Methodenartikel

Ontwikkeling van een celcocultuurmodel om cardiale ischemie /reperfusie in vitro na te bootsen

2.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62913

⸱

13 oktober 2021

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Vanderbilt University Medical Center, 2Anesthesiology, TVHS VA Medical Center, 3Department of Pharmacology, Vanderbilt University

In dit artikel

Samenvatting

Ruimtelijke afstand is een belangrijke parameter bij het beoordelen van hypoxie / reoxygenatieletsel in een co-cultuurmodel van afzonderlijke endotheel- en cardiomyocytencellagen, wat voor het eerst suggereert dat het optimaliseren van de co-culturele ruimtelijke omgeving noodzakelijk is om een gunstig in vitro model te bieden voor het testen van de rol van endotheelcellen in cardiomyocytenbescherming.

Samenvatting

Ischemische hartziekte is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van overlijden en invaliditeit. Reperfusie veroorzaakt extra letsel buiten ischemie. Endotheelcellen (EC's) kunnen cardiomyocyten (CM's) beschermen tegen reperfusieschade door cel-celinteracties. Coculturen kunnen helpen bij het onderzoeken van de rol van cel-cel interacties. Een gemengde co-kweek is de eenvoudigste benadering, maar is beperkt omdat geïsoleerde behandelingen en downstream-analyses van enkele celtypen niet haalbaar zijn. Om te onderzoeken of EC's dosisafhankelijk CM-celschade kunnen dempen en of deze bescherming verder kan worden geoptimaliseerd door de contactafstand tussen de twee cellijnen te variëren, gebruikten we muis primaire coronaire endotheelcellen en volwassen muis cardiomyocyten om drie soorten celkweekinzetstukken te testen die varieerden in hun intercellelijke laagafstand bij 0,5, Respectievelijk 1,0 en 2,0 mm. In CMs-only nam cellulair letsel zoals beoordeeld door lactaatdehydrogenase (LDH) afgifte significant toe tijdens hypoxie en verder na reoxygenatie wanneer de afstand 2,0 mm was in vergelijking met 0,5 en 1,0 mm. Wanneer EC's en CM's bijna direct contact hadden (0,5 mm), was er slechts een lichte demping van de reoxygenatieschade van CM's na hypoxie. Deze demping werd aanzienlijk verhoogd wanneer de ruimtelijke afstand 1,0 mm was. Met een afstand van 2,0 mm verzwakten EC's CM-letsel tijdens zowel hypoxie als hypoxie / reoxygenatie, wat aangeeft dat voldoende cultuurafstand nodig is voor EC's om te kruisverwijzingen met CM's, zodat uitgescheiden signaalmoleculen kunnen circuleren en beschermende paden volledig kunnen stimuleren. Onze bevindingen suggereren voor het eerst dat het optimaliseren van de EC / CM co-cultuur ruimtelijke omgeving noodzakelijk is om een gunstig in vitro model te bieden voor het testen van de rol van EC's in CM-bescherming tegen gesimuleerde ischemie / reperfusieletsel. Het doel van dit rapport is om onderzoekers een stapsgewijze aanpak te bieden om dit belangrijke model in hun voordeel te gebruiken.

Inleiding

Ischemische hartziekte is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van overlijden en invaliditeit 1,2. Het behandelingsproces van reperfusie kan echter zelf de dood van cardiomyocyten veroorzaken, bekend als myocardiale ischemie / reperfusie (IR) -letsel, waarvoor er nog steeds geen effectieve remedie is3. Er is gesuggereerd dat endotheelcellen (EC's) cardiomyocyten (CMs) beschermen door de secretie van paracriene signalen, evenals cel-tot-cel interacties4.

Celcocultuurmodellen zijn uitgebreid gebruikt om de rol van autocriene en /of paracriene cel-celinteracties op celfunctie en differentiatie te onderzoeken. Onder co-cultuurmodellen is gemengde co-cultuur de eenvoudigste, waarbij twee verschillende soorten cellen in direct contact staan binnen een enkel kweekcompartiment met een gewenste celverhouding5. Afzonderlijke behandelingen tussen celtypen en downstream-analyse van een enkel celtype zijn echter niet gemakkelijk haalbaar gezien de gemengde populatie.

Eerdere studies toonden aan dat hypoxische en ischemische beledigingen aanzienlijke schade toebrengen aan de integriteit van het celmembraan zoals gemeten door de afgifte van lactaatdehydrogenase (LDH). Dit letsel wordt verergerd bij reoxygenatie, waarbij reperfusieletselwordt nagebootst 6,7,8. Het doel van het huidige protocol was om de hypothesen te testen dat de aanwezigheid van EC's dosisafhankelijk celmembraanlekkage van CM's veroorzaakt door hypoxie en reoxygenatie (HR) kan dempen en dat het beschermende effect van EC's kan worden geoptimaliseerd door de contactafstand tussen de twee cellijnen te variëren. Daarom gebruikten we drie soorten celkweekinzetstukken en muis primaire coronaire endotheelcellen en cardiomyocyten van volwassen muizen. De inserts, gebrandmerkt door Corning, Merck Millipore en Greiner Bio-One, stelden ons in staat om drie verschillende celkweekkruisverwijzingen te creëren met intercellulaire afstanden van respectievelijk 0,5, 1,0 en 2,0 mm. Per inzetstuk werden telkens 100.000 EC's verguld.

Om te bepalen of de dichtheid van EC's in co-cultuur bijdraagt aan hr-letselverzwakking in dit model, bestudeerden we bovendien de dosis-responsrelatie tussen EC-concentratie en LDH-afgifte door CM's. EC's werden geplateerd op respectievelijk 25.000, 50.000 en 100.000 per insert in de insert van 2,0 mm.

Dit rapport biedt een stapsgewijze aanpak voor onderzoekers om dit belangrijke model in hun voordeel te gebruiken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Experimentele voorbereiding/beplating

  1. Onderhoud CM's en EC's volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Ontdooi beide cellijnen wanneer ze van leveranciers komen. Plaat in T25-kolven na het wassen met verse media. Het wordt aanbevolen om elk celkweekmedium te kopen bij dezelfde leveranciers waar de cellen zijn gekocht. Ververs de volgende dag de cellen met media en gebruik deze bij confluent.
    2. Houd de celkweekincubator op 37 °C met 21% O2, 5% CO2, 74% N2 en bevochtigd.
      OPMERKING: De primaire coronaire endotheelcellen van de muis die in dit protocol worden gebruikt, worden geïsoleerd uit kransslagaders van C57BL / 6-muizen en cardiomyocyten van volwassen muizen worden geïsoleerd uit volwassen C57BL / 6J-muizenharten en commercieel verkregen (zie Tabel met materialen).
  2. Plaat-CMs onder steriele omstandigheden op de bodem van 24-well platen (inferieure laag). 24 uur later, plaat EC's in de insert (of een groter deel) van de co-kweekput. Plaats 24 uur na ec-beplating ec-inzetstukken op cm-plaatbodems, waarbij de cokweekperiode begint. Laat de cellen voor gebruik minstens 12-24 uur meekleven. Deze stappen worden hieronder in detail beschreven.
    1. Schat cm cellijn confluency onder een lichtmicroscoop. Wanneer cellen 90% -100% confluent lijken te zijn in kweekkolven, ga dan verder met experimentele plating.
    2. Verwijder de media uit de kolven met confluentcelculturen en trypsiniseren met 3-5 ml trypsine/ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) voor T25-kolven. Roer de kolf voorzichtig, incubeer bij 37 °C gedurende 2-5 minuten en beoordeel vervolgens de enzymatische voortgang onder een lichtmicroscoop. Zodra de cellen beginnen af te ronden, gebruikt u een celschraper om de cellen van het oppervlak los te maken.
    3. Inactiveer na het losmaken de trypsine-oplossing door de trypsine/celoplossing toe te voegen aan een buis van 50 ml met 10 ml media voor T25-kolven. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 2 minuten bij 120 x g om een zachte celkorrel te verkrijgen. Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in 5 ml media.
    4. Om het tellen van cellen uit te voeren en de levensvatbaarheid van cellen te bevestigen, mengt u een aliquot van 10 μL geresuspendeerde cellen en 10 μL trypan blauwe kleurstof. Tel de levende cellen met behulp van een celteller. Verdun de cellen met verse reguliere media om de gewenste zaaidichtheden te bereiken. Volumes worden berekend afhankelijk van de gewenste zaaddichtheid en celconcentratie van stamoplossingen. Alle beplating moet onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd.
    5. Plaat-CM's bij zaaidichtheden van 300.000 per put op de bodem van een 24-putplaat voorgecoat met extracellulaire matrix. Houd de cellen 's nachts op 37 °C met 21% O2 en 5% CO2 .
    6. Na 24 uur worden EC's in inserts geplaatst met een optimale beplatingsdichtheid van 100.000 per insert (kweekgebied is 33,6 mm2) (figuur 1). Plaats na 24 uur EC-beplating EC-inserts in de CM-putten, waardoor de co-kweek wordt gestart. Laat cellen 12-24 uur meekleven voordat de experimenten worden uitgevoerd.
    7. Zorg ervoor dat tegen de tijd dat experimenten worden uitgevoerd, zowel CM's als EC's 80% -90% samenvloeiing hebben bereikt.

2. Hypoxie/reoxygenatie om ischemie/reperfusieschade in vitro te simuleren

OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd zoals beschreven, pauzeer niet tussendoor.

  1. Bereid de hypoxische media voor door ~ 25 ml media in een conische buis van 50 ml te gieten. Luchtdicht de bovenkant af met een siliconenmembraan en gebruik een gesteriliseerde pipet om een gat te ponsen. Maak nog een gat, dit keer laat de pipet ongeveer 2/3 ondergedompeld in de media.
  2. Spoel de media gedurende 5 minuten met hypoxisch gas (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99% N2) met een debiet van 30 l/min. Dit minimaliseert O2 opgelost in de media wanneer hypoxie begint (stap 2.5).
  3. Gooi de media van de 24-well platen of kweekinzetstukken met aangehechte cellen weg en was met 100 μL/putje van 10% Phosphate Buffered Saline (PBS) heel voorzichtig. Voeg daarna 500 μL van de vers bereide hypoxische media toe aan elk putje van de platen of inserts.
    OPMERKING: Hypoxie in de media wordt tijdens deze stap zo kort mogelijk onderbroken voordat echte hypoxie voor cellen en media begint in stap 2.5.
    1. Vervang in de normoxische controlegroep de oorspronkelijke media door verse normale media die glucose en serum bevatten.
  4. Bevochtig de hypoxiekamer door een petrischaal gevuld met steriel water in de kamer te plaatsen. Plaats vervolgens de platen bestaande uit de hypoxische groepen in de kamer.
  5. Spoel de hypoxiekamer met hypoxisch gas (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99% N2) gedurende 5 minuten bij een debiet van 30 L/min. Plaats de kamer gedurende 24 uur in de incubator van 37 °C.
  6. Kweek na hypoxie CM's en EC's onder normale omstandigheden. Om dit te doen, gooit u de oude media van de platen/inserts weg, vervangt u deze door normale media (met glucose en serum; 500 μL van elke put/insert) en bewaart u deze gedurende 2 uur in de incubator onder normale kweekomstandigheden (21% O2, 5% CO2, 74% N2, 37 °C) om reperfusie na te bootsen.
  7. Om de effecten van mediavervanging te controleren, verandert u de media van normoxische cellen op hetzelfde moment dat de hypoxische media worden gewijzigd.
    OPMERKING: Figuur 2 geeft een schematisch overzicht van dit protocol.

3. Eindpuntbeoordeling

  1. Breng de celkweekmedia van de 24-putplaat over in een 96-putplaat. Gebruik 200 μL media uit elke put van de 24-well plaat en verdeel dienovereenkomstig in vier putten van de 96-well plaat. Gebruik elk één plaat voor normoxie versus hypoxie versus HR.
  2. Bepaal de mate van cellulair letsel, bijvoorbeeld door de absorptie voor LDH te meten met behulp van een cytotoxiciteitstestkit volgens de instructies van de fabrikant. Voer de test uit in een 96-well plaat zoals geïnstrueerd in het assayprotocol.

4. Statistieken

  1. Geef de parametrische gegevens weer als gemiddelde/standaarddeviatie en niet-parametrische gegevens als boxplots met mediaan/interkwartielbereik. Er moeten adequate parametrische versus niet-parametrische meervoudige vergelijkingstests met aanvaardbare post-hoctests worden uitgevoerd om de kans op een type-1-fout te verkleinen. Significantie wordt meestal ingesteld op een alfa van 0,05 (tweezijdig).
  2. Voor alle experimenten die in de huidige studie zijn uitgevoerd, moet u ten minste drie goed repliceren uitvoeren binnen één experiment. Er waren drie tot zes herhalingen van elk experiment dat werd gebruikt voor statistische analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Alle drie de soorten inserts (A, B, C) die in dit experiment worden gebruikt, hebben dezelfde poriegrootte van 0,4 μm. Het enige verschil tussen hen is de insert-to-base hoogte, waardoor afstanden tussen de twee samengekweekte cellagen respectievelijk 0,5, 1,0 en 2,0 mm kunnen zijn (figuur 3) en dat ze van verschillende leveranciers zijn (zie tabel met materialen voor details).

Om een in vitro co-kweekmodel op te zetten met afzonderlijke ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kritieke stappen in het protocol
Celco-cultuurmodellen zijn gebruikt om cellulaire mechanismen van cardioprotectie te bestuderen. Het creëren van twee afzonderlijke lagen met een betekenisvolle afstand ertussen is dus cruciaal voor de ontwikkeling van een geschikt co-cultuurmodel. Een uitdaging bij het bestuderen van gesimuleerde IR, d.w.z. HR, letsel is dat niet alleen ischemie (hypoxie) zelf, maar ook reperfusie (reoxygenatie) cellulaire disfunctie verergert. Daarom moet een realistisch model deze k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Us Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory R&D Service (I01 BX003482) en door institutionele fondsen aan M.L.R.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)Celprogen Inc11041-14Geïsoleerd uit hartweefsel van volwassen C57BL/6J muis
Automated Cell Counter Countess IIInvitrogenA27977Celtelling voor het berekenen van celaantal
Bio-Safety CabinetNuaireNU425400Steriele kap voor celcultuur
Cell Culture Freezing MediumCell Biologics Inc6916Gebruikt voor celvrieswerk voor lange termijn celopslag
Cell Culture IncubatorNuaireNu-5500Om normale leefomstandigheden voor cellen te bieden (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, bevochtigd)
Cell Culture Incubator Gas TankA-L Compressed GasesUN1013Gas voor celcultuur incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)Corning Inc353095Gebruikt voor EC-CM co-cultuur
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)Millicell MilliporePIHP01250Gebruikt voor EC-CM co-cultuur
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)Greiner Bio-One662640Gebruikt voor EC-CM co-cultuur
CentrifugeAnstel Enterprises Inc4235Voor celcultuur plateren en passeren
CMs Cell Culture Flasks T25Celprogen IncE11041-14Gebruikt voor reguliere CMs-cultuur, gecoat door fabrikant
CMs Cell Culture Medium CompleteCelprogen IncM11041-14SVolledige CMs-cultuurmedium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol freeCelprogen IncM11041-14PNCMs-cultuurmedium zonder fenol rood gebruikt tijdens LDH-meting
CMs Cell Culture Plates 96 wellCelprogen IncE11041-14-96wellGebruikt voor experimenten van LDH-meting, gecoat door fabrikant
CMs Hypoxia Cell Culture MediumCelprogen IncM11041-14GFPNCMs-celcultuur onder hypoxische omstandigheden (glucose- en serumvrij)
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283Tellende slides gebruikt voor celteller
Cyquant LDH Cytotoxicity KitThermo ScientificC20301LDH-meetkit
ECs Cell Culture Flasks T25Fisher ScientificFB012935Gebruikt voor reguliere ECs-cultuur
ECs Cell Culture Medium CompleteCell Biologics IncM1168Volledige ECs-cultuurmedium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol freeCell Biologics IncM1168PFECs-cultuurmedium zonder fenol rood gebruikt tijdens LDH-meting
ECs Cell Culture Plates 96 wellFisher Scientific (Costar)3370Gebruikt voor experimenten van LDH-meting
ECs Culture Gelatin-Based Coating SolutionCell Biologics Inc6950Gebruikt voor het coaten van flesschen en platen voor ECs
ECs Hypoxia Cell Culture MediumCell Biologics IncGPF1168ECs-celcultuur onder hypoxische omstandigheden (glucose- en serumvrij)
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher ScientificMT35011CVFBS-HI USDA-goedgekeurd voor celcultuur en onderhoud
Hypoxia ChamberStemCell Technologies27310Om een hypoxische omgeving met 0,01%O2 te creëren
Hypoxia Chamber Flow MeterStemCell Technologies27311Om te verbinden met hypoxische gastank voor een consistente gasstroomsnelheid
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)A-L Compressed GasesUN1956Gebruikt om hypoxisch medium en kamer te spoelen (0,01%O2/5%CO2/94,99N2)
MicroscopeNikonTMSOm celconditie waar te nemen
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)Cell Biologics IncC57-6093Geïsoleerd uit coronaire slagader van C57BL/6 muizen
NUNC 15ML CONICL TubesFisher Scientific12565269Voor celcultuur proces, experimenten, oplossingsvoorbereiding etc.
NUNC 50ML CONICL TubesFisher Scientific12565271Voor celcultuur proces, experimenten, oplossingsvoorbereiding etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8662Gebruikt voor celwassen tijdens cultuur of experimenten
Plate ReaderBioTek Instrument11120533Colorimetrische of fluorometrische platenlezing
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)Fisher Scientific12565226Gebruikt voor LDH-meting platenlezing
Trypsin/EDTA for CMsCelprogen IncT1509-0141 x sterieel gefilterd en getest voor weefselcultuur
Trypsin/EDTA for ECsCell Biologics Inc6914/06190,25%, getest voor celcultuur

Referenties

  1. Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).
  2. Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target. The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).
  3. Gottlieb, R. A. Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).
  4. Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease. The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).
  5. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Studying cell-cell communication in co-culture. Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).
  6. Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury. Pharmacology Research & Perspectives. 8 (6), 00639(2020).
  7. Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).
  8. Martindale, J. J., Metzger, J. M. Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).
  9. vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device. Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).
  10. Bidarra, S. J., et al. Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells. Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).
  11. Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PloS One. 6, 25661(2011).
  12. Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures. PloS One. 7, 31711(2012).
  13. Miki, Y., et al. The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).
  14. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  15. Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6, 25661(2011).
  16. Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Reperfusieschadeendotheelcellencardiomyocytenhypoxie reoxygenatieLDH vrijgavecel celinteractiesin vitro modelcultuurinserts

Gerelateerde artikelen