming
40x oil immersion objectiveNikonVoor beeldvorming
B27 supplementThermo Scientific17504044Neuronaal groeisupplement
BD Spuitpijpen zonder naald, 50 mLThermo Scientific13-689-8Onderdeel van zwaartekrachtperfusie-assemblage
Bioveiligheidskap voor celcultuurBakerSterilGARD III SG403AAsceptische celcultivering, transfectie en kleurstofbelasting
b-MercaptoethanolMillipore SigmaM3148Voor het cultiveren en onderhouden van neuronale culturen
RundserumalbumineMillipore SigmaA9418Voor het voorbereiden van neuronale culturen
CalciumchloridedihydraatMillipore Sigma223506Onderdeel van aCSF-oplossingen
Cell culture CO2 incubatorThermo Scientific13-998-123Voor het cultiveren en onderhouden van neuronen
CentrifugeEppendorf5810RVoor bereiding van neuronale cultuur
Confocale microscoopNikonEclipse Ti +A1R coreVoor fluorescentiebeeldvorming
CoolSNAP ES2  CCD-cameraPhotometricsVoor beeldacquisitie
D-GlucoseMillipore SigmaG8270Onderdeel van aCSF-oplossingen
DNaseMillipore SigmaD5025Voor bereiding van neuronale cultuur
Vrouwelijke, getimede zwangere Sprague Dawley-rattenCharles river400SASSDVoor het voorbereiden van embryonale corticale en spinale motorneuronculturen
FITC-filtercubeNikon77032509Voor beeldvorming van Gcamp-calciumtransienten
FM4-64 styrylkleurstofInvitrogenT13320Voor beeldvorming van synaptische blaasjesvrijlating
Glasbodem petrischaal (dikte #1.5)CellVisD35-10-1.5-NVoor groei van neuronen op beeldvormingsgeschikte kweekschaal
Glas Pasteur-pipetGrainger52NK56Voor het voorbereiden van neuronale culturen
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Millipore SigmaH6648Voor het voorbereiden van neuronale culturen
HEPESMillipore SigmaH3375Onderdeel van aCSF-oplossingen
Hoge KCl kunstmatige hersenvocht (aCSF)Voor beeldvorming. Zie recepten*
Paarden serumMillipore SigmaH1138Voor het cultiveren en onderhouden van neuronen
Laminair stromingsdissectiekapNUAIRENU-301-630Voor het voorbereiden van neuronale culturen
LaminineThermo Scientific23017015Voor het voorbereiden van neuronale culturen
Leibovitz's L-15 MediumThermo Scientific11415064Voor het voorbereiden van neuronale culturen
Leibovitz's L-15 Medium, zonder fenolroodThermo Scientific21083027Voor het voorbereiden van neuronale culturen
L-Glutamine (200 mM)Thermo Scientific25030149Neuronale cultuursupplement
Lipofectamine 2000 TransfectiereagensThermo Scientific11668019Voor neuronale transfecties
Laag KCl kunstmatig hersenvocht (aCSF)Voor beeldvorming. Zie recepten*
MagnesiumchlorideMillipore Sigma208337Onderdeel van aCSF-oplossingen
Microsoft ExcelMicrosoftSoftware voor gegevensanalyse/normalisatie
Nalgene  Filtereenheden, 0,2 µm PESThermo Scientific565-0020Filtereenheid voor aCSF-oplossing
Neurobasal mediumThermo Scientific21103049Voor het cultiveren en onderhouden van neuronale culturen
NIS-Elements Advanced ResearchNikonSoftware voor beeldacquisitie en -analyse
Nunc 15 mL kegelbuisjesThermo Scientific339650Voor het voorbereiden van neuronale cultuur en bufferoplossingen
Nunc 50 mL kegelbuisjesThermo Scientific339652Voor het voorbereiden van neuronale cultuur en bufferoplossingen
OptiprepMillipore SigmaD1556Voor het voorbereiden van neuronale culturen
PapaïneMillipore SigmaP4762Voor het voorbereiden van neuronale culturen
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)Thermo Scientific15140122Om bacteriële besmetting van neuronale culturen te voorkomen
PerfusiesysteemWarner InstrumentsSF-77BVoor uitwisseling van aCSF
PerfusieslangCole-ParmerUX-30526-14Onderdeel van zwaartekrachtperfusie-assemblage
pGP-CMV-Gcamp6m-plasmideAddgene40754Voor beeldvorming van calciumtransienten
Poly-D-lysinehydrobromideMillipore SigmaP7886Bekledingsmiddel voor glazen bodem petrischalen
KaliumchlorideMillipore SigmaP3911Onderdeel van aCSF-oplossingen
NatriumbicarbonaatMillipore SigmaS5761Onderdeel van aCSF-oplossingen
NatriumchlorideMillipore SigmaS9888Onderdeel van aCSF-oplossingen
Stage Top IncubatorTokai HitVoor incubatie van levende neuronen tijdens beeldvormingsperiode
TRITC-filtercubeNikon77032809Voor beeldvorming van FM4-64
Trypsine-remmerMillipore SigmaT6414Voor het voorbereiden van neuronale culturen
Trypsine-EDTA (0,25%), phenolroodThermo Scientific25200056Voor het voorbereiden van neuronale culturen
Vibra

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16(2015).
  5. Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
  6. Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
  7. Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
  8. Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, Pt 6 1540-1550 (2008).
  9. Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
  10. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  11. Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
  12. Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
  13. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  14. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  15. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  16. Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
  17. Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
  18. Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
  19. Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
  20. Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
  21. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  22. Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
  23. Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13(2021).
  24. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
  27. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  28. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
  29. Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
  30. Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
  31. Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle's loop. American Journal of Physiology. 268 (6), Pt 2 1148-1153 (1995).
  32. Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
  33. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  34. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  37. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  38. Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
  39. Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
  40. Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
  41. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  42. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
  43. Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722(2020).
  44. Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
  45. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51(2018).
  46. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113(2017).
  47. Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
  48. Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  49. Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
  50. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  51. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  52. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
  53. Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
  54. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  55. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
  56. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  57. Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
  58. Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570(2020).
  59. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  60. Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583(2019).
  61. Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
  62. Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
  63. Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
  64. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  65. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427(2017).
  66. Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
  67. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
  68. Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Synaptic FunctionAmyotrophic Lateral SclerosisFluorescent MeasurementSynaptic Vesicle ReleaseCalcium InfluxLive ImagingConfocal MicroscopyPrimary Neuronal CulturesGCaMP6m ReporterStyryl Dye

Related Articles