Methodenartikel

Gemultiplexte fluorescerende immunohistochemische kleuring van vier endometriumimmuunceltypen bij terugkerende miskraam

DOI:

10.3791/62931

⸱

4 augustus 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 2Department of Orthopaedics and Traumatology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, Shenzhen Baoan Women’s and Children’s Hospital, Shenzhen University, 4School of Medicine, Faculty of Medicine and Health Sciences, Keele University, 5Li Ka Shing Institute of Health Sciences; School of Biomedical Sciences, The Chinese University of Hong Kong

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondanks de vooruitgang in multiplex immunohistochemie en multispectrale beeldvorming, blijft het karakteriseren van de dichtheid en clustering van belangrijke immuuncellen tegelijkertijd in het endometrium een uitdaging. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd multiplexkleuringsprotocol en beeldvorming voor de gelijktijdige lokalisatie van vier immuunceltypen in het endometrium.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunohistochemie is de meest gebruikte methode voor de identificatie en visualisatie van weefselantigenen in biologisch onderzoek en klinische diagnostiek. Het kan worden gebruikt om verschillende biologische processen of pathologieën te karakteriseren, zoals wondgenezing, immuunrespons, weefselafstoting en weefsel-biomateriaalinteracties. De visualisatie en kwantificering van meerdere antigenen (vooral voor immuuncellen) in een enkele weefselsectie met behulp van conventionele immunohistochemische (IHC) kleuring blijft echter onbevredigend. Vandaar dat de afgelopen jaren multiplextechnologieën zijn geïntroduceerd om meerdere biologische markers te identificeren in een enkel weefselmonster of een ensemble van verschillende weefselmonsters.

Deze technologieën kunnen vooral nuttig zijn bij het differentiëren van de veranderingen in immuuncel-cel-naar-cel interacties binnen het endometrium tussen vruchtbare vrouwen en vrouwen met terugkerende miskramen tijdens implantatie. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor multiplexed fluorescentie IHC-kleuring om de dichtheid en clustering van vier belangrijke immuunceltypen tegelijkertijd te onderzoeken in nauwkeurig getimede endometriummonsters tijdens embryo-implantatie. De methode omvat monstervoorbereiding, multiplexoptimalisatie met markers voor immuuncelsubtypen en het scannen van de dia's, gevolgd door gegevensanalyse, met specifieke verwijzing naar het detecteren van endometriumimmuuncellen.

Met behulp van deze methode kunnen de dichtheid en clustering van vier belangrijke immuunceltypen in het endometrium tegelijkertijd worden geanalyseerd in een enkele weefselsectie. Daarnaast zal dit artikel de kritieke factoren en probleemoplossing bespreken om mogelijke fluorofoorinterferentie tussen de fluorescerende sondes die worden toegepast te overwinnen. Belangrijk is dat de resultaten van deze multiplexkleuringstechniek kunnen helpen een diepgaand inzicht te krijgen in de immunologische interactie en regulatie tijdens embryo-implantatie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terugkerende miskraam (RM) kan worden gedefinieerd als het verlies van twee of meer zwangerschappen vóór 24 weken zwangerschap1. Deze frequente reproductieve aandoening treft tot 1% van de paren wereldwijd2,3. De pathofysiologie is multifactorieel en kan worden onderverdeeld in embryologisch gedreven oorzaken (voornamelijk als gevolg van een abnormaal embryonaal karyotype) en maternale oorzaken die het endometrium en / of placenta-ontwikkeling beïnvloeden. Deze manifestatie kan het gevolg zijn van ouderlijke genetische afwijkingen, baarmoederafwijkingen, protrombotische aandoeningen, endocrinologische factoren en immunologische aandoeningen4.

In de afgelopen jaren is immuuneffectorceldisfunctie betrokken geweest bij de pathogenese van vroeg zwangerschapsverlies5. Dit heeft veel onderzoeken geïnspireerd naar het ophelderen van de specifieke populaties van immuuncellen in het baarmoederslijmvlies tijdens de menstruatiecyclus, implantatie en vroege zwangerschap, met specifieke rollen in de vroege zwangerschap. Onder deze immuuncellen spelen baarmoeder natural killer (uNK) cellen een cruciale rol tijdens embryo-implantatie en zwangerschap, met name in de processen van trofoblastische invasie en angiogenese6. Studies hebben een verhoogde uNK-celdichtheid aangetoond in het endometrium van vrouwen met RM7,8, hoewel deze bevinding niet geassocieerd was met een verhoogd risico op een miskraam9. Dit stimuleerde echter onderzoek naar de dichtheid van andere immuunceltypen (zoals macrofagen, baarmoederdendritische cellen) in het endometrium bij vrouwen met RM10,11. Niettemin blijft het onzeker of er een significante verandering is in de immuunceldichtheid in het peri-implantatie endometrium bij vrouwen met RM.

Een mogelijke verklaring voor de onzekerheid is dat evaluatie van de endometrium immuunceldichtheid moeilijk kan zijn vanwege de snelle veranderingen in het endometrium tijdens het venster van implantatie. Gedurende het tijdsbestek van 24 uur veranderen significante veranderingen in het endometrium de immuunceldichtheid en cytokinecretie, waardoor een bron van variatie in deze resultaten wordt geïntroduceerd12. Bovendien vertrouwen de meeste rapporten voornamelijk op het gebruik van eencellige kleuring (bijv. Traditionele IHC-methoden) die niet meerdere markers op hetzelfde weefselgedeelte konden onderzoeken. Hoewel flowcytometrie kan worden gebruikt voor het detecteren van meerdere celpopulaties in een enkel monster, belemmeren de grote hoeveelheden cellen die nodig zijn en de tijdrovende optimalisatie de populariteit en efficiëntie van deze methode. Vandaar dat de recente vooruitgang in multiplex IHC-kleuring dit probleem zou kunnen oplossen door meerdere markers op dezelfde dia te immunostainen om meerdere parameters te evalueren, waaronder cellijn en histologische lokalisatie van individuele immuunsubpopulaties. Verder kan deze technologie de verkregen informatie maximaliseren in geval van beperkte beschikbaarheid van weefsel. Uiteindelijk kan deze techniek helpen bij het ophelderen van de verschillen in immuuncelinteracties in het baarmoederslijmvlies tussen vruchtbare vrouwen en vrouwen met RM.

Twee groepen vrouwen werden gerekruteerd uit het Prince of Wales Hospital, waaronder vruchtbare controlevrouwen (FC) en vrouwen met onverklaarbare terugkerende miskraam (RM). Vruchtbare controle werd gedefinieerd als vrouwen die ten minste één levende geboorte hadden zonder enige geschiedenis van spontane miskraam, en RM-vrouwen werden gedefinieerd als degenen die een voorgeschiedenis hadden van ≥2 opeenvolgende miskramen vóór 20 weken zwangerschap. De proefpersonen uit de twee groepen voldeden aan de volgende inclusiecriteria: (a) leeftijd tussen 20 en 42 jaar oud, (b) niet-roker, (c) regelmatige menstruatiecyclus (25-35 dagen) en normale baarmoederstructuur, (d) geen gebruik van een hormonaal regime gedurende ten minste 3 maanden vóór de endometriumbiopsie, (e) geen hydrosalpinx door hystero-salpingogram. Bovendien hadden alle gerekruteerde proefpersonen normale karyotypering, normaal 3-dimensionaal echografie hysterosalpingogram, dag 2 follikelstimulerend hormoon < 10 IE / L, mid-luteale progesteron > 30 nmol / L, normale schildklierfunctie en negatief getest op lupus anticoagulantia en anticardiolipine IgG- en IgM-antilichamen.

Om de immunologische basis van RM beter te begrijpen, zou het het meest wenselijk zijn om tegelijkertijd de belangrijkste immuunceltypen die aanwezig zijn in het endometrium op het moment van implantatie te kwantificeren en te lokaliseren. Dit artikel beschrijft het volledige protocol van monstervoorbereiding, de multiplexoptimalisatie met markers voor immuuncelsubtypen en het scannen van de dia's, gevolgd door gegevensanalyse met specifieke verwijzing naar het detecteren van endometriumimmuuncellen. Bovendien beschrijft dit artikel hoe de dichtheid en clustering van de immuunceltypen tegelijkertijd in het endometrium kunnen worden bepaald.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie werd goedgekeurd door de Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de deelnemers voordat de endometriumbiopten werden verzameld. Raadpleeg het introductiegedeelte voor de inclusiecriteria van de controle- en RM-groepen.

1. Monstervoorbereiding

  1. Zorg ervoor dat alle vrouwen in deze studie een dagelijkse urinepeilstoktest ondergaan vanaf dag 9 van de menstruatiecyclus om de luteïniserende hormoon (LH) -piek te identificeren om ovulatie te detecteren, en time de endometriumbiopten precies op de7e dag na de LH-piek (LH + 7).
  2. Verkrijg een 0,5 cm2 fragment van de endometriumbiopsie met behulp van een Pipelle sampler of Pipet Curet van vruchtbare vrouwen en vrouwen met onverklaarbare RM. Label de container en plaats het monster onmiddellijk in 10% neutraal gebufferde formaline (pH 7) voor nachtelijke fixatie bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Het volume van het fixatief moet 5-10 keer dat van weefsel zijn.
  3. Plaats het weefsel in een patroon voor uitdroging in een weefselverwerkingsmachine voordat u het ingesmolten paraffine insluit. Sluit de weefsels in paraffine in bij 58-60 °C.
  4. Laat het paraffineblok 's nachts afkoelen bij kamertemperatuur. Gebruik een microtoom om de paraffineblokken te trimmen tot een dikte van 3 μm.
    OPMERKING: Het gebruik van gedestilleerd water helpt bij de juiste weefselmontage en hechting tijdens multiplexkleuring.
  5. Plaats het paraffinelint in een waterbad bij 40-45 °C gedurende 30 s.
  6. Monteer de secties op poly-L-lysine (0,1% w / v) -gecoate microscoopglasglaasjes. Plaats de glaasjes met het weefsel naar boven gericht en laat een nacht drogen bij 37 °C. Bewaar de dia's in een schuifdoos uit de buurt van extreme temperaturen tot verder gebruik.

2. Bepaal de ideale concentratie van antilichamen voor multiplex IHC met behulp van conventionele IHC.

OPMERKING: Dit is belangrijk voor het identificeren van het expressieniveau en het patroon van elke immuunmarker in het endometriummonster en het bepalen van de kleuringsvolgorde van elke marker en hun geassocieerde tyramidesignaalversterking (TSA) fluorofoorparen.

  1. Test de antilichamen op hun geschiktheid voor multiplex IHC met behulp van handmatige conventionele IHC13.
  2. Gebruik endometriumweefsels voor het testen van één antilichaam.
  3. Neem een positieve controle (bijv. Milt) en negatieve controle (isotypecontrole) op voor het optimaliseren van de kleuringsconditie van elk antilichaam.
  4. Voer de kleuring uit met behulp van de verdunning die wordt aanbevolen door het gegevensblad van het antilichaam.
  5. Voer extra kleuring uit met concentraties boven en onder de aanbevolen verdunning die in stap 2.3 is gebruikt.
    OPMERKING: Een klinisch patholoog moet de bevlekte dia's blindelings beoordelen om de lokalisatie van het antilichaamonderzoek en de cellulaire integriteit te bevestigen.

3. Multiplex kleurmethode

  1. Diavoorbereiding en fixatie
    1. Leg de glaasjes (vanaf stap 1.6) plat met het weefsel naar boven gericht in een oven en bak gedurende ten minste 1 uur op 60 °C.
    2. Haal de platen uit de oven en laat ze minstens 20 minuten afkoelen bij kamertemperatuur voordat je ze in een verticaal schuifrek plaatst.
    3. Was en rehydrateer de formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde dia's met 10 min toegewezen aan elk van de volgende stappen: xyleen (2x), 100% ethanol (2x), 95% ethanol (1x), 70% ethanol (2x) en gedestilleerd water (2x).
    4. Plaats het rek met dia's in een plastic schuifdoos en dompel ze onder in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS, pH 7,6).
      OPMERKING: De dia's moeten vochtig blijven vanaf deze rehydratatiestap tot de montage in de laatste stap.
    5. Bevestig de monsters door de dia's gedurende 30 minuten in het donker onder te dompelen in een plastic diadoos gevuld met een mengsel van formaldehyde verdund in methanol (1:9).
    6. Was de glaasjes twee keer in gedeïoniseerd water gedurende 2 minuten en ga dan verder met het ophalen van antigeen.
  2. Epitoop ophalen
    1. Plaats het rek met dia's in een hittebestendige doos en vul deze met citroenzuurbuffer (pH 6,0) om de dia's te bedekken.
    2. Plaats de doos in de magnetron en verwarm de dia's gedurende 50 s op 100% vermogen gevolgd door 20 minuten op 20% vermogen om dezelfde temperatuur te behouden.
    3. Laat de glijbanen ongeveer 15 minuten afkoelen bij kamertemperatuur.
    4. Spoel de glaasjes gedurende 2 minuten in water, gevolgd door TBS-Tween 20 (TBST) gedurende 2 minuten.
      OPMERKING: TBST bestaat uit 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl en 0,05% Tween 20 (v/v).
  3. Blokkeren
    1. Blokkeer de endogene peroxidase-activiteit in het weefsel door de dia gedurende 10 minuten onder te dompelen in een pot met peroxidaseblokkerende oplossing (zie de materiaaltabel).
    2. Was de dia's met TBST gedurende 5 minuten.
    3. Gebruik een hydrofobe barrièrepen om een grens rond het weefselgedeelte op de dia te markeren.
    4. Bedek de weefselsecties met een blokkerende buffer (zie de tabel met materialen)of runderserumalbumine (5%, w/v) en incubeer de dia's gedurende 15 minuten in een bevochtigde kamer.
  4. Toepassing van antilichamen en signalen
    1. Verwijder de blokkerende reagentia.
    2. Incubeer met het primaire antilichaam van belang (bijv. CD3, 1:100 verdunning in antilichaamverdunningsmiddel, zie tabel 1) in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    3. Verwijder het primaire antilichaam. Was 3x met TBST gedurende 5 minuten elke keer.
    4. Incubeer met het polymeer mierikswortelperoxidase (HRP)-gelabeld secundair antilichaam(tabel 1)gedurende 15 minuten in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur. Was 3x met TBST gedurende 5 minuten elke keer.
    5. Breng de Opal fluorofoor TSA-werkoplossing (1:100 in amplificatieverdunningsmiddel) aan en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten om fluorofoorconjugatie naar het weefselmonster op primaire antilichaambindingsplaatsen mogelijk te maken. Was met TBST telkens in drievoud gedurende 5 minuten.
  5. Strippen op basis van magnetron
    1. Spoel af met de antigeenophaalbuffer (citraatbufferoplossing, pH 6,0).
    2. Voer microgolfgebaseerde stripping uit om het primair-secundaire HRP-complex te verwijderen om het volgende primaire antilichaam (bijv. CD20) te introduceren.
    3. Plaats de dia's in de antigeenophaalbuffer, zet ze gedurende 50 s op 100% vermogen, gevolgd door 20% stroom gedurende 20 minuten in magnetronveilige containers en koel ze gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
    4. Herhaal stap 3.2.4 tot en met 3.5.2 totdat de weefselmonsters zijn onderzocht met alle primaire antilichamen.
  6. Counterstain en montage
    1. Na het strippen en koelen van de antigeenophaalbuffer in de magnetron, spoelt u de glaasjes in gedestilleerd water en TBST.
    2. Incubeer met 4', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) oplossing (1,0 μg/ml) gedurende 5 minuten in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur.
    3. Was 3x met TBST gedurende 5 minuten elke keer. Eenmaal wassen met water gedurende 5 min.
    4. Droog de schuif aan de lucht en monteer met het juiste montagemedium (zie de tabel met materialen).
      OPMERKING: Counterstaining is niet vereist voor monoplex-dia's die worden gebruikt voor de ontwikkeling van spectrale bibliotheken.

4. Beeld en analyse

  1. Voorbereiding van Spectral bibliotheek dia's
    1. Maak bibliotheekdia's (referentieafbeeldingen met één kleuring) voor elke fluorofoor, DAPI en autofluorescentie met hetzelfde controleweefsel voor multispectrale beeldanalyse.
    2. Gebruik de dia's van de endometriumbiopsiemonsters van vrouwen met RM en vruchtbare vrouwen om stappen 1.1 tot 3.6.4 uit te voeren voor detectie van één antilichaam voor elke dia (zonder verdere toevoeging van antilichamen of fluoroforen).
    3. Voor elke antilichaamdetectie kleurt u een van de dia's met DAPI (zoals in stap 3.6.2) en laat u één dia onbevlekt voor de detectie van mogelijke weefselautofluorescentie in het spectrum.
    4. Gebruik de juiste filters in het werkstation om de afbeelding voor deze set dia's voor elk antilichaam te verkrijgen en upload deze naar de beeldanalysebibliotheek (zoals beschreven in stap 4.2).
    5. Zodra de afbeelding is vastgelegd, selecteert u inForm als spectrale bibliotheekbron en bouwt u de spectrale bibliotheek.
    6. Aangezien fluoroforen worden gebruikt, selecteert u Vlekken/fluors... in het menu.
    7. Terwijl u de vlekken of fluoroforen kiest, beperkt u de keuzes door een of meer groepen te selecteren. Selecteer Alles om alle spectra weer te geven die compatibel zijn met de afbeeldingen.
  2. Spectrale beeldvorming
    OPMERKING: Beelden zijn vastgelegd met behulp van het Mantra Workstation met de spectrale bibliotheek die is ingesteld met behulp van de inForm Image Analysis-software.
    1. Leg het beeld van de met één antilichaam bevlekte dia's vast met de juiste epifluorescentiefilters zoals voorgesteld in tabel 2 (bijv. DAPI, fluoresceïne-isothiocyanaat [FITC], CY3, Texas Red en CY5) met behulp van het werkstation.
      OPMERKING: Aanbevolen filters voor de specifieke fluoroforen die in dit protocol worden gebruikt, zijn weergegeven in tabel 2.
    2. Identificeer een geschikte belichtingstijd voor een optimaal signaal door elke marker in het bijbehorende fluorescentiekanaal te onderzoeken.
      OPMERKING: Het optimale signaal wordt bepaald volgens de referentie over de positiviteit en lokalisatie verkregen in de kleuring van het enkele antilichaam.
    3. Bepaal een vaste blootstellingstijd voor elke analyt (antilichaam-fluorofoorcombinatie) om een vergelijking tussen monsters te standaardiseren.
      OPMERKING: De bepaling van de vaste blootstelling is afhankelijk van de intensiteit in de steekproef van belangen.
    4. Scan de multiplex bevlekte dia's in de juiste scanmodus met het ingebouwde autofocusalgoritme.
      OPMERKING: De gevestigde spectrale bibliotheek zou worden gebruikt om de multispectrale beeldkubus te differentiëren in afzonderlijke afzonderlijke componenten (spectrale ontmenging). Hierdoor zou de op kleur gebaseerde identificatie voor alle markers van belang kunnen worden verwerkt met behulp van de volgende twee hoofdstappen: trainingssessie en beeldanalysesessie.
  3. Beeldanalyse
    1. Celtelling van geselecteerde immuunceltypen in het endometrium
    2. Leg minimaal 10 velden vast voor analyse onder 200x vergroting.
      OPMERKING: De velden zijn vastgelegd door de hele sectie te scannen zonder enige selectie. Dit kan zorgen voor de gelijktijdige opname van alle celcomponenten van het endometrium, bijvoorbeeld de luminale epitheelrand, stroma en klieren.
    3. Als u de cellen wilt tellen, klikt u op de knop Objecten tellen in de stappenbalk om het deelvenster Instellingen voor objecttelling weer te geven.
    4. Schakel het selectievakje Object verwijderen als u een rand aanraakt in voor de uitsluiting van objecten die de rand van de afbeelding, het procesgebied of het weefselgebied raken.
    5. Als het weefsel is gesegmenteerd, selecteert u de weefselcategorie waarin de objecten te vinden zijn. Tel geen objecten buiten de geselecteerde weefselcategorie.
    6. Selecteer de gewenste aanpak om objecten te identificeren: Objectgebaseerd of Pixelgebaseerd (drempelwaarde).
      OPMERKING: De pixelgebaseerde (drempel) benadering moet worden geselecteerd in het geval van een betrouwbare of consistente vlek waarvoor de toepassing van een eenvoudige drempel de objectpixels oplevert. De objectgebaseerde benadering wordt aanbevolen wanneer meer geavanceerde op morfometrie gebaseerde benaderingen vereist zijn in geval van gebrek aan consistentie en specificiteit van kleuring van objecten.
    7. Selecteer de gewenste signaalschaling: Automatisch schalen of Vaste schaal.
      OPMERKING: Als u Automatisch schalen kiest, wordt elk componentvlak automatisch geschaald voordat objectsegmentatie wordt uitgevoerd. De optie Vaste weegschaal wordt aanbevolen wanneer betere segmentatieprestaties vereist zijn en vleksignalen consistent en betrouwbaar zijn.
    8. Selecteer de component Primair voor objectsegmentatie in de vervolgkeuzelijst.
    9. Pas de minimumsignaalwaarde voor de primaire component aan op de gewenste drempelwaarde.
    10. Als u automatisch gaten in objecten wilt opvullen, selecteert u Gaten vullen.
    11. Als u objecten wilt detecteren die andere objecten als afzonderlijke objecten raken in plaats van als één object, schakelt u het selectievakje Splitsen verfijnen in nadat u het selectievakje Maximale grootte (pixels) hebt ingeschakeld.
    12. Als u objecten wilt uitsluiten op basis van de ronding van het object, schakelt u het selectievakje Ronding in en geeft u de gewenste minimale circulariteit op.
    13. Tel alle stromale cellen (CD3−/CD20−/CD68−/CD56−en DAPI+), inclusief de cellen rond de bloedvaten.
    14. Tel de immuuncellen afzonderlijk, inclusief T-cellen (CD3+ en DAPI+), B-cellen (CD20+ en DAPI+), macrofagen (CD68+ en DAPI+) en uNK-cellen (CD56+ en DAPI+).
    15. Druk de gegevens uit als de percentages van de immuuncellen ten opzichte van het totale aantal stromale cellen voor elk vastgelegd beeld en rapporteer het uiteindelijke celgetal als een gemiddelde van alle velden.
    16. Gebruik de weergave-editor om de resulterende gegevenstabellen na verwerking weer te geven. Exporteer de tabel Aantal gegevens.
    17. Kwantificering van de ruimtelijke verdeling van endometriumimmuuncellen
    18. Onder 200x vergroting, schat de L-functie met behulp van het R-programma voor een bereik van 0-20 μm beschouwd als een cel-cel contact maximale afstand14.
      OPMERKING: De R-taal toolbox 'spatstat' werd gebruikt om de L-functie te meten.
      1. Geef het niveau van clustering van verschillende paren immuuncellen aan op basis van het gebied onder de curve (AUC) van hun L-functie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het algemene schematische proces van het uitvoeren van een 4-kleuren multiplextest voor de detectie van 4 endometriumimmuunceltypen is weergegeven in figuur 1. Kortom, het protocol voor deze multiplex immunofluorescentiekleuring vereiste 8 belangrijke stappen: 1. Diavoorbereiding, 2. Epitoop ophalen, 3. Blokkeren, 4. Primaire antilichaamtoepassing, 5. Secundaire antilichaamtoepassing, 6. Signaalversterking, 7. Verwijdering van antilichamen en 8. Counterstain en mount. Beeldweergave en -analy...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritieke stappen binnen het protocol
Het is belangrijk op te merken dat multiplexkleuring ijverige optimalisatie vereist. Antigeenherstel, met behulp van citraatbuffer- en microgolftechnologie, vereist optimalisatie om volledige antilichaamstripping te garanderen en de levensvatbaarheid van weefsel te behouden. Omdat TSA-reagentia covalent binden aan plaatsen rond het antigeen, kunnen ze mogelijk de binding van een volgend primair antilichaam remmen door sterische belemmering (ook bekend als het "para...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben om bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door het Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund in 2018 en het Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amplification DiluentPerkin ElmerFP1498Fluorofore-verdunningsbuffer
Antibody diluentPerkin ElmerARD1001EAAntilichaam verdunnen
CD3Spring BioscienceM3072Primair antilichaam
CD20Biocare MedicalCM004BPrimair antilichaam
CD56LeicaNCL-CD56-504Primair antilichaam
CD68Spring BioscienceM5510Primair antilichaam
Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)AbcamAB64214Antigeenretrievaloplossing
EMSURE Xylene (isomeric mixture)Merck108297Ontvetten
Ethanol absoluteMerck107017Ethylalcohol voor rehydratie
HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica MicrotomeLeicaRM2125RTSSnijden van paraffine-ingebed weefsel
inForm Advanced Image Analysis SoftwarePerkin ElmerinForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)Data-analysesoftware
Mantra® WorkstationAkoya BiosciencesCLS140089Spectraal beeldvorming
MicrowavePanasonicInverterMicrogolfstrippen
Opal 520Perkin ElmerFP1487AGeëigende tyramide-gebaseerde fluorescente reagens
Opal 620Perkin ElmerFP1495AGeëigende tyramide-gebaseerde fluorescente reagens
Opal 650Perkin ElmerFP1496AGeëigende tyramide-gebaseerde fluorescente reagens
Opal 690Perkin ElmerFP1497AGeëigende tyramide-gebaseerde fluorescente reagens
OvenMemmertU10Ontvetten
Peroxidase Blocking SolutionDAKOS2023Verwijdering van weefselperoxidase-activiteiten
Poly-L-lysine coated slideFISHER SCIENTIFIC120-550-15Glijmiddel voor routinematige histologische gebruik
PolyHRP Broad SpectrumPerkin ElmerARH1001EASecundair antilichaam
ProLong™ Gold Antifade MountantThemoFisher ScientificP36930Montage
Spatstat/Version 2.1-0Ruimtelijke puntenpatroonanalyse
Spectral DAPIPerkin ElmerFP1490ANucleïnezuurkleuring
Tissue ProcessorThermo FischerExcelsior ESWeefselverwerking voor dehydratie en paraffinering
Tris Buffer Saline (TBS), 10xCell Signaling Technology12498SWasoplossing
Tween 20Sigma-AldrichP1370-1LNioniek oppervlakte-actief middel
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004(2018).
  2. Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
  3. Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
  4. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
  5. King, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).
  6. Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
  7. Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
  8. Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
  9. Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
  10. Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
  11. Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
  12. Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, Suppl 2 26-36 (1999).
  13. Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711(2019).
  14. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095(2017).
  15. Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Multiplex immunohistochemiefluorescenti le kleuringimmuuncellen van het endometriumclustering van immuuncellenweefsegmentatieepitope herstelantilichaamlabelingceltellingembryo implantatie

Gerelateerde artikelen