Weefselvoorbereidingstechnieken voor contrastverbeterde microcomputertomografie beeldvorming van grote hartmodellen bij zoogdieren met chronische ziekte

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om hoge resolutie microcomputertomografiebeelden te verkrijgen van gezonde en pathologische grote zoogdierharten met collageenselectieve contrastverbetering.

Samenvatting

Structurele remodellering is een veel voorkomend gevolg van chronische pathologische stress die op het hart wordt opgelegd. Het begrijpen van de architecturale en compositorische eigenschappen van ziek weefsel is van cruciaal belang om hun interacties met aritmisch gedrag te bepalen. Weefselremodellering op microschaal, onder de klinische resolutie, komt naar voren als een belangrijke bron van dodelijke aritmie, met een hoge prevalentie bij jonge volwassenen. Er blijven uitdagingen bestaan bij het verkrijgen van een hoog beeldcontrast bij voldoende resolutie op microschaal voor preklinische modellen, zoals grote hele harten van zoogdieren. Bovendien ontbreekt het nog steeds aan weefselsamenstellingsselectieve contrastverbetering voor driedimensionale beeldvorming met hoge resolutie. Niet-destructieve beeldvorming met behulp van micro-computertomografie is veelbelovend voor beeldvorming met hoge resolutie. Het doel was om de last van röntgenverzwakking in grote biologische monsters te verlichten. Harten werden geëxtraheerd van gezonde varkens (N = 2) en schapen (N = 2) met ofwel geïnduceerd chronisch myocardinfarct en fibrotische littekenvorming of geïnduceerde chronische atriale fibrillatie. Uitgesneden harten werden doordrenkt met: een zoutoplossing aangevuld met een calciumionenblusser en een vaatverwijder, ethanol bij seriële dehydratie en hexamethyldisilizane onder vacuüm. Deze laatste versterkte de hartstructuur tijdens het drogen aan de lucht gedurende 1 week. Collageen-dominant weefsel werd selectief gebonden door een röntgencontrastverbeterend middel, fosfolybdisch zuur. Weefselconformatie was stabiel in de lucht, waardoor langdurige microgecomputeerde tomografie-acquisities mogelijk waren om beelden met een hoge resolutie (isotroop 20,7 μm) te verkrijgen. Optimale contrastmiddelbelasting door diffusie toonde selectieve contrastverbetering van de epitheellaag en sub-endocardiale Purkinje-vezels in gezonde varkensventrikels. Atriale fibrillatie (AF) harten vertoonden verbeterde contrastaccumulatie in de achterste wanden en aanhangsels van de boezems, toegeschreven aan een groter collageengehalte. Hartinfarctharten vertoonden selectief een verhoogd contrast in regio's van hartfibrose, waardoor de identificatie van met elkaar verweven overlevende myocardiale spiervezels mogelijk was. Contrastversterkte luchtgedroogde weefselpreparaten maakten beeldvorming op microschaal van het intacte grote zoogdierhart en selectieve contrastverbetering van onderliggende ziektebestanddelen mogelijk.

Inleiding

Structurele hartziekten zijn verantwoordelijk voor de meerderheid van de hartgerelateerde sterfte wereldwijd¹. Remodellering van de cardiale structuur beïnvloedt de myocardiale omgeving en de interstitiële ruimte. Aangezien zowel de cardiale elektrische als de mechanische functie afhankelijk is van de myocytenorganisatie, kan verstoring leiden tot ondraaglijke hartritmestoornissen, verminderde bloedpompacties en hartfalen 2,3,4,5,6,7,8,9. De ontwikkelingen van curatieve therapieën voor structurele hartziekten wegen ruimschoots op tegen de prevalentie van de ziekte ^2,5. Als zodanig zijn er steeds meer preklinische modellen van structurele hartaandoeningen in opkomst om de anatomo-morfologische profielen en de resulterende pathogenese van hartritmestoornissen beter te begrijpen 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20^, 21,22,23. Waargenomen in het structurele ziektespectrum is de upregulatie van interstitiële fibrose en, vaker in ischemie-gerelateerde gevallen, myocardiale vervanging door fibrose en vetweefsel¹⁸. Morfologisch begrip van pathologische extracellulaire componenten kan de identificatie van potentiële substraten van aritmie mogelijk maken. De verspreiding en omvang van de ziekte bieden sterke indicatoren van aritmogene risico. Toch blijven er uitdagingen om ziekteprofielen volledig in beeld te brengen door macro- en microschalen in het intacte hart te integreren.

Micro-computertomografie (microCT), gebaseerd op röntgenstralen, is in opkomst als een krachtig hulpmiddel om de microstructuur van zacht biologisch weefsel te ondervragen met behulp van contrastmiddelen. Zeer gedetailleerde anatomische kaarten zijn verkregen voor harten van kleine knaagdieren 24,25,26 en kleine ontleedde monsters van grote zoogdierharten ^27,28. Beeldvorming op het hele orgaanniveau van grote zoogdierharten toont echter buitensporige padlengten waarover röntgenfotonen worden verzwakt met behulp van conventionele weefselvoorbereidingstechnieken. Dit omvat het contrastladen van het weefsel en het onderdompelen van het monster in een contrastmiddel oplosmiddel tijdens de acquisitie. Het vergroten van de steekproefomvang en resolutie vereist een verlenging van de totale acquisitietijd. Daarom wordt weefselstabiliteit cruciaal voor bruikbare beeldreconstructie, wat betekent dat weefselvervorming als gevolg van uitdroging moet worden voorkomen. Het gebruik van een onderdompelingsvloeistof heeft echter nadelen: (i) de totale intensiteit van het achtergrondsignaal wordt niet-verwaarloosbaar en (ii) bevordert de verdunning van weefselgebonden contrastmoleculen. Beide factoren dragen bij aan het verlagen van het beeldcontrast.

Deze studie beschrijft een nieuwe weefselverwerkingspijplijn om de demping van achtergrondfotonen te verlichten en het dynamische bereik van contrastverbeteraars te optimaliseren. Er wordt voorgesteld om een weefselluchtdrogende benadering met chemische weefselversterking te gebruiken om weefselvervorming te beperken²⁹. Daarom kunnen weefselmonsters stabiel blijven in de lucht voor lange acquisities en achtergrondbijdragen van onderdompelingsvloeistoffen weglaten. Deze methodologiepijplijn biedt: (i) een uitgebreid weefselverwerkings- en beeldvormingsprotocol dat is geoptimaliseerd met behulp van hele varkensharten; ii) een evaluatie van contrastconcentratie- en belastingstechnieken en iii) toepassing van deze pijplijn in twee verschillende modellen voor chronische ziekten van atriumfibrilleren en myocardinfarct bij schapenharten. De ontwikkeling van de chronische ziektemodellen is elders beschreven voor elk model voor chronische hartaandoeningen, myocardinfarct geïnduceerd door percutane coronaire embolisatie¹³ en zelfvoorzienende atriumfibrilleren³⁰.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren van Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. Dierprotocollen werden goedgekeurd door de lokale ethische commissie (CEEA50) van de Universiteit van Bordeaux. Harten waren afkomstig van drie grote zoogdiermodellen, waaronder (i) Gezonde grote witte varkens (N = 2, 2 maanden oud); (ii) Schapen (N = 1, 2 jaar oud) met geïnduceerd myocardinfarct¹³ en (iii) Schapen (N = 1, 7 jaar oud) met geïnduceerd atriumfibrilleren³⁰.

1. Oplossingsvoorbereiding:

1. Cardioplegische oplossing: Bereid 3 l gedestilleerd water en voeg natriumchloride (110 mM), kaliumchloride (16 mM), natriumbicarbonaat (10 mM), D-(+)-glucose (9 mM), calciumchlorideoplossing (1,2 mM) en magnesiumchlorideoplossing (16 mM) toe. Voeg aan het einde 500 μL /L heparinenatrium toe. Bewaar deze oplossing bij 4 °C.
2. Fosfaat gebufferde zoutoplossing - EDTA-oplossing (PBS-EDTA).
   1. Voeg eerst ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toe aan 1 l gedestilleerd water voor een eindconcentratie van 10 mM. Verhoog en handhaaf een pH van 12 met behulp van natriumhydroxideoplossing (1 M) om de EDTA op te lossen.
   2. Zodra de EDTA volledig is opgelost, verlaagt u de pH tot 7,4 met behulp van zoutzuur. Voeg één foliezakje met fosfaat gebufferde zoutoplossing toe om een oplossing te verkrijgen bij 0,01 M (natriumchloride, 0,138 M; kaliumchloride, 0,0027 M) en pH 7,4. Bewaar deze oplossing bij kamertemperatuur (RT).
3. Ethanol - fosfolybdischzuur (PMA) contrastmiddeloplossing: Bereid 1 L absolute ethanol en voeg de PMA toe om een oplossing te verkrijgen met 1% van de concentratie. Bewaar deze oplossing bij RT.

2. Bron van weefsel

1. Euthanaseer het dier en haal het hart eruit volgens lokale ethische richtlijnen. Dompel het hart snel onder in een koude cardioplegische oplossing en masseer de ventrikels zachtjes voor de eerste spoeling.
2. Zorg ervoor dat u de aorta onder de aortaboog snijdt en klem twee zijden van de arteriële wand vast met behulp van naaldhouders.
3. Hang het hart op bij de naaldhouders, plaats een aortacanule in de aortawortel en zorg ervoor dat u geen contact maakt met of door de aortakleppen steekt. Wikkel een 0 gauge hechtdraad rond de aortaboog ter hoogte van de canule en bind de canule stevig op zijn plaats.
4. Injecteer met spuiten van 50 ml 200 ml koude (4 °C) cardioplegische oplossing. Verwijder overtollig bloed in de holtes door het hart aan de achterste kant te kantelen om via de longaders te draineren.
5. Dompel het gespoelde hart onder en bewaar in een koude cardioplegische oplossing die op ijs is opgeslagen totdat deze klaar is voor dissectie.

3. Weefselpreparaat:

1. Bereid een reservoir van 1 L ondersteund 80 cm boven een dissectieschotel. Koppel een thermoplastische buis met een lengte van 80 cm en een inwendige diameter van 3,2 mm en een uitwendige diameter van 4,8 mm aan een afvoerpoort van het reservoir.
2. Bevestig een driewegkraan aan de afvoerbuis en koppel verdere thermoplastische buizen (20 cm, 1,6 mm inwendige diameter en 3,2 mm buitendiameter) aan elke vrije poort op de driewegkraan. Bevestig tweerichtingskranen aan de uiteinden van de buis.
3. Vul het reservoir met de cardioplegische oplossing aangevuld met heparine (2500 eenheden). Open de kranen om de cardioplegische oplossing te laten leeglopen en verwijder alle luchtbellen en sluit vervolgens de tweerichtingskranen.
4. Bereid canules voor linker en rechter coronaire ostia met behulp van polytetrafluorethyleen (PTFE) buizen (1 mm inwendige diameter en 2 mm buitendiameter).
   1. Snijd 5 cm buis en verwarm het ene uiteinde door de punt naast een open vuur te plaatsen. Zodra 1 mm van de punt begint te smelten en doorschijnend wordt, drukt u de punt tegen een hard hittebestendig oppervlak om een richel aan de canulepunt te vormen om te voorkomen dat canules uit de vaten glijden.
   2. Steek 1 cm van het niet-verwarmde uiteinde van elke canule in de twee uiteinden van de afvoerreservoirafvoerslang.
5. Verwijder de aortacanule. Onder koude cardioplegische oplossing, lokaliseer de linker en rechter ostia van kransslagaders.
6. Scheid met een puntige schaar de aortawortel zorgvuldig van het omliggende weefsel boven en onder de coronaire ostia om het rijgen van een zijden hechtdraad van 0 G onder het coronaire vat mogelijk te maken.
7. Open de tweerichtingskranen en steek de canuletips in de coronaire ostia. Met de canule-uiteinden die zich 1-2 cm uitstrekken in de ostia en voorbij de hechting, bindt u canules af.
8. Spoel het hart terwijl u de ventrikels gedurende 15 minuten zachtjes masseert totdat het hart van bloed is ontdaan.
9. Sluit na het spoelen de tweerichtingskranen en koppel ze los van de driewegkraan. Breng het hart over in een plastic chemicaliënbestendige container van 1 L met 500 ml PBS-EDTA-oplossing.
10. Recirculeer PBS-EDTA-oplossing in de thermoplastische buis onder een zuurkast met behulp van een peristaltische pomp met twee kanalen. Bereid de pompbuizen voor totdat de slang geen luchtbellen heeft en perfundeer vervolgens elke canule van de kransslagader door recirculatie bij RT gedurende 2 uur bij 80 ml / min.
11. Zorg ervoor dat de zuurkast operationeel is. Stop de pomp, laat de oplossing uit de container lopen en vervang deze door formaline (10%) voor fixatie gedurende 1 uur bij RT bij 80 ml/min.
12. Vervang de formaline-oplossing door PBS om het fixeermiddel driemaal te spoelen gedurende 15 minuten elk met 80 ml/min.

4. Uitdroging en droging van het weefsel:

OPMERKING: Gebruik dezelfde perfusiesnelheid (80 ml / min) en laat het weefsel gedurende de hele tijd op RT blijven.

1. Vervang PBS-oplossing door ethanol op 20%, verdund in ultrazuiver water, en perfuseer gedurende minimaal 3 uur.
2. Perfundeer het hart met behulp van een reeks toenemende ethanolconcentraties.
   1. Begin met het vervangen van de 20% ethanoloplossing door ethanol verdund tot 30% en perfuseer gedurende 2 uur.
   2. Herhaal de perfusie door de ethanolconcentratie bij elke iteratie te verhogen tot 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 95%, 90%, 95%, 99% en 100% voor een minimale duur van 1 uur bij elke stap (concentratie).
      OPMERKING: Hartmonsters mogen 's nachts zonder perfusiestroom rusten bij een ethanolverdunning als voor die concentratie een minimale perfusie van 15 minuten heeft plaatsgevonden.
3. OPTIONEEL: Als u contrastmiddelen via perfusie aanbrengt, perfundeer het hart met 100% ethanol aangevuld met het contrastmiddel PMA, 1% gedurende 48 uur. Spoel het contrastmiddel door perfusie met 100% ethanol gedurende 2 uur.
4. Om het hartweefsel te versterken voordat het aan de lucht wordt gedroogd, recirculeert u een 50:50-mengsel van ethanol en hexamethyldisilazane (HMDS) gedurende 10 minuten. Volg dit met 100% HMDS voor nog eens 2 uur.
   LET OP: HMDS is een zeer giftige en schadelijke stof. Een sterke geur van ammoniak komt vrij in contact met lucht. Bovendien is de vloeibare vorm van HMDS zeer vluchtig en gekatalyseerd door jodiumhoudende middelen.
5. Koppel de canule los van de slang en hang het hart op aan een aortanaag in de zuurkast.
6. Schuif voorzichtig een zak met ritssluiting over het hart en sluit de zakafdichting over de hechtdraad om de blootstelling van het hart aan circulerende lucht te verminderen. Laat het hart 1 week drogen door verdamping.
7. OPTIONEEL: Voor contrastmiddelen die diffusiebelasting gebruiken, was het hart gedurende 15 minuten in 100% ethanol tijdens het roeren. Dompel het hart onder in 100% ethanol aangevuld met PMA, 1%, gedurende 48 uur onder vacuüm. Herhaal stap 4.6.

5. MicroCT:

OPMERKING: Een desktop X-ray microCT-systeem werd gebruikt voor het in beeld brengen van varkensharten.

1. Monteer het luchtgedroogde hart op een geschikte monsterhouder. Voorkom elke beweging tijdens de röntgenmicroCT-metingen met behulp van een klem die aan de monsterhouder is verankerd en zet het hart vast via de gedroogde en stijve aorta.
2. Lijn het midden van het hartmonster langs de lengteas zorgvuldig uit met het midden van het beeldveld gedurende rotatiehoeken van 0° en 90°. Om dit in alle richtingen te bereiken, hangt u het hart in de lucht via een aortaklem die aan de monstersteun is bevestigd.
3. Na het openen van de software en het initiëren van het X-ray microCT-systeem, past u het röntgenfilter aluminium, 1 mm, röntgenbronspanning toe op 60 kV en stroom op 120 μA. Stel de beeldafmetingen in op 2016 x 1344 pixels en de pixelgrootte op 20 μm.
4. Trek de monsterhouder uit het gezichtsveld en kalibreer het achtergrondbeeld en de röntgenbelichtingstijd door een vlakveldcorrectie te verkrijgen. Zorg ervoor dat de gemiddelde röntgenoverdracht op de achtergrond groter is dan 80%.
5. Scout röntgentransmissiebeelden langs de lengte van de ondersteuning om het totale beeldvormingsveld in de lengteas van het hart te bepalen. Gebruik voor het scannen een rotatiestap van 0,18°, een framegemiddelde van 5 en een monsterrotatie van 180°. Selecteer de offset-scanmodus om de volledige breedte van de voorbeeldondersteuning weer te geven.
   OPMERKING: De acquisitieparameters die in deze sectie worden aangegeven, zijn geselecteerd om de beeldkwaliteit van de ensemblehartcompositie te optimaliseren.
6. Gebruik na het scannen de software voor tomografische reconstructie van een isotroop driedimensionaal beeldvolume. Gebruik voor de toepassing van NRecon-software acquisitiegerelateerde artefactcorrectie, inclusief bundelverhardingseffecten van 10% en ringartefactreductie van 8.
7. Als u de beperkingen voor gegevensopslag wilt optimaliseren, past u het minimale rechthoekige interessegebied toe dat hartspecifieke afbeeldingsvoxels omvat. Exporteer de afbeeldingen in een 8-bits bitmapindeling als een afbeeldingsstapel.
8. Visualiseer de gereconstrueerde gegevensstack met behulp van DataViewer-software. Oriënteer het monster digitaal binnen de beeldgrenzen om de lange en korte assen van het monster opnieuw uit te lijnen met de drie hoofdassen van het beeldvolume.
9. Snijd het afbeeldingsvolume in alle drie de assen bij om de buitenste achtergrondlagen van de afbeelding te verwijderen en de totale afbeeldingsgrootte maximaal te verkleinen.

Resultaten

De bereiding van grote zoogdierharten met behulp van de uitdrogings- en luchtdroogmethode verwijdert alle waterinhoud uit het monster. Tijdens het laden van HMDS kunnen aanwijzingen voor onvoldoende watervervanging door ethanol worden waargenomen (zie protocol, stap 4.4). De aanwezigheid van water onder HMDS zal bellen creëren die uit het weefsel opstijgen. Bij te hoge waterstanden kan een stijging van de temperatuur van de dompelvloeistof optreden. Door de dompelkamer tijdens de eerste HMDS-belasting omringd te houden met ijs, kunnen de nadelige effecten van weefselverwarming worden verminderd. Na het aan de lucht drogen van harten in afwezigheid van contrastmiddelen, ziet het monster er wit van kleur uit (zie Protocol, stap 4.6). Het buitenoppervlak was vaak gedroogd en structureel stabiel voor intramurale lagen. Spoelen in ethanol voordat het contrastmiddel werd geladen, verwijderde de witte aanslag (zie protocol, stap 4.7). Het snijden door weefsel met behulp van een scherp mes onthult macroscopisch individuele spiervezels met duidelijke scheiding. Contrastbelasting door het onderdompelen van hartmonsters in contrastmiddelmedium leed aan diffusielimietartefacten in dikke en zeer gespierde gebieden van het monster. Diffusiecontrastbelasting onder vacuüm zorgde voor meer homogene kleuring in spieren (hartmonster #1, zie tabel 1 voor de laadtijden van contrastmiddelen). Macroscopisch vertoonde de verdeling van het oppervlaktecontrastmiddel een homogene kleuring tussen hartspier en regio's die voornamelijk bestonden uit extracellulaire componenten, met name vet en bindweefsel. Luchtgedroogde weefselmonsters, vóór of na het laden van contrastmiddelen, behielden een stabiele structurele integriteit.

De tijd die nodig was om de volledige breedte van het monster te scannen met een resolutie van 20 μm onder microCT met behulp van de bovengenoemde scanparameters en een belichtingstijd van 1700 ms was 6 h 34 min. Afhankelijk van de grootte van het monster in de portaalas van de scanner werd deze duur vermenigvuldigd met het aantal posities dat nodig was om de volledige lengte van het monster vast te leggen. Voor varkens- en schapenharten werden in dit onderzoek drie tot vier posities gebruikt. De NRecon-software betegelde de multipositie- en offsetscans om een enkel röntgenprojectiebeeld te vormen voor elke rotatiestap van de röntgenbron en detector. In totaal worden 1000 projecties opgeslagen als 16-bits afbeeldingen, waardoor 30-40 GB aan gegevens wordt gegenereerd. Gereconstrueerde volumetrische beelden waren 52-70 GB.

Belangrijke anatomische oriëntatiepunten, waaronder de ventriculaire holtes, het septum en de vrije wanden van de ventrikels, waren gemakkelijk te herkennen aan röntgentransmissiebeelden van luchtgedroogde varkensharten gekleurd met contrastmiddel door diffusiebelasting (figuur 1A). Bovendien werden ook sterk getextureerde gebieden waargenomen die wijzen op microstructurele organisatie, zoals myocardiale vezeloriëntatie, als gevolg van gevoelige röntgenverzwakking / transmissie (figuur 1B). Tomografische reconstructies van driedimensionale beeldvolumes toonden een duidelijke scheiding tussen weefsel en achtergrond op zowel epicardiale als endotheelgrenzen (figuur 1D). Intramuraal werden diffusiegradiënten met laag contrast en voxelintensiteit waargenomen in dikke transmurale gebieden van het weefsel. Desondanks waren vasculatuur en myocardiale vezels gescheiden door splitsingsvlakken nog steeds gemakkelijk identificeerbaar. Een tweede hogere intensiteit bandbreedte van contrast werd waargenomen op de epicardiale laag en in punctate sub-endocardiale gebieden. Contrastverbetering was het grootst op plaatsen waar extracellulaire componenten werden geaccumuleerd, met name epicardiaal bindweefsel, epicardiaal vet en de bindweefselmantel van het Purkinje-vezelnetwerk. Voxel-signaalintensiteitsverdelingen toonden een hoge scheiding van de nulintensiteitsachtergrond (lucht) en twee dominante populaties van weefsel met laag en hoog contrast (figuur 1D).

Om contrastverbetering van microCT-beeldreconstructies en de selectiviteit van collageenachtige compartimenten van de hartmonsters te valideren, werden histologie, heldere veldmicroscopie en fluorescerende microscopie gebruikt (figuur 2). Een transmuraal blok ventriculaire weefsel van een luchtgedroogd hart zonder voorafgaande contrastmiddelbelasting werd voorbereid voor paraffine-inbedding en sectioning. Aangrenzende weefselplakken gemonteerd op microscoopglaasjes werden behandeld door Masson's trichrome kleuring, geen behandeling, of 48 uur PMA (1%). Onderdompeling van op dia gemonteerde weefselsecties elimineerde diffusiegradiënteffecten van het kleuringsproces die werden waargenomen in monsters van het hele hart. Mason's trichrome kleuring toonde collageenpositieve kleuring op de epitheliale en endotheellagen, perivasculair in het sub-epicardiale weefsel, en een bindweefselschede rond een vrijlopende Purkinje-vezel die uitsteekt in de linkerventrikelholte (figuur 2A). Heldere veldverlichting toonde donkere kleuring in collageenstructuren na PMA-kleuring, wat de preferentiële accumulatie van PMA ondersteunde (figuren 2B, C). Bovendien is eerder aangetoond dat PMA-behandeling de autofluorescentie van collageen macromoleculaire complexen^{dooft 31}. Fluorescerende beelden van ventriculaire weefselsecties hadden PMA-geïnduceerd verlies van fluorescentie op plaatsen van collageen (figuur 2D versus 2E, figuur 2D 'vs. 2E' en figuur 2D '' versus 2E ''). In zowel heldere veld- als fluorescerende beeldvorming werden cellulaire compartimenten niet veranderd door de PMA-behandeling en collageen had een selectieve accumulatie van PMA-kleuring en doven van autofluorescentie.

Hartmonster #2 werd gekleurd met een contrastmiddel via perfusie voorafgaand aan het drogen aan de lucht. Beeldreconstructie toonde zeer fragmentarische vlekken in het myocardiale compartiment (figuur 3A). Contrastverbetering leek niet selectief voor weefselsamenstelling, zonder verdere verbetering van de signaalintensiteit in de epicardiale of sub-endocardiale gebieden. Bovendien vertoonde weefsel met een laag contrast een slechte scheiding van de achtergrondintensiteit (figuur 3B).

Ventriculaire fibrose werd geïnduceerd door een hartinfarct en chronische ischemie (hartmonster #3). Een antero-apicale litteken werd gevormd door myocyten te vervangen door fibro-vetafzettingen in het weefsel stroomafwaarts naar de plaats van vasculaire embolisatie. Hartmonster # 3 werd voorbereid en afgebeeld vanuit een ontleedde ventriculaire wig die de voorste linker ventrikel, het septum en de rechterventrikelvrije wand bedekte. De voorbereiding van deze ventriculaire wigconfiguratie is eerder beschreven³² en de toepassing van wiggen voor cardiale beeldvorming werd in detail besproken³³. De morfologie van de littekens was transmuraal maar heterogeen (figuur 4). Een centrale dichte fibrotische laesie was omgeven door een losse en heterogene grenszone (figuur 4A). Het ventriculaire preparaat werd gekleurd door diffusie-laden na het drogen van de lucht en in een vacuüm. Figuur 4B-E toont de grootste signaalintensiteiten van gereconstrueerde microCT-beeldvolumes aan de weefselgrenzen en littekengebieden. Contrastmiddelen slecht gekleurd gezond myocardium, maar microstructureel contrast bleef behouden (figuur 4C'). In de grenszone werd littekenweefsel afgewisseld met overlevend myocardium (figuur 4D'). Dichte fibrose leek transmuraal maar toch getextureerd, wat wijst op variaties in samenstelling (figuur 4E'). Weefselsecties van een transmuraal linkerventrikelgebied van het luchtgedroogde en PMA-gekleurde weefselpreparaat werden gebruikt om PMA-selectiviteit voor collageen in pathologisch weefsel te valideren door te vergelijken met de trichrome kleuring van Masson (figuur 4F). PMA-kleuring was selectief voor collageen (sub-epicardium en sub-endocardium) en afwezig in regio's van overlevend myocardium (figuur 4G).

Hartmonster #4 met geïnduceerde aanhoudende atriale fibrillatie werd aan de lucht gedroogd met behoud van de oorspronkelijke vorm van de atriale holte. Instorting van het atriumaanhangsel werd niet waargenomen. De belangrijkste anatomische oriëntatiepunten konden morfologisch worden geïdentificeerd uit gereconstrueerde beelden (het atriumtussenschot, pectinaatspieren, coronaire sinus, pulmonale ader ostia, vena cava en cristae terminalis). Diffusiekleuring onder vacuüm resulteerde in contrastverbetering in de aortawortel en atrioventriculaire kleppen en discrete gebieden van het werkende myocardium. Spierkleuringsverbetering was beperkt tot de atriale aanhangsels en achterwanden van zowel linker- als rechterboezems (figuur 5).

Figuur 1: MicroCT-beeldvorming van een luchtgedroogd varkenshart behandeld met PMA-contrastmiddel door diffusie onder vacuüm. (A) Röntgenprojectiebeeld. (B) Een transmissieprofiel geëxtraheerd uit de rode lijn in A. (C) Plakje met korte as van de ventrikels uit een topografisch gereconstrueerd driedimensionaal volume. Gele pijlen geven punctate contrastgebieden aan die worden toegeschreven aan sub-endocardiale Purkinje-vezels. Blauwe pijlen geven vasculatuur aan. (D) Signaalintensiteitsverdeling van de gereconstrueerde beeldschijf weergegeven in C. LV: linker ventrikel en RV: rechter ventrikel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Validatie van PMA-selectiviteit voor collageen. (A) Masson's trichrome kleuring van een transmurale weefselsectie uit de ventrikels van een aan de lucht gedroogd hart. Myocardium is rood gekleurd en collageen wordt weergegeven met groene kleuring. Aangrenzende weefselsecties (B) zonder kleuring of (C) gekleurd met PMA (1%) werden afgebeeld met heldere veldverlichting om de uniformiteit van kleuring te beoordelen. (D) Weefselsecties zonder kleuring of (E) gekleurd door PMA werden in beeld gebracht door fluorescerende microscopie. Panelen D' (effen rood vak) en E' (onderbroken rood vak) zijn vergrote weergaven van het sub-epicardium voor niet-gekleurde en PMA-gekleurde secties. Panelen D'' (effen blauwe doos) en E'' (onderbroken blauwe doos) zijn overeenkomstige vergrote weergaven van het sub-endocardium en een vrijlopende Purkinje-vezel. Pijlen geven plaatsen van collageengehalte aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Perfusiebelasting van PMA voorafgaand aan luchtdroging en MicroCT-beeldvorming. (A) Een plakje met korte assen van een gereconstrueerd beeldvolume van de ventrikels uit een varkenshart. Blauwe pijlen geven vasculatuur aan. (B) De signaalintensiteitsverdeling van het beeldsegment van paneel A. LV: linker ventrikel en RV: rechter ventrikel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: MicroCT-beeldvorming van een schapenhart met een chronisch myocardinfarct. (A) In het apicale gebied werd een dicht litteken gevormd (zie inzetfoto). Een volumeweergave van het apicale gebied vanuit een endocardiaal perspectief kreeg kleuring toegewezen op basis van beeldintensiteit (rood overeenkomend met littekenweefsel en myocardium in groen). Orthogonale plakjes van de grijstintenintensiteit tonen de dichte littekenverdeling en grenzend aan overlevend myocardium. Scheiding tussen fibrotisch weefsel en myocardium komt overeen met regio's van vetweefsel. (B) Een foto van een luchtgedroogd ventriculaire wigpreparaat van een schaap met apicale littekens na een hartinfarct. Schuine plakjes van het gereconstrueerde microCT-beeldvolume doorkruisen de ventrikels op het middenniveau tussen basis en top en proximaal tot de plaats van (C) vasculaire occlusie (C- rode lijn in paneel B), (D) het peri-infarctgebied grenzend aan dicht litteken en gezond myocard (D- blauwe lijn in paneel B) en (E) een gebied van dichte fibrose (E - groene lijn in paneel B). (C') Een uitgebreide weergave van het septumgebied omlijnd door een rood onderbroken vak in C. (d') Een uitgebreide weergave van het infarctgebied in de rechter ventriculaire apex (blauw onderbroken vak in paneel D). (E') Een uitgebreide weergave van het infarctgebied in de linkerventrikeltop (groen vak met stippel in paneel E). LV: Linkerventrikelholte; RV: rechterventrikelholte; MB: moderator band; Pap: papillaire spier. Gele pijl geeft linker voorste dalende slagader aan. (F) Masson's trichrome kleuring van een histologische sectie gesneden uit de PMA-gekleurde luchtgedroogde linker ventrikel. Collageen is blauw gekleurd en myocardium is roze /violet gekleurd. (G) Een overeenkomstig weefselgedeelte van de PMA-kleuringsverdeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: MicroCT-beeld van een schapenhart na chronisch geïnduceerd atriumfibrilleren. (A) Een volumeweergave van de boezems met kleuring toegewezen zoals in figuur 4A. (B) Bi-atriale microCT-beeldschijf in de lange as van het hart. Plakjes met een korte as werden geëxtraheerd ter hoogte van de (C) atrioventriculaire kleppen (C- rode lijn in paneel B), (D) aortawortel (D- blauwe lijn in paneel B) en (E) linker atriale dak (E- groene lijn in paneel B). LA: linker boezems; RA: rechte atria; LAA: linker atriumaanhangsel; RAA: rechter atriumaanhangsel; LV: linker ventrikel; RV: rechter ventrikel; LVOT: linkerventrikeluitstroomkanaal; RVOT: rechterventrikeluitstroomkanaal en PA: longslagader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Monster #	1	2	3	4
Soort	Varken	Varken	Schaap	Schaap
Lichaamsgewicht (kg)	32.4	31.2	47.2	53.4
Gewicht van het hart (g)	191.2	186.2	202.4	207.6
Pathologie	-	-	Chronische MI	Chronische AF
Monstervoorbereiding	Heel hart	Heel hart	Wig van het voorste hart	Heel hart
Wijze van contrastbelasting	Diffusie	Perfusie	Diffusie	Diffusie
Belichting van contrastmiddelen (h)	48	24	48	48

Tabel 1: Behandeling van hartmonsters en contrastmiddelen.

Discussie

Een gedetailleerd protocol voor preparaten voor groot weefsel is opgesteld met behulp van hele harten van grote zoogdieren voor daaropvolgende structurele beeldvorming met hoge resolutie. Een luchtdrogende benadering verwijderde invloeden van achtergrond-röntgenverzwakking en maximaal optimaliseren van weefsel: achtergrondcontrast²⁹. Met behulp van deze aanpak werd een isotrope resolutie in het bereik van 20 μm bereikt voor volumetrische beeldvorming over monsters met een diameter tot 7,2 cm. MicroCT van zacht weefsel is echter meestal afhankelijk van het gebruik van niet-specifieke contrastmiddelen om de röntgenabsorptie en gevoeligheid van microCT-systemen te^{verbeteren 34}. Hoewel röntgencontrastmiddelen de algehele verzwakking van röntgenstralen en de verbetering van de beeldvorming van zacht weefsel verbeteren, blijft de scheiding van weefselbestanddelen op basis van biochemische samenstelling een uitdaging. Er werd echter waargenomen dat het gebruik van luchtgedroogde harten in combinatie met een gemeenschappelijk röntgencontrastmiddel in de laboratoriumomgeving, PMA, selectief gekleurde extracellulaire componenten. Bindweefsel geassocieerd met gezond myocardium en pathologische structurele remodellering bij chronische ziekten werden versterkt.

Het proces van luchtdrogend biologisch weefsel vereist een interventie om de vervorming van het monster te weerstaan. Monstervoorbereiding voor elektronenmicroscopie heeft vergelijkbare vereisten. Meestal wordt een kritische puntdroogmethode gebruikt, die een balans van weefselonderdompelingsmedium, temperatuur en druk gebruikt om de oppervlaktespanning van het vloeistofgehalte van het weefsel te elimineren, wat vervorming op moleculair niveau veroorzaakt bij verdamping³⁵. Deze aanpak vereist een uniforme vervanging van het watergehalte van het monster door vloeibaar kooldioxide, dat betrouwbaarder is in kleine en gemakkelijk verspreidbare monsters. Als alternatief kan de structurele integriteit van het weefsel worden verbeterd en kan luchtdroging, d.w.z. de verdampingsfase, over een langere periode worden toegepast om de algehele vervorming te verminderen. Het molecuul HMDS ondergaat silylatatie om een op siliconen gebaseerde steiger te vormen om de moleculaire organisatie van het weefselmonster te versterken en te stabiliseren³⁶. De verdamping wordt verder verlengd door circulerende luchtstromen uit de omgeving te beperken, ook om inhomogene verdamping te voorkomen, met name tussen het monsteroppervlak en de intramurale lagen.

Talrijke contrastmiddelen zijn eerder gebruikt voor microCT-beeldvorming van zachte weefsels. De meest voorkomende zijn jodium, fosfotungstic acid (PTA) en PMA. Jodium in het bijzonder is gebruikt als gevolg van een hogere diffusiesnelheid 34,37,38. Niettemin werkt jodium als katalysator voor de silylatatie van HMDS-reagens³⁶. De gekatalyseerde reactie is agressief en exotherm, met een hoog risico op vernietiging van het monster en veiligheidsrisico als resterende HMDS achterblijft als gevolg van onvolledige uitdroging van het monster. Zowel PTA als PMA opgelost in ethanol kunnen veilig worden gebruikt in combinatie met HMDS. Van PTA en PMA is aangetoond dat ze een groter oplossend vermogen van fijne structuren in niet-gemineraliseerde tussenwervelschijven bieden in vergelijking met jodiumkleuring³⁸. In microCT-beeldvorming van zoogdiermonsters zijn PTA en PMA gebruikt voor het kleuren van muizenembryo's³⁹, muis cardiovasculair systeem³⁷, konijnenspier en hersenen⁴⁰ en varkensaders⁴¹. PTA heeft een hogere moleculaire massa en dichtheid in oplossing dan PMA. Dit komt mede door een hogere atoommassa van wolfraam (atoomnummer is 74 g/mol), het belangrijkste dempende element in PTA. Ter vergelijking: het zwaarste element in PMA, molybdeen, heeft een atoomnummer van 42 g/mol. Zowel atoommassa als monsterdichtheid liggen ten grondslag aan röntgenverzwakking, naast de monsterdikte⁴². Door de lengte van het röntgenpad te vergroten door de monstergroottes te vergroten, wordt röntgenverzwakking gevoeliger voor een verhoogde monsterdichtheid. Daarom werd het PMA-contrastmiddel met lagere dichtheid geselecteerd om het risico op oververzwakking te verminderen en het dynamische bereik van beeldcontrast voor harten van mensachtige schaal te optimaliseren. Verder bewijs heeft aangetoond dat diffusie-belasting van PMA meer homogene kleuring geeft dan voor het grotere molecuul PTA in hartweefsel⁴³.

De methode voor de toediening van contrastmiddelen heeft invloed op de uniformiteit van de verdeling van contrastmiddelen in hartweefsel (figuur 3). Perfusie van contrastmiddelen in het ethanol-gedehydrateerde hart vertoonde fragmentarische achtergrondkleuringsniveaus van PMA als gevolg van variabele vasculaire weerstand. In het luchtgedroogde hart wordt de spierlamminaire structuur benadrukt door het monsteruitdrogingsproces, waardoor de laminaire scheiding van de spieren toeneemt. Dit verbeterde uiteindelijk de algehele permeabiliteit van het weefsel voor diffusie-gebaseerde contrastmiddelbelasting. Bijgevolg vergemakkelijkte luchtdroging weefsel: luchtcontrast op laminair en intra-laminair niveau (figuur 4). Bovendien kan diffusiebelasting verder worden vergemakkelijkt door toepassing onder vacuüm. Verder is aangetoond dat weefselkrimp van niet-gedroogde monsters afhankelijk is van de concentratie van contrastmiddelen⁴⁰. Eerdere morfologische stabilisatie van het monster door luchtdroging remt echter weefselkrimpeffecten²⁹.

MicroCT-beelden met hoge resolutie van hele organen produceren inherent grote gegevensvolumes. De aard van tomografische beeldvormingstechnieken maakt visualisatie en beeldverwerking op een slice-by-slice-basis mogelijk, wat de computerverwerking en geheugenbelasting verlicht. Om echter driedimensionale afbeeldingsstapels te visualiseren, bijvoorbeeld om specimenvolumes in driedimensionale weergaven weer te geven, zijn de aanbevolen minimale computerspecificaties 128 GB RAM en een processorsnelheid van 3 GHz. Solid-state harde schijven hebben ook de gegevensoverdracht sterk verbeterd.

De opkomst van microCT-beeldvorming op cardiaal gebied biedt tal van voordelen voor translationele studies en klinische validatie. De voordelen van de driedimensionale en micrometrische beeldvorming hebben al toepassingen aangetoond bij het bepalen van de trombotische belasting van ST-elevatie myocardiale ischemiepatiënten^44,45. Het in kaart brengen van potentiële bronnen van aritmie bij patiënten met structurele hartaandoeningen is grotendeels afhankelijk van het bepalen van de verdeling van fibrotisch littekenweefsel en het lokaliseren van verweven sporen van overlevend myocardium. Tweedelijnsbenaderingen voor de diagnose van ventriculaire aritmieën maken gebruik van magnetische resonantiebeeldvorming⁴⁶. Het kan dichte fibrose robuust lokaliseren, maar is beperkt tot morfologische karakterisering met lage resolutie en biedt beperkt inzicht in microstructurele remodellering en diffuse distributies van fibrotische laesies⁴⁷. Onderzoek met hoge resolutie van littekenverdeling en karakterisering heeft een enorm potentieel voor het verbeteren van ons begrip van cardiale structurele remodellering en het risico op het ontwikkelen van hartfalen. Met name fundamentele onderzoeksstudies of postmortale onderzoeken zullen baat hebben bij bevestigende structurele beelden voor het elektrisch in kaart brengen van hartritmestoornissen.

Kortom, harten versterkt met HMDS-behandeling en luchtdroging kunnen vervolgens worden gekleurd met een röntgencontrastmiddel om de röntgenverzwakking van extracellulaire componenten te verbeteren. Specifiek, in gezond myocardium, pma accumulatie vindt plaats op het epitheel, valvulair weefsel en compartimenten van het ventriculaire geleidingssysteem omhuld door bindweefsel resulteerde in verbeterde röntgenverzwakking. Bovendien was bij structureel ziek myocardium een verhoogd contrast verder selectief voor fibrose.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10% neutral buffered formalin	Diapath	F0043
Calcium chloride solution	Honeywell	21114
Canulation Tubing PTFE	VWR	DENE3400102
Constant Head 1L Reservoir	Harvard Apparatus	50-0496
D-(+)-Glucose	Sigma	G5767
Ethanol absolute	VWR	20821.330
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	796881
Heparin sodium (5000 U/mL)	Panpharma	3400891287301.
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma	440191-1L
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37%	Sigma	258148
Magnesium chloride solution	Honeywell	63020
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P5368
Phosphomolybdic acid hydrate	Fisher Scientific	417895000
Potassium Chloride	Sigma	P5405
Pump Tubing, 3-Stop	Ismatec	FV-96328-48
SkyScan, 1276	Bruker		micro CT
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium hydroxide solution 50% in H2O	Sigma	415413
Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	72-1407
Tubing pump	Ismatec	ISM 1089
Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm	VWR	228-1279
Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm	VWR	228-1283
Two-part single-use syringes 50 mL	Norm-Ject	4850001000	Pyrogen-free, PVC-free