Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Optogenetische faseovergang van TDP-43 in spinale motorneuronen van zebravislarven

5.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62932

⸱

25 februari 2022

 ,  , 
1Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, 2Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, 3Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol om faseovergang van TAR DNA-bindend eiwit 43 (TDP-43) te induceren door licht in de spinale motorneuronen met zebravissen als model.

Samenvatting

Abnormale eiwitaggregatie en selectieve neuronale kwetsbaarheid zijn twee belangrijke kenmerken van neurodegeneratieve ziekten. Causale relaties tussen deze kenmerken kunnen worden onderzocht door de faseovergang van een ziekte-geassocieerd eiwit in een kwetsbaar celtype te beheersen, hoewel deze experimentele benadering tot nu toe beperkt is geweest. Hier beschrijven we een protocol om faseovergang van het RNA /DNA-bindende eiwit TDP-43 in spinale motorneuronen van zebravislarven te induceren voor het modelleren van cytoplasmatische aggregatie van TDP-43 die optreedt in degenererende motorneuronen bij amyotrofische laterale sclerose (ALS). We beschrijven een bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) -gebaseerde genetische methode om selectief een optogenetische TDP-43-variant af te leveren aan spinale motorneuronen van zebravissen. De hoge doorschijnendheid van zebravislarven zorgt voor de faseovergang van de optogenetische TDP-43 in de spinale motorneuronen door een eenvoudige externe verlichting met behulp van een lichtgevende diode (LED) tegen ongeremde vissen. We presenteren ook een basisworkflow van live beeldvorming van de spinale motorneuronen van de zebravis en beeldanalyse met vrij beschikbare Fiji / ImageJ-software om reacties van de optogenetische TDP-43 op de lichtverlichting te karakteriseren. Dit protocol maakt de karakterisering van TDP-43 faseovergang en geaggregeerde vorming in een ALS-kwetsbare cellulaire omgeving mogelijk, wat een onderzoek naar de cellulaire en gedragsmatige gevolgen ervan zou moeten vergemakkelijken.

Inleiding

Ribonucleoproteïne (RNP) korrels regelen een groot aantal cellulaire activiteiten in de kern en het cytoplasma door membraanloze partities te assembleren via vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS), een fenomeen waarbij een homogene vloeistof zich ontmengt in twee verschillende vloeibare fasen1,2. De ontregelde LLPS van RNA-bindende eiwitten die normaal functioneren als RNP-korrelcomponenten bevorderen abnormale faseovergang, wat leidt tot eiwitaggregatie. Dit proces is betrokken bij neurologische en neurodegeneratieve ziekten3,4,5. De precieze evaluatie van een oorzakelijk verband tussen afwijkende LLPS van RNA-bindende eiwitten en ziektepathogenese is cruciaal om te bepalen of en hoe LLPS kan worden benut als een effectief therapeutisch doelwit. LLPS van RNA-bindende eiwitten is relatief eenvoudig te bestuderen in vitro en in eencellige modellen, maar is moeilijk in meercellige organismen, vooral bij gewervelde dieren. Een kritieke vereiste voor het analyseren van dergelijke LLPS in individuele cellen in een weefselomgeving is om stabiel een sonde uit te drukken voor de beeldvorming en manipulatie van LLPS in een ziektegevoelig celtype van belang.

Amyotrofische laterale sclerose (ALS) is een uiteindelijk fatale neurologische aandoening waarbij motorneuronen van de hersenen en het ruggenmerg selectief en progressief verloren gaan als gevolg van degeneratie. Tot op heden zijn mutaties in meer dan 25 genen geassocieerd met de erfelijke (of familiale) vorm van ALS, die goed is voor 5%-10% van de totale ALS-gevallen, en sommige van deze ALS-veroorzakende genen coderen voor RNA-bindende eiwitten bestaande uit RRP's, zoals hnRNPA1, TDP-43 en FUS6,7. Bovendien wordt de sporadische vorm van ALS, die goed is voor 90%-95% van de totale ALS-gevallen, gekenmerkt door de cytoplasmatische aggregatie van TDP-43 afgezet in degenererende motorneuronen. Een belangrijk kenmerk van deze ALS-geassocieerde RNA-bindende eiwitten zijn hun intrinsiek ongeordende regio's (IDR's) of laagcomplexe domeinen die geordende driedimensionale structuren missen en zwakke eiwit-eiwitinteracties bemiddelen met veel verschillende eiwitten die LLPS7,8 aandrijven. Het feit dat ALS-veroorzakende mutaties vaak voorkomen in de IDR's heeft geleid tot het idee dat afwijkende LLPS en faseovergang van deze ALS-gerelateerde eiwitten ten grondslag kunnen liggen aan als pathogenese9,10.

Onlangs werd de optoDroplet-methode ontwikkeld, een op Cryptochrome 2 gebaseerde optogenetische techniek die de modulatie van eiwit-eiwitinteracties door licht mogelijk maakt, om faseovergang van eiwitten met IDR's te induceren11. Aangezien deze techniek met succes is uitgebreid tot TDP-43, is het begonnen met het blootleggen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathologische faseovergang van TDP-43 en de bijbehorende cytotoxiciteit12,13,14,15. In dit protocol schetsen we een genetische methode om een optogenetische TDP-43 af te leveren aan ALS-kwetsbare celtypen, namelijk spinale motorneuronen in zebravissen met behulp van de BAC voor het mnr2b/mnx2b-gen dat codeert voor een homeodomain-eiwit voor motorneuronspecificatie16,17. De hoge doorschijnendheid van zebravislarven zorgt voor eenvoudige, niet-invasieve lichtstimulatie van de optogenetische TDP-43 die de faseovergang in de spinale motorneuronen veroorzaakt. We presenteren ook een basisworkflow voor de live beeldvorming van de spinale motorneuronen van de zebravis en beeldanalyse met behulp van de vrij beschikbare Fiji / ImageJ-software om de reacties van de optogenetische TDP-43 op de lichtstimulatie te karakteriseren. Deze methoden maken een onderzoek mogelijk naar de TDP-43-faseovergang in een ALS-kwetsbare cellulaire omgeving en moeten helpen om de pathologische gevolgen ervan op cellulair en gedragsmatig niveau te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Al het viswerk werd uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van het Institutional Animal Care and Use Committee (goedkeuringsidentificatienummer 24-2) van het National Institute of Genetics (Japan), dat een Animal Welfare Assurance in het bestand heeft (zekerheidsnummer A5561-01) bij het Office of Laboratory Animal Welfare van de National Institutes of Health (NIH, VERENIGDE STATEN).

1. Constructie van BACs voor expressie van het optogenetische TDP-43 gen van de mnr2b promotor

  1. BAC-bereiding
    1. Koop een ZEBRAVIS BAC kloon met daarin de zebravis mnr2b locus (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Zuiver het BAC-DNA uit een 5 ml nachtelijke LB-cultuur van DH10B Escherichia coli (E. coli) met CH211-172N16 zoals beschreven in Warming et al.18.
    2. Transformeer CH211-172N16 in SW102 E. coli-cellen door elektroporatie, zoals beschreven in Warming et al.18.
      OPMERKING: Zuivering van het BAC-DNA van de E. coli op dezelfde dag van elektroporatie geeft meestal een hoger slagingspercentage van BAC-transformatie18. Anders wordt het gezuiverde BAC-DNA tot gebruik op -20 °C gehouden.
    3. Introduceer de iTol2-amp cassette voor Tol2 transposon-gemedieerde BAC transgenese19 in de ruggengraat van CH211-172N16 door elektroporatie, zoals beschreven in Asakawa et al.20.
      1. Maak een glycerolvoorraad van de E. coli-celklonen met CH211-172N16 met de iTol2-amp cassette-integratie (CH211-172N16-iTol2A) na bevestiging van de homologe recombinatie-gemedieerde integratie door polymerasekettingreactie (PCR) (Ex Taq) met behulp van het primerpaar Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') en pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') en de volgende voorwaarden: een denaturatiestap bij 98 °C gedurende 1 minuut, gevolgd door 25 cycli denaturatie bij 95 °C gedurende 10 s, primergloeien bij 55 °C gedurende 15 s en primerverlenging bij 72 °C gedurende 1 minuut, waarbij een PCR-product van 354 basenparen (bp) wordt versterkt.
  2. mnr2b-hs: opTDP-43h constructie
    1. Construeer een plasmide met de expressiecassette voor de menselijke wild-type TDP-43/TARDBP (TDP-43h) die is getagd met mRFP1 en CRY2olig op respectievelijk de N- en C-termini (hierna opTDP-43h)14.
      OPMERKING: Het opTDP-43h-fragment moet worden geflankeerd door de zebravis hsp70l genpromotorsequentie (650 bp) en polyadenylation (polyA) signaalsequentie, gevolgd door een kanamycineresistentiegen (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.
    2. Versterk de hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan cassette met primers die hsp70l en Kan gloeien en 45 bp sequenties bevatten van de upstream en downstream van de initiator codons van het mnr2b gen door PCR (GXL DNA Polymerase) met behulp van het primerpaar mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CTT CCA GAA C-3') en Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') met de volgende voorwaarden: een denaturatiestap bij 98 °C gedurende 1 minuut, gevolgd door 30 cycli denaturatie bij 95 °C gedurende 10 s, primergloeien bij 55 °C gedurende 15 s en primerverlenging bij 68 °C gedurende 30 s, versterking van een PCR-product van ~5,7 bp.
    3. Scheid de PCR-producten door agarosegel-elektroforese (100 V) en zuiver de Hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNA-band met een DNA-kolom. Stel de concentratie van de gezuiverde hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan cassette in op 50 ng/μL in Tris-EDTA buffer (TE) met 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) en 1 mM EDTA.
    4. Introduceer de hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan cassette in CH211-172N16-iTol2A door elektroporatie zoals beschreven in Warming et al.18 en selecteer ampicilline- en kanamycine-resistente transformanten op LB-agarplaten. CH211-172N16-iTol2A met de hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan cassette wordt aangeduid als mnr2b-hs:opTDP-43h.
    5. Zuiver mnr2b-hs:opTDP-43h met behulp van een BAC-zuiveringskit en los het op bij 250 ng / μL in TE na fenol / chloroformextractie.
  3. mnr2b-hs: EGFP-TDP-43z constructie
    1. Bouw een ander plasmide met de zebravis wild-type tardbp die is gemarkeerd met verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP) op zijn N-eindpunt (EGFP-TDP-43z) in plaats van opTDP-43h, maar verder identiek is aan de hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan construct (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. Gebruik EGFP-TDP-43z als interne controle voor de lichtstimulatie van opTDP-43h.
    2. Bouw CH211-172N16-iTol2A met de hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan cassette in de mnr2b locus zoals beschreven in 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A met de hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan cassette wordt aangeduid als mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.

2. Tol2 getransponeerde BAC-transgenese bij zebravissen

  1. Bereid de injectieoplossing met 40 mM KCl, fenolrood (10% v/v), 25 ng/μL mnr2b-hs:opTDP-43h DNA en 25 ng/μL Tol2 transposase mRNA19.
  2. Injecteer 1 nL van de injectieoplossing (een druppel met een diameter van ongeveer 123 μm gekalibreerd in minerale olie) in het cytosol van wildtype zebravisembryo's in het eencellige stadium. Screen de geïnjecteerde vis op de vorming van rood fluorescerend eiwit (RFP)-positieve aggregaten in verschillende embryonale weefsels, waaronder spinale motorneuronen, onder een fluorescentie-stereomicroscoop 2-3 dagen na de bevruchting (dpf). Verhoog de RFP-positieve vis naar volwassenheid.
  3. Injecteer het mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA zoals beschreven in 2.1 en 2.2. Verhoog EGFP-positieve vissen naar volwassenheid.
  4. Zet na een paar maanden seksueel gerijpte geïnjecteerde vissen en wild-type vissen in paren in standaard 2 L paringskooien om F1-nakomelingen te verkrijgen. Screen F1 vissen met 3 dpf voor RFP (opTDP-43h) of EGFP (EGFP-TDP-43z) fluorescentie in de wervelkolom met behulp van een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een Plan-Neofluar 5x / 0.15 objectieflens. Typisch wordt één stichtervis geïdentificeerd uit 10−20 geïnjecteerde vissen (de overdrachtssnelheid van de kiembaan is 5%−10%).
  5. Isoleer en vergelijk meerdere Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] en Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] inserts van verschillende founder fish, omdat de intensiteit, maar niet het patroon, van opTDP-43h of EGFP-TDP-43z expressie kan variëren tussen founder fish als gevolg van chromosomale positie-effecten.
  6. Kruis Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] en Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] vislijnen om nakomelingen te verkrijgen die Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgene vis bevatten in een Mendeliaanse verhouding.
  7. Breng de vis in een plastic schaal met 30 ml E3-buffer (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10-5% methyleenblauw) en voeg 0,003% (w/ v) N-fenylthiourea toe bij 8-10 uur na de bevruchting (hpf) om melanogenese te remmen.
  8. Dek de plastic schaal af met aluminiumfolie na 30 pkf.

3. Voorbereiding van LED voor verlichting met blauw licht

  1. Schakel een LED-paneel in met behulp van de bijbehorende toepassing die op een tablet/telefoon is geïnstalleerd. Plaats de sonde van een spectrometer in een lege put van een 6-put schotel en pas het LED-licht aan op de golflengte die piekt op ~ 456 nm door de toepassing. Plaats de optische sensor van een optische vermogensmeter in de lege put en pas het vermogen van het LED-licht aan (~ 0,61 mW / cm2). De LED-lichtinstelling kan worden opgeslagen en is opvraagbaar in de toepassing.
  2. Introduceer de instelling van de schotel/LED-paneel in de couveuse bij 28 °C. Voltooi deze stap voordat het afbeelden van vissen begint bij 48 pkf.

4. Beeldvorming van zebravislarven die optogenetische TDP-43 tot expressie brengen

  1. Selecteer Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgene vis ten minste vóór 47 hpf, op basis van RFP (opTDP-43h) of EGFP (EGFP-TDP-43z) fluorescentie in de wervelkolom met behulp van de hierboven beschreven epifluorescentiemicroscoopopstelling.
  2. Dechorioneer de Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgene vissen.
  3. Verwarm 1% agarose bij lage smelttemperatuur met 250 μg/ml ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaatzout bij 42 °C.
  4. Verdooi kort Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] dubbeltransgene vis bij 48 hpf in E3-buffer met dezelfde concentratie Tricane.
  5. Leg een druppel van de voorverwarmde 1% lage smelttemperatuur agarose op de glazen basisschaal op kamertemperatuur. De diameter van de koepelvormige agarose-druppel op de glazen schaal is 8-10 mm.
  6. Voeg met behulp van een Pasteur-pipet de verdoofde vis toe aan de lage smelttemperatuur op de glazen basisschaal en meng vervolgens door een paar keer te pipetteren. Minimaliseer de hoeveelheid van de E3-buffer die samen met de vis aan de agarose wordt toegevoegd.
  7. Houd de vis op zijn kant door een spuitnaald te gebruiken tijdens de stolling van agarose (meestal ~ 1 min) om ervoor te zorgen dat het ruggenmerg zich in een geschikte horizontale positie bevindt. Leg na de stolling een paar druppels E3-buffer op de koepelvormige agarose-gemonteerde vis.
  8. Verkrijg seriële confocale z-secties van het ruggenmerg door te scannen met een confocale microscoop uitgerust met een 20x wateronderdompelingsobjectieflens met het numerieke diafragma 1,00, met behulp van een scansnelheid van 4,0 μs per pixel (12 bits per pixel), een stapgrootte van 1,0 μm per plak voor het objectief en een combinatie van excitatie / emissiegolflengten: Kanaal 1) 473/510 nm voor EGFP en kanaal 2) 559/583 nm voor mRFP1.
    OPMERKING: De cloaca aan de ventrale kant van de vis is opgenomen in de interessegebieden (ROI) als referentie, wat helpt bij het identificeren en vergelijken van de spinale segmenten (niveaus 16-17) over de tijdspunten.
  9. Verwijder de vis uit de agarose door de agarose voorzichtig te kraken met een spuitnaald zodra de beeldvorming is voltooid. Houd de hoeveelheid tijd dat de vis in de agarose is ingebed zo kort mogelijk, hoewel de agarose-inbedding gedurende <30 minuten de levensvatbaarheid van de vis niet beïnvloedt.

5. Lichtstimulatie van opTDP-43h-uitdrukkende vissen door veldverlichting van een blauw lichtgevende diode (LED) licht

  1. Voeg 7,5 ml E3-buffer toe aan de put en plaats de afgebeelde Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgene vis in de put. Plaats de schotel met zes putten op het LED-paneel door de schotel en het LED-paneel 5 mm uit elkaar te houden met een afstandhouder (bijvoorbeeld met vijf schuifglazen gestapeld).
  2. Schakel het blauwe LED-lampje in. Bewaar een deel van de Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dubbeltransgene vis in een aparte zes-well schotel bedekt met aluminiumfolie wanneer niet-gedelumineerde controlevis nodig is (d.w.z. in donkere omstandigheden)14.
  3. Na de verlichting (bijvoorbeeld gedurende 24 uur bij 72 pkf in figuur 3) stelt u het ruggenmerg van de verlichte vis in beeld door de stappen 4.3 - 4.9 te herhalen.

6. Visualisatie van cytoplasmatische verplaatsing van optogenetische TDP-43 in de spinale motorneuronen

  1. Open het afbeeldingsbestand in ImageJ/Fiji21 (Versie: 2.1.0/1.53c), een open-source Java-beeldverwerkingsprogramma ontwikkeld door NIH Image, dat kan worden gedownload van https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Gebruik de Z-schuifbalk om door de brandpuntsvlakken te bewegen. Maak een maximale intensiteitsprojectie van meerdere segmenten door op Afbeelding | Stapels | Z project | Maximale intensiteit en het instellen van startsegment en stopsegment die de hemisegmenten van de wervelkolom bedekken.
  3. Splits de meerkanaalsafbeelding in twee afbeeldingen met één kanaal door op Afbeelding | Kleur | Gesplitste kanalen.
  4. Verbeter het EGFP-TDP-43z-signaal om ervoor te zorgen dat cytoplasmatische EGFP-TDP-43z duidelijk zichtbaar is door op Afbeelding | | aanpassen Helderheid/contrast en aanpassing minimum
  5. Open de ROI-manager door te klikken op | Gereedschap | ROI-manager. Zoek de cellen die in beide afbeeldingen identificeerbaar zijn bij 48 hpf en 72 hpf, op basis van de relatieve posities van de cellichamen. Stel de ROI's in door de contouren van cellichamen van enkele spinale motorneuronen te schetsen die worden gevisualiseerd door het EGFP-TDP-43z-signaal met behulp van Freehand-selecties en vervolgens op Toevoegen [t] te klikken in de ROI-manager.
  6. Stel een hoofdas van de soma in door een rechte lijn te tekenen met Recht en op | analyseren te klikken Plot profiel voor EGFP-TDP-43z (C1) en opTDP-43h (C2) beelden bij 48 en 72 hpf.
  7. Normaliseer het plotprofiel door de waarden te delen door de grootste waarde voor elk EGFP-TDP-43z- en opTDP-43h-signaal. Plot de genormaliseerde waarden met x-y-coördinaten, waarbij x en y respectievelijk de hoofdas van de soma en relatieve fluorescerende intensiteiten vertegenwoordigen, met behulp van XY-grafiek in een statistische software.

7. Ratiometrische vergelijking tussen opTDP-43h en EGFP-TDP-43z signalen met behulp van ImageJ / Fiji

  1. Open het afbeeldingsbestand in ImageJ/Fiji en stel ROI's in voor enkele mnr2b-positieve cellen met behulp van een projectiebeeld met maximale intensiteit van EGFP-TDP-43z zoals in 6.1-6.5. Voeg een ROI toe buiten het ventrale ruggenmerg (bijvoorbeeld notochord) om het achtergrondsignaal weer te geven (achtergrond ROI).
  2. Maak voor elke EGFP-TDP-43z- en opTDP-43-afbeelding een projectie van meerdere segmenten door op Afbeelding | Stapels | Z project | Som plakjes op en stel Beginsegment en Stopsegment in die de hemispinale motorkolom bedekken.
  3. Open de ROI-manager die is gemaakt met het projectiebeeld met maximale intensiteit. Geef de ROI's weer op de afbeelding Sum Slices door het afbeeldingsvenster voor EGFP-TDP-43z te selecteren en vervolgens op Alles weergeven te klikken in de ROI-manager. Klik op Meten in de ROI-manager om gemiddelde waarden voor elke ROI te verkrijgen.
  4. Verkrijg gemiddelde waarden voor opTDP-43h volgens dezelfde procedure als in 7.3.
  5. Deel voor elke ROI, na aftrek van het gemiddelde voor de achtergrond-ROI, het afgetrokken gemiddelde voor opTDP-43h door het afgetrokken gemiddelde voor EGFP-TDP-43z om de ratiometrische waarde te verkrijgen. De ratiometrische waarden kunnen worden vergeleken tussen verschillende tijdspunten en worden gepresenteerd met behulp van kolomgrafiek in Prism-software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Live beeldvorming van optogenetische en niet-optogenetische TDP-43 eiwitten in de mnr2b+ spinale motorneuronen van zebravislarven
Om TDP-43 faseovergang in de spinale motorneuronen bij zebravissen te induceren, werd een menselijke TDP-43h die is getagd met mRFP1 en CRY2olig22 op respectievelijk de N- en C-termini geconstrueerd en aangeduid als opTDP-43h14 (figuur 1A). Het opTDP-43h ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De mnr2b-BAC-gemedieerde expressie van opTDP-43h en EGFP-TDP-43z in zebravissen biedt een unieke kans voor live beeldvorming van TDP-43 faseovergang in de spinale motorneuronen. De optische transparantie van lichaamsweefsels van zebravislarven zorgt voor de eenvoudige en niet-invasieve optogenetische stimulatie van opTDP-43h. Vergelijkingen tussen enkele spinale motorneuronen in de loop van de tijd toonden aan dat de lichtafhankelijke oligomerisatie van opTDP-43h de cytoplasmatische clustering veroorzaakt, wat d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

KA en KK zijn de uitvinders van het intellectuele eigendom dat in dit manuscript wordt beschreven en voorlopige patenten zijn ingediend door het National Institute of Genetics.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant nummers JP19K06933 (KA) en JP20H05345 (KA).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Confocal microscopeOlympusFV1200
Epifluorescence microscopeZEISSAxioimager Z1
Fluorescence stereomicroscopeLeicaMZ16FA
Glass base dishIWAKI3910-035
IncubatorMEECN-25C
LED panelNanoleaf LimitedNanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plusTAKARAAD110
NucleoBond BAC100MACHEREY-NAGEL740579
NuSieve GTG AgaroseLONZA50181
Objective lensOlympusXLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lensZEISSPlan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meterHIOKI3664
Optical sensorHIOKI9742-10
Phenol red solution 0.5%MerckP0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA PolymeraseTAKARAR050A
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
Six-well dishFALCON353046
Spectrometer probe BLUE-WaveStellerNet Inc.VIS-50
Syringe needleTERUMONN-2725R
TaKaRa Ex TaqTAKARARR001A
TricaneSigma-AldrichA5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16BACPAC GenomicsCH211-172N16

Referenties

  1. Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
  2. Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
  3. Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
  4. Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
  5. Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
  6. Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
  7. Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
  8. Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
  9. Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
  10. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
  11. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  12. Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578(2019).
  13. Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
  14. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004(2020).
  15. Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078(2020).
  16. Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).
  17. Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35(2012).
  18. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36(2005).
  19. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  20. Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100(2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925(2014).
  23. Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
  24. Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Faseovergang van TDP 43Optogenetisch TDP 43Prote neaggregatieBAC transgeneseConfocale microscopieBlauwe lichtstimulatieCytoplasmatische aggregatieAmyotrofische laterale sclerose
Optogenetische faseovergang van TDP-43 in spinale motorneuronen van zebravislarven
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.