Methodenartikel

Kinetx: een gecombineerd softwareframework voor flowcytometrietest en -analyse om de activering van bloedplaatjes in realtime kwantitatief te meten en te categoriseren.

DOI:

10.3791/62947

⸱

7 oktober 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1ICMR, School of Biological Sciences, University of Reading, 2Institute of Cardiovascular Sciences, University of Birmingham

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bloedplaatjes reageren snel op een reeks stimuli. Dit artikel beschrijft een real-time flowcytometrie-gebaseerde bloedplaatjesfunctietest en een nieuw ontwikkelde, op maat gemaakte open-source software (Kinetx) om kwantitatieve kinetische metingen van de afgifte van bloedplaatjeskorrels, fibrinogeenbinding en intracellulaire calciumflux mogelijk te maken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bloedplaatjes reageren snel op vaatletsel en worden geactiveerd als reactie op een reeks stimuli om bloedverlies te beperken. Veel bloedplaatjesfunctietests meten de respons op het eindpunt na een bepaalde periode en niet de snelheid waarmee het bloedplaatje wordt geactiveerd. De snelheid waarmee bloedplaatjes extracellulaire stimuli omzetten in een functionele respons is echter een essentiële factor om te bepalen hoe efficiënt ze kunnen reageren op letsel, zich kunnen binden aan een zich vormende trombus en een signaal kunnen geven om andere bloedplaatjes te rekruteren. Dit artikel beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde test met bloedplaatjesfuncties die gelijktijdige gegevensverzameling en monsterstimulatie mogelijk maakt en gebruik maakt van nieuw ontwikkelde, op maat gemaakte open-source software (Kinetx) om kwantitatieve kinetische metingen van de afgifte van bloedplaatjeskorrels, fibrinogeenbinding en intracellulaire calciumflux mogelijk te maken. Kinetix is ontwikkeld in dit gebied, zodat gebruikers parameters kunnen wijzigen, zoals de mate van afvlakking, identificatie van afgelegen gegevenspunten of tijdschalen. Om gebruikers te helpen die niet bekend zijn met de R-omgeving, kan Kinetix-analyse van gegevens worden uitgevoerd met een enkel commando. Samen zorgt dit ervoor dat real-time bloedplaatjesactiveringsstatistieken, zoals snelheid, versnelling, tijd tot pieksnelheid, tijd tot piekcalcium en kwalitatieve vormveranderingen, nauwkeurig en reproduceerbaar kunnen worden gemeten en gecategoriseerd. Kinetische metingen van de activering van bloedplaatjes geven een uniek inzicht in het gedrag van bloedplaatjes tijdens de eerste stadia van activering en kunnen een methode bieden om de rekrutering van bloedplaatjes in een zich vormende trombus te voorspellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bloedplaatjes spelen een centrale rol bij hemostase en genereren een snelle en veelzijdige reactie op vasculair letsel 1,2. De huidige bloedplaatjesfunctietesten meten verschillende aspecten van de reactiviteit van bloedplaatjes, die representatief zijn voor hun hemostatische werking in vivo. Traditioneel wordt de bloedplaatjesfunctie beoordeeld met behulp van eindpunttesten die de fibrinogeenbinding, granulaatafgifte of bloedplaatjesaggregatie meten in bloedplaatjes die lang genoeg worden gestimuleerd om maximale activering te bereiken 3,4. Deze tests houden geen rekening met de tijd die bloedplaatjes nodig hebben om extracellulaire stimuli om te zetten in intracellulaire signalen en calciumflux en vervolgens te degranuleren en te binden aan de groeiende trombus. Bloed stroomt met een afschuifsnelheid van maximaal 20 dynes/cm3 in aders en 80 dynes/cm3 in grote slagaders5, wat de noodzaak benadrukt voor bloedplaatjes om deze snelle stroomsnelheid tegen te gaan door extracellulaire stimuli snel te detecteren, te verwerken en erop te reageren om zich te binden aan een zich vormende trombus en de voortdurende groei ervan te ondersteunen.

De snelheid van activering van bloedplaatjes kan variëren, onafhankelijk van de maximale mate van activering van bloedplaatjes. Integrine-linked kinase (ILK) is een eiwit dat betrokken is bij het reguleren van β1- en β3-integrinen in bloedplaatjes 6,7. Remming of specifieke deletie van ILK in vivo toonde aan dat de snelheid, maar niet de maximale mate van activering van bloedplaatjes, werd beïnvloed bij afwezigheid van functionele ILK8. Verschillen tussen de aggregatiesnelheid en het maximale aggregatieniveau werden ook geïdentificeerd bij muizen met een tekort aan CALDAG GEFI 9,10, een signaalmolecuul dat betrokken is bij de regulatie van inside-out signalering via RAP111.

Deze bevindingen tonen aan dat het aantal bloedplaatjes en maximale activeringsniveaus autonoom kunnen zijn en dat metingen van maximale activering tot nu toe mogelijk niet beschrijvend zijn voor het gedrag van bloedplaatjes. Deze verschillen in de tijd die nodig is om bloedplaatjes te activeren, kunnen een diepgaande invloed hebben op hun initiële binding aan de groeiende trombus, wat een invloed heeft op de architectuur en de totale grootte van de trombus. Deze variaties tussen bloedplaatjessnelheid en maximale activering benadrukken de noodzaak van een test om de snelheid van bloedplaatjesactivering nauwkeurig te meten en kunnen worden gebruikt om variaties binnen de populatie te detecteren.

Dit artikel beschrijft een methode die de activering van bloedplaatjes en de calciumflux nauwkeurig in realtime meet en een reeks metrieken berekent, waaronder de snelheid waarmee bloedplaatjes worden geactiveerd en de tijd die bloedplaatjes nodig hebben om de maximale activeringssnelheid en maximale calciumflux te bereiken. Deze kinetische metingen van de activering van bloedplaatjes geven een beter inzicht in het gedrag van bloedplaatjes tijdens de eerste stadia van trombusvorming en bieden een methode om te voorspellen hoe snel bloedplaatjes kunnen worden gerekruteerd in een zich vormende trombus.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakte gebruik van menselijk volbloed en bloedplaatjes van gezonde donoren zonder onderliggende gezondheidsproblemen en zonder medicatie waarvan bekend is dat ze de bloedplaatjesfunctie verstoren na schriftelijke geïnformeerde toestemming en werd goedgekeurd door de University of Reading Research Ethics Committee.

1. Afname van bloed en bereiding van bloedplaatjesrijk plasma

  1. Verzamel het perifere bloed in een vacutainer die 3,2% natriumcitraat bevat
  2. Gooi de eerste 3 ml weg.
  3. Laat het bloed 30 minuten rusten bij 30 °C voordat u gaat centrifugeren.
  4. Bereid het bloedplaatjesrijke plasma (PRP) door centrifugeren bij 140 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur vóór incubatie bij 37 °C voor de analyseduur, die binnen 60 minuten na het centrifugeren is voltooid.

2. Voorbereiding van instrumenten

OPMERKING: Een vloeistofsysteem zonder druk is essentieel voor real-time flowcytometrie, aangezien bloedplaatjes gelijktijdig worden gestimuleerd terwijl de flowcytometer gebeurtenissen registreert.

  1. Gebruik een flowcytometer zonder druk om real-time flowcytometrie uit te voeren.
  2. Om de test bij 37 °C uit te voeren, bevestigt u een muisdissectiemat aan de tafel om de plaat met 96 putjes te plaatsen. Verwarm de mat tot 37 °C voor de duur van de test.
  3. Plaats een plaat met 96 putjes op de verwarmde mat om een continue incubatie bij 37 °C mogelijk te maken (figuur 1)

3. Voorbereiding van de test

  1. Fibrinogeenbinding en P-selectine-expressie
    1. Smeer een polypropyleen 96-wells, ronde bodem, onbehandelde microtiterplaat in met 5% runderserumalbumine (BSA) in Hepes gebufferde zoutoplossing (HBS; 10 mM Hepes pH 7,4; 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4·7H20) 's nachts bij 4 °C .
    2. Bereid de antilichaammix in HBS met 5 mM glucose (HBS-G). Voeg fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-gelabeld anti-fibrinogeen-antilichaam (FITC-FGN; verdunning 1: 37.5 (v/v)) en allophycocyanine (APC)-gelabeld anti-P-selectine (APC-CD62P; verdunning 1: 37,5 (v/v)) toe aan HBS-G (eindvolume: 225 μl) en incubeer in een plaat met 96 putjes bij 37 °C .
    3. Voeg onmiddellijk voor het verzamelen van events PRP toe aan de HBS-G-antilichaammix in een verdunning van 1:600 (v/v).
      OPMERKING: Een laag volume PRP is vereist om ervoor te zorgen dat de voorvallimiet niet wordt overschreden en om de bloedplaatjesaggregatie in het monster te verminderen. De verdunning van bloedplaatjes is onderzocht in pilotstudies en heeft geen invloed op de activeringssnelheid.
    4. Incubeer het activeringsmengsel dat FITC-FGN (verdunning 1: 37,5 (v/v)) en APC-CD62P (verdunning 1: 37,5 (v/v)) en agonist bevat bij 37 °C. De agonisten omvatten trombine (thr; 0,0012-1 E/ml) in aanwezigheid van Gly-Pro-Arg-Pro-peptide (GPRP; 1,18 mM), verknoopt collageengerelateerd peptide (CRP-XL; 0,004-10 μg/ml), adenosinedifosfaat (ADP; 0,04-4 μM), epinefrine (epi; 20-200 μM), 9,11-dideoxy-11α,9α-epoxymethanoprostaglandine F2α (U46619; 0,02-5 μM) en trombinereceptoractivatorpeptide 6 (TRAP-6; 0,04-10 μM).
  2. Calciumflux
    OPMERKING: Deze test werd uitgevoerd met behulp van een in de handel verkrijgbare calciumtestkit (materiaaltabel)
    1. Smeer een polypropyleen niet-behandelde microtiterplaat met 96 putjes en ronde bodem 's nachts in met 5% BSA in Hepes gebufferde zoutoplossing bij 4 °C.
    2. Om de calciumtestkleurstof te bereiden, voegt u 100 ml calciumtestbuffer en 2 ml probenecide stockoplossing (250 mM) toe aan een fles calciumreagens om 2x calciumreagensoplossing te verkrijgen.
    3. Om Fluo-4/HBS-G te bereiden, verdunt u de calciumtestkleurstof met HBS-G in een verhouding van 1:1 en filtreert u door een filter van 0.22 μM. Voeg 225 μl Fluo-4/HBS-G toe aan de daarvoor bestemde putjes van een plaat met 96 putjes bij 37 °C.
    4. Incubeer PRP bij 37 °C gedurende 30 minuten in een verdunning 1:1 met Fluo-4/HBS-G.
    5. Bereid het activeringsmengsel in Fluo-4/HBS-G en incubeer bij 37 °C. De agonisten omvatten trombine (1 E/ml) in aanwezigheid van GPRP, CRP-XL (0,5 μg/ml), ADP (1 μM), epinefrine (20 μM), U46619 (1 μM) en TRAP-6 (1 μM).
    6. Voeg onmiddellijk voor het verzamelen PRP/Fluo-4/HBS-G toe aan de 225 μl Fluo-4/HBS-G-mix met een uiteindelijke PRP-verdunning (na toevoeging van agonist) van 1: 600 (v/v; 0,5 ml in 300 ml van het uiteindelijke volume).

4. Analyseprocedure en gegevensverzameling

  1. Stel de flowcytometer in op een flowrate op 'langzaam' met een gemiddeld aantal van 1000 events per seconde (eps) en een maximum van 3000 eps. Stel de drempel in op 20000 om te voorkomen dat celresten worden geregistreerd.
  2. Bepoort de bloedplaatjespopulatie met behulp van voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijverstrooiing (SSC) plots. Zet voor het verzamelen van gegevens FSC-A versus SSC-A uit om de bloedplaatjespopulatie nauwkeurig te bepalen en FL1 of FL4 versus tijd om de fluorescerende gebeurtenissen in de loop van de tijd vast te leggen.
  3. De flowcytometer heeft 14 s nodig om te beginnen met het registreren van gebeurtenissen; laat het instrument vervolgens nog 5 s gebeurtenissen in elk putje registreren voordat u snel 75 μL van het activeringsmengsel toevoegt met behulp van een gellaadtip om spontane menging te garanderen (Figuur 1).
  4. Verzamel de gebeurtenissen gedurende 5 minuten en stel de plots in om het 488 (FL1; 533/30 filter - FITC-fibrinogeen/FLUO-4) kanaal vs. tijd en het 633 (FL4; 675/25 filter - APC-P-selectin) kanaal vs. tijd op te nemen.
  5. Sla de plotgegevens voor de 488 en 633 kanalen van elke put op als CSV-bestanden.

5. Gegevensanalyse

  1. Download de nieuwste versie van Kinetx12.
    OPMERKING: De download bevat alle code die nodig is om de gegevens te analyseren die uit de test zijn gegenereerd en gaat vergezeld van een testset van experimentele gegevens van tien donoren en resultaten die zijn gegenereerd uit hun analyse (deze resultaten kunnen worden geregenereerd en gevalideerd via de volgende procedures) (Figuur 2).
  2. R-omgeving instellen
    1. Gebruik de programmeertaal R via de RStudio-omgeving. Installeer R13, RStudio14 en de volgende pakketten: ggplot2, dplyr, plotrix, minpack.lm, tidyverse, psych. Zorg ervoor dat alle vereiste pakketten met succes zijn geïnstalleerd.
    2. Metadata maken: Plaats een tekstbestand (wellData.txt genoemd) in dezelfde map als de gegevens. Het beschrijft de agonisten, hun concentraties, eventuele antilichamen en de test (functie of calcium) die wordt gebruikt om elk CSV-bestand te genereren.
    3. Plaats een tweede tekstbestand ('IsotypeData.txt') in dezelfde map en definieer de isotypes. De bestanden die in de download worden meegeleverd ('data/wellData.txt' en 'data/IsotypeData.txt') kunnen als sjabloon fungeren en zijn gemakkelijk aan te passen aan alternatieve agonisten, remmers en concentraties.
    4. Analyseer de gegevens: Kinetx bestaat uit drie functies zoals gedefinieerd in de stappen 5.2.5-5.2.7.
    5. kinetxProcess.R: Deze functie verwerkt de ruwe functionele flowcytometriegegevens. Om uit te voeren typ kinetxProcess('data location','where to place outputs','FL1' (voor FITC-anti-fibrinogeen, of 'FL4' (voor APC-CD62P)
    6. kinetxProcessCalcium.R: Deze functie analyseert en labelt de calciumfluxgegevens. Typ kinetxProcessCalcium('gegevenslocatie', 'waar uitvoer plaatsen', 'FL1') om uit te voeren
    7. kinetxSummary.R: Deze functie vat de gegevens samen. Typ kinetxSummary('gegevenslocatie', 'waar uitvoer plaatsen', 'FL1') om uit te voeren.
    8. Als u alle bovenstaande functies (5.2.5-5.2.7) op de testgegevens wilt uitvoeren, gebruikt u het script (test. R).
      OPMERKING: De eerste twee functies produceren cijfers voor elke donateur die de onbewerkte gegevens plus de gemonteerde curven weergeven. Alle outputs en een spreadsheet die de gegevens samenvat, worden op de outputlocatie geplaatst.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De analyse van de functionele real-time flowcytometrie brengt verschillen in de vorm van activeringscurves aan het licht tussen agonisten en tussen donoren
Data-analyse van de functionele gegevens (blootstelling aan P-selectine en fibrinogeenbinding) met behulp van Kinetx verwijdert datapunten die buiten redelijke bereiken (>200000 of <1) en <2,80 s liggen (nultijd is ingesteld op dit punt), normaliseert gegevens naar de mediaan van de isotypen en past in een vloeiende voortschrijdende gemiddelde curve (via functie löss). Kinetx kent ook statistieken en categorieën toe die zijn gebaseerd op de passende afgevlakte lijnvorm, absolute waarden en veranderingssnelheden als volgt: (1) RoC - gemiddelde stijging van de afgevlakte lijn over de eerste 120 s; (2) label - categoriseert antwoorden als snel, gemiddeld of traag en wordt ingesteld volgens de cut-offs van 40 en 80 voor FL1 en 5 en 10 voor FL4; (3) EarlyRoC - gemiddelde stijging van de afgevlakte lijn over de eerste 20 s; (4) vorm - lage responders, toenemend, lineair of afnemend (Figuur 3A) - Lage responders worden bepaald als FL1 < 4000 of FL4 < 1000, de labels toenemend, lineair en afnemend worden bepaald op basis van: shapeMetric - RoC(120 seconden)/EarlyRoC, waarbij toenemende shapeMetric >2, lineaire shapeMetric tussen 0,9-2 en afnemende shapeMetric <0,9; (5) Produceert een spreadsheet met een samenvatting van de gegevens door het niveau en de snelheid van verandering te verstrekken op 0 s, 10 s, 20 s, 30 s, 40 s, 60 s, 90 s, 120 s, 180 s, isotype mediaan, de maximale en minimale snelheden van verandering en versnelling en alle labels en categorieën.

Bloedplaatjesfibrinogeenbinding en blootstelling aan P-selectine gedurende 5 minuten na activering als reactie op een enkele concentratie van de agonisten ADP, TRAP-6, CRP-XL, epinefrine en U46617 werd geanalyseerd bij 30 donoren. De metrieken voor fibrinogeenbinding en blootstelling aan P-selectine als reactie op verschillende agonisten vertonen een aanzienlijke variatie in de vorm van de respons (Figuur 3). Bloedplaatjes gestimuleerd met TRAP-6 en ADP vertoonden een snellere versnelling van de fibrinogeenbinding, die voor veel donoren op latere tijdstippen vertraagde (Figuur 3B). Fibrinogeenbinding als reactie op CRP-XL, trombine en epinefrine vertoonde meer kans op een toenemende of lineaire respons. Veel donoren vertoonden een relatief lange vertragingstijd voor CRP-XL voordat de snelheid van fibrinogeenbinding snel versnelde. De respons op U46619 werd vaak als laag gecategoriseerd. Daarentegen was de kans groter dat blootstelling aan P-selectine een lineaire of toenemende respons vertoonde op alle agonisten, behalve U46619, die opnieuw lage responsniveaus vertoonde (Figuur 3C).

Intracellulaire calciumflux tijdens activering van bloedplaatjes kan nauwkeurig worden gemeten met behulp van real-time flowcytometrie
Gegevensanalyse van de calciumfluxtest verwijdert gegevenspunten die buiten een redelijk bereik liggen (< 2,80 s nultijd is ingesteld op dit punt) en past vervolgens een vloeiende voortschrijdende gemiddeldecurve (via functie löss). Kinetx kent metrieken toe en categorieën worden als volgt toegewezen op basis van de passende vloeiende lijnen, absolute waarden en veranderingssnelheden: (1) categorie - die de vorm van de calciumrespons beschrijft op basis van de vroege opkomst, het maximum en de uiteindelijke daling van het maximum, beschreven als lineair, piek of aanhoudend (Figuur 4A); (2) snelheid - die de veranderingssnelheid in de snelle 30 s beschrijft en wordt gedefinieerd als geen verandering, langzaam, gemiddeld of snel (met een afkapping op 10, 40 en 80). Kinetx produceert ook een spreadsheet met een samenvatting van de gegevens door het niveau en de snelheid van verandering te verstrekken op 0 s, 10 s, 20 s, 30 s, 40 s, 60 s, 90 s, 120 s, 180 s, de maximale en minimale snelheden van verandering en versnelling en alle labels en categorieën, evenals het produceren van een cijfer van de gegevens voor elke donor. Voorbeelden van calciumflux gemeten met deze methode bij 30 personen vertoonden opnieuw verschillende activeringspatronen tussen individuen en agonisten (Figuur 4B). CRP-XL gaf overwegend een aanhoudende calciumrespons, terwijl de respons op TRAP-6 meestal een piekrespons vertoonde. Alle andere agonisten genereerden een overwegend lineaire respons.

Real-time flowcytometrie identificeert verschillen in maximale activeringsniveaus als reactie op verschillende agonisten en concentraties
De resultaten tonen aan dat de real-time flowcytometrietest het vermogen heeft om verschillen te detecteren in de maximale niveaus van fibrinogeenbinding (Figuur 5A) en blootstelling aan P-selectine (Figuur 5D), als reactie op stimulatie via verschillende receptoren (10 μg/ml crp-xl vs. 3 E/ml trombine P < 0,001; 10 μg/ml crp-xl vs. 1 E/ml trombine P < 0,001). Ze tonen ook aan dat de test gevoelig is voor verschillen in agonistconcentratie, waarbij de niveaus van maximale fibrinogeenbinding en blootstelling aan P-selectine worden verhoogd als reactie op hogere agonistconcentraties (fibrinogeenbinding - CRP-XL - 0,004 μg/ml vs. 0,4, 5, 10 μg/ml, P < 0,01; trombine - 0,0012 E/ml vs. 1 en 3 E/ml, P < 0,01; ADP - 0,04 μg/ml vs. 1 en 4 μM, P < 0,05).

De real-time flowcytometrietest is gevoelig genoeg om variabiliteit tussen donoren in de activeringssnelheid van bloedplaatjes te detecteren
De maximale snelheid van activering van bloedplaatjes werd bepaald door een afgevlakt voortschrijdend gemiddelde (löss) aan de fluorescentiegegevens toe te passen en dit vervolgens te gebruiken om de maximale snelheid van fibrinogeenbinding en blootstelling aan P-selectine te berekenen (Figuur 5B,E). De gegevens tonen een aanzienlijke variatie aan tussen individuele donoren, en de flowcytometrietest is gevoelig genoeg om deze variatie te detecteren. De resultaten geven aan dat het verhogen van de agonistconcentratie weinig effect heeft op de maximale bindingssnelheid van fibrinogeen (Figuur 5B). Daarentegen neemt de maximale blootstelling aan P-selectine toe bij een hogere trombine- en CRP-XL-concentratie, maar niet bij toenemende concentraties ADP (Figuur 5E).

Variaties in de vertragingstijd van bloedplaatjesactivering kunnen worden gedetecteerd met behulp van real-time flowcytometrie
De tijd tot de maximale snelheid van activering van bloedplaatjes werd bepaald door de tijdstippen te berekenen waarop de maximale snelheid van fibrinogeenbinding en blootstelling aan P-selectine werd bereikt (Figuur 5C,F). De maximale snelheid van fibrinogeenbinding en blootstelling aan P-selectine varieert tussen donoren, vooral bij lagere agonistconcentraties. Stimulatie van bloedplaatjes met toenemende concentraties CRP-XL laat zien dat hogere agonistconcentraties minder tijd nodig hebben om de maximale bindingssnelheid van fibrinogeen te bereiken met minder variabiliteit tussen donoren; deze trend wordt echter niet gezien bij trombine- of ADP-stimulatie (Figuur 5C). De test toont aan dat in sommige omstandigheden het verhogen van de agonistconcentratie de tijd verkort die nodig is om de activering van bloedplaatjes te beginnen (vertragingstijd) zonder de maximale snelheid van bloedplaatjesactivering te wijzigen en dat beide maatregelen met deze test kunnen worden beoordeeld.

figure-results-1
Figuur 1: Real-time flowcytometrie in het wet-lab. (A) antigecoaguleerd volbloed werd (B) gecentrifugeerd om bloedplaatjesrijk plasma (PRP) te verkrijgen. (C) Verdund PRP met geschikte antilichamen of calciumindicatorkleurstoffen werd in een plaat met 96 putjes geplaatst, op een niet-drukloze flowcytometer geladen en met behulp van een dissectiemat op 37 °C gehouden. Monsters werden tijdens de acquisitie gestimuleerd met een activeringsmengsel met antilichamen of calciumkleurstof en agonist, snel toegevoegd aan de put met behulp van een gellaadtip om spontane menging te garanderen. (D) Gebeurtenissen werden gedurende 5 minuten verzameld en CSV-bestanden van de gegevens voor elke put werden opgeslagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Schema van de data-analyse. (A) De R-omgeving is geconfigureerd en er zijn metagegevens gemaakt. (B) Externe gegevens werden verwijderd en er werd een curve van het vloeiend voortschrijdend gemiddelde (löss) aangebracht. (C) Het type respons en de vorm van de (D) respons werden gedefinieerd. (E) Statistieken werden berekend, geëxporteerd en cijfers gegenereerd voor elke donor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Representatieve output van Kinetx-analyse van real-time bloedplaatjesfibrinogeenbinding en P-selectine-expressie. (A) Naast het verstrekken van statistieken zoals de maximale veranderingssnelheid (RoC) en de RoC op verschillende tijdstippen, categoriseert Kinetx ook de vorm van de curve om aanvullende informatie te verstrekken over de activering van bloedplaatjes die moeilijk in één enkele metriek vast te leggen is. Representatieve gegevens voor 30 personen tonen de typische variatie die wordt waargenomen in real-time bloedplaatjes (B) fibrinogeenbinding en (C) P-selectine-expressie als reactie op de agonisten ADP, TRAP-6, CRL-XL, epinefrine en U46617. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Representatieve output van Kinetx-analyse van real-time bloedplaatjescalciumflux. (A) Naast het verstrekken van statistieken zoals de maximale veranderingssnelheid (RoC) en de RoC op verschillende tijdstippen, categoriseert Kinetx ook de vorm van de calciumfluxcurve om aanvullende informatie te geven over de activering van bloedplaatjes die moeilijk in één enkele metriek kan worden vastgelegd. Representatieve gegevens voor 30 personen tonen de typische variatie die wordt waargenomen in real-time bloedplaatjes (B) calciumflux als reactie op de agonisten ADP, TRAP-6, CRL-XL, epinefrine en U46617. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: De concentratie van agonisten bepaalt de maximale activering van bloedplaatjes, maar niet de snelheid waarmee bloedplaatjes worden geactiveerd. De maximale activatie van bloedplaatjes - blootstelling aan fibrinogeenbinding (A) of P-selectine (D) - werd significant positief veranderd door de concentratie van agonisten (CRP-XL, trombine of ADP). De snelheid van activering van bloedplaatjes (B en E) en de tijd tot de maximale snelheid van activering van bloedplaatjes (C en F) vertoonden geen of een zwakkere relatie met veranderende agonistconcentratie. P-waarden geven de significantie aan over het hele concentratiebereik (Kruskal-Wallis-test), en sterretjes geven een significant verschil aan (meervoudige vergelijkingstest) van individuele waarden ten opzichte van de laagste concentratie. * P < 0,05, ** P < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De snelheid waarmee bloedplaatjes activerende stimuli detecteren, verwerken en erop reageren, kan een essentiële bepalende factor zijn voor trombusvorming. Eerdere studies hebben aangetoond dat remming van signaalelementen die van invloed zijn op de snelheid, maar niet op de uiteindelijke mate van activering van bloedplaatjes, resulteert in de vorming van onstabiele trombi8. Veel testen op de bloedplaatjesfunctie meten de mate van activering en aggregatie van bloedplaatjes als reactie op verschillende aandoeningen en behandelingen; Deze houden echter geen rekening met de snelheid waarmee bloedplaatjes worden geactiveerd en de tijd die nodig is om dit complexe proces te laten plaatsvinden 3,4. De innovatieve, op flowcytometrie gebaseerde assays die hier zijn ontwikkeld, monitoren op reproduceerbare wijze de activering van bloedplaatjes in de loop van de tijd en vertalen dit in een reeks metrieken om de maximale snelheid van bloedplaatjesactivering te berekenen en de tijd die bloedplaatjes nodig hebben om deze maximale snelheid te bereiken en volledig geactiveerd te worden.

De gepresenteerde gegevens benadrukken het vermogen van de real-time test om variaties te identificeren tussen verschillende reacties op het type agonist en de concentratie en tussen individuen. Veel eerdere rapporten hebben aangetoond dat de reactiviteit van bloedplaatjes zeer variabel is tussen normale individuen15,16, wat aangeeft dat de snelheid van activering van bloedplaatjes ook aanzienlijk kan variëren binnen de populatie. Gegevens uit deze studie tonen aan dat de snelheid van degranulatie en fibrinogeenbinding aan bloedplaatjes zelfs variabeler lijkt te zijn dan de maximale niveaus van activering van bloedplaatjes. Dit toont aan dat real-time flowcytometrie ook kan worden gebruikt als een waardevol en betrouwbaar hulpmiddel om variaties in het aantal bloedplaatjes in de populatie te identificeren en de effecten van verschillende remmende of proactiverende middelen op het aantal bloedplaatjes te detecteren als een aanvullend middel om de bloedplaatjesfunctie te meten.

Wanneer de bloedplaatjesfunctie wordt gemeten met behulp van eindpunttesten, kunnen vergelijkingen worden gemaakt over de mate van fibrinogeenbinding of granule-afgifte tussen verschillende agonisten. De lösscurven die de fibrinogeenbinding gedurende de eerste 5 minuten van de activering van bloedplaatjes vergelijken, tonen het vermogen van de real-time test aan om meer details te achterhalen in de verschillen in de kinetiek van de activering van bloedplaatjes die tests met één eindpunt niet kunnen meten.

De gegevens die uit de real-time test zijn verzameld, tonen aan dat de snelheid waarmee fibrinogeen zich aan bloedplaatjes bindt een iets ander patroon volgt, afhankelijk van de activeringsroute (Figuur 3). Om de kinetiek van de activering van bloedplaatjes nauwkeurig te beoordelen, is het essentieel om een drukloze flowcytometer te gebruiken die gelijktijdige gegevensverzameling en monsterstimulatie mogelijk maakt. Het is ook essentieel dat de agonisten snel worden toegevoegd om een vrijwel onmiddellijke en volledige vermenging van agonist en bloedplaatjes te garanderen. Stimulatie met trombine, ADP en epinefrine produceert een vergelijkbare curve, wat een snelle initiatie van signalering vertegenwoordigt als reactie op receptorsensibilisatie, wat resulteert in fibrinogeenbinding aan bloedplaatjes met een snelle en gestage snelheid. Daarentegen zijn bloedplaatjes die door CRP-XL worden gestimuleerd aanvankelijk erg traag om fibrinogeen te binden na initiële receptorsensibilisatie; De snelheid van fibrinogeenbinding wordt dan echter snel verhoogd na deze aanvankelijke vertraging. Stimulatie van bloedplaatjes met U46619, een mimeticum van TXA2, resulteert in een snelle initiële snelheid van fibrinogeenbinding, die snel afneemt tot een zeer langzame snelheid, wat leidt tot slechts een lichte en gestage toename van de fibrinogeenbinding in de loop van de tijd.

Kinetx is ontworpen om open-source, reproduceerbaar en eenvoudig te implementeren te zijn om problemen met propriëtaire software, zoals kosten en inflexibiliteit, te omzeilen. Als zodanig moest het worden ontwikkeld met software die niet propriëtair was. R werd gekozen omdat het veel wordt gebruikt door biologen, eenvoudig te installeren, gratis en open-source is. Deze open-sourceomgeving stelt gebruikers met een verstandige R-positie in staat om parameters te wijzigen, zoals de mate van afvlakking, identificatie van afgelegen gegevenspunten of tijdschalen. Om onderzoekers die niet bekend zijn met R te helpen, is Kinetix echter ook ontwikkeld, zodat de analyse kan worden uitgevoerd via een enkel commando (kinetxProcess of kinetxProcessCalcium, afhankelijk van de gegevens die worden geanalyseerd). De Kinetix-software die hier wordt gedemonstreerd, kan een reeks metrieken berekenen, waaronder waarden voor de maximale niveaus, snelheid en versnelling van blootstelling aan fibrinogeenbinding of P-selectine en de tijdstippen waarop deze maxima optreden. De kinetiek van bloedplaatjesactivering als reactie op verschillende stimulerende routes kan nauwkeuriger worden vergeleken met behulp van deze cijfers.

Vergelijkingen tussen verschillende agoniststimulaties in de maximale niveaus van fibrinogeenbinding en de snelheid van fibrinogeenbinding aan bloedplaatjes zijn goede voorbeelden van waar de snelheid van activering van bloedplaatjes kan variëren, onafhankelijk van de maximale binding. Bij vergelijking van de maximale fibrinogeenbinding na 5 minuten stimulatie met 0,04 μM ADP (3,85 LogFU) en 0,04 μg/ml crp-xl (3,70 LogFU), hebben beide agonisten geresulteerd in een vergelijkbare hoeveelheid gebonden fibrinogeen (Figuur 5A). De maximale bindingssnelheden van fibrinogeen vertonen een nog kleiner verschil (0,04 μM ADP - 0,0050 LogFU/minuut; 0,04 μg/ml crp-xl - 0,0054 LogFU/min), wat aangeeft dat de totale snelheid van fibrinogeenbinding vergelijkbaar is tussen deze twee stimulaties (Figuur 5B). Wanneer de vertragingstijd van bloedplaatjesactivering echter wordt vergeleken, is er een duidelijk verschil dat aantoont dat CRP-XL (117 s tot maximale snelheid) veel langzamer versnelt dan ADP (47 s tot maximale snelheid) (Figuur 5C). Het wordt dus duidelijk dat ADP-stimulatie resulteert in een veel snellere initiële respons (P < 0,001) in vergelijking met CRP-XL. Wanneer ze samen worden geobserveerd, beschrijven deze metingen van de bloedplaatjeskinetiek als reactie op twee verschillende agonisten een snelle initiële respons op ADP-stimulatie die langzaam versnelt en in een gestaag tempo blijft. Daarentegen resulteert CRP-XL-stimulatie in een langzame initiële activeringssnelheid, die op een veel later tijdstip snel versnelt, wat uiteindelijk leidt tot een vergelijkbare algehele snelheid en niveaus van fibrinogeenbinding als ADP. Deze verschillen tussen de maximale niveaus, snelheid en versnelling van fibrinogeenbinding tonen aan dat een aantal parameters betrokken zijn bij het meten hoe snel bloedplaatjes worden geactiveerd. De real-time assay en Kinetx-analyse kunnen deze parameters meten en vergelijken, de tijd beschrijven die nodig is vanaf receptorsensibilisatie tot de bloedplaatjesrespons en dit vergelijken tussen verschillende signaalroutes.

Het verhogen van de agonistconcentratie heeft geen significant effect op de snelheid waarmee fibrinogeen aan bloedplaatjes bindt. De tijd die nodig is om de maximale bindingssnelheid van fibrinogeen te bereiken, neemt echter af naarmate de agonistconcentratie toeneemt, wat suggereert dat bloedplaatjes fibrinogeen met een gestage snelheid binden en receptorverzadiging een prominentere rol speelt in hoe snel bloedplaatjes fibrinogeen binden.

De beschreven calciumfluxtest en -analyse is een snelle en eenvoudig uit te voeren calciumtest die als extra monsters in de real-time test kan worden opgenomen, waardoor de analyse van calcium- en bloedplaatjesfibrinogeenbinding en P-selectine in dezelfde reeks monsters mogelijk is. Het op maat gemaakte analysepakket biedt een diepgaande beoordeling van de kinetiek van de calciumflux, inclusief de vorm van de respons, de maximale respons en de tijd tot maximale respons. Deze parameters kunnen vervolgens worden vergeleken voor variatie tussen donoren en in reactie op verschillende farmaceutische middelen. Calciumflux in bloedplaatjes is eerder bestudeerd in bloedplaatjes met behulp van een verscheidenheid aan op flowcytometrie gebaseerde assays 17,18,19. Aliotta et al.14, beschrijven een elegante test die in staat is om de kinetiek van meerdere intracellulaire ionen te analyseren. De hier gepresenteerde calciumtest bouwt voort op deze eerder gepubliceerde assays door het analysepakket op te nemen dat meer flexibiliteit mogelijk maakt, een meer diepgaande verkenning van de gegevens met het voordeel van high-throughput-analyse voor meerdere donoren in een kort tijdsbestek.

Eerdere studies hebben aangetoond dat de remming of afwezigheid van bepaalde signaalmoleculen resulteert in een veranderde activeringssnelheid van bloedplaatjes, wat zich direct vertaalt in trombusvorming 8,9. In het verleden kon de activeringskinetiek van bloedplaatjes worden gemeten door middel van flowcytometrie over een aantal vaste tijdstippen, die vervolgens kunnen worden gebruikt om bijvoorbeeld de snelheid van GPIIbIIIa-externalisatie als reactie op verschillende agonisten te berekenen en te vergelijken20. De real-time assay en Kinetx-analyse die in dit artikel worden beschreven, bieden een eenvoudige, gratis beschikbare en nauwkeurige methode voor het meten van zowel de snelheid als het eindpunt van de activering van bloedplaatjes in rust. Dit is waarschijnlijk belangrijk bij het identificeren van fysiologisch relevante variaties in de bloedplaatjesfunctie die kunnen worden gemist wanneer alleen eindpuntmetingen worden gemeten.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit project werd ondersteund door de British Heart Foundation (PG/16/36/31967, RG/20/7/34866 en RG/15/2/31224).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
9,11-Dideoxy-11α,9α-epoxymethanoprostaglandin F2α - U46619Sigma-Aldrich, Poole, UKD8174-1MG
Accuri C6 flow cytometer met BD CsamplerBeckton Dickinson, UK660517 + 660519
Adenosine difosfaatSigma-Aldrich, Poole, UKA2754-1G
APC-gelabeld anti-P-selectine (CD62p)BD Biosciences, UK550888
Corning polypropyleen 96-well ronde bodem, niet-behandelde microtiterplaatSigma-Aldrich, Poole, UKCLS3879-50EA
Cross-linked collageen gerelateerd peptide (CRP-XL)CambCol, UK
EpinefrineSigma-Aldrich, Poole, UKE4375-1G
FITC-gelabeld anti-fibrinogeen antilichaamDako, Agilent Technologies, UKF011102-2
Fluo-4 Direct kleurstofThermo-Fisher ScientificF10472
Gel-laadtipsStarlab, UKI1022-0600
Gly-Pro-Arg-Pro peptideSigma-Aldrich, Poole, UKG1895-5MG
TrombineSigma-Aldrich, Poole, UKSRE0003-10KU
Trombine receptor activator peptide 6 (TRAP-6)Bachem, St Helens, UKH-2936.0005
Vacuette 9NC coagulatie 3,2 % trinatriumcitraat (0,109 mol/L)Greiner Bio-one LTD, Stonehouse, UK454327

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bye, A. P., Unsworth, A. J., Gibbins, J. M. Platelet signaling: a complex interplay between inhibitory and activatory networks. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 14 (5), 918-930 (2016).
  2. Jones, C. I., Barrett, N. E., Moraes, L. A., Gibbins, J. M., Jackson, D. E. Endogenous inhibitory mechanisms and the regulation of platelet function. Methods in Molecular Biology. 788, 341-366 (2012).
  3. Paniccia, R., Priora, R., Liotta, A. A., Abbate, R. Platelet function tests: a comparative review. Vascular Health and Risk Management. 11, 133-148 (2015).
  4. Saboor, M., Moinuddin, M., Ilyas, S. New horizons in platelets flow cytometry. The Malaysian Journal of Medical Sciences : MJMS. 20 (2), 62-66 (2013).
  5. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88, 1525-1541 (1996).
  6. Pasquet, J. M., Noury, M., Nurden, A. T. Evidence that the platelet integrin alphaIIb beta3 is regulated by the integrin-linked kinase, ILK, in a PI3-kinase dependent pathway. Thrombosis and Haemostasis. 88 (1), 115-122 (2002).
  7. Stevens, J. M., Jordan, P. A., Sage, T., Gibbins, J. M. The regulation of integrin-linked kinase in human platelets: evidence for involvement in the regulation of integrin alpha 2 beta 1. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 2 (8), 1443-1452 (2004).
  8. Jones, C. I., et al. Integrin-linked kinase regulates the rate of platelet activation and is essential for the formation of stable thrombi. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 12 (8), 1342-1352 (2014).
  9. Cifuni, S. M., Wagner, D. D., Bergmeier, W. CalDAG-GEFI and protein kinase C represent alternative pathways leading to activation of integrin alphaIIbbeta3 in platelets. Blood. 112 (5), 1696-1703 (2008).
  10. Stolla, M., et al. The kinetics of alphaIIbbeta3 activation determines the size and stability of thrombi in mice: implications for antiplatelet therapy. Blood. 117 (3), 1005-1013 (2011).
  11. Kawasaki, H., et al. A Rap guanine nucleotide exchange factor enriched highly in the basal ganglia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13278-13283 (1998).
  12. Kinetx. , Available from: http://github.com/cardiomaths/Kinetx (2021).
  13. R. , Available from: https://www.r-project.org/ (2021).
  14. R Studio. , Available from: https://rstudio.com/products/rstudio/download/ (2021).
  15. Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
  16. Panzer, S., Hocker, L., Koren, D. Agonists-induced platelet activation varies considerably in healthy male individuals: studies by flow cytometry. Annals of Hematology. 85 (2), 121-125 (2006).
  17. Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Alberio, L. Flow cytometric monitoring of dynamic cytosolic calcium, sodium, and potassium fluxes following platelet activation. Cytometry. Part A : The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 97 (9), 933-944 (2020).
  18. do Ceu Monteiro, M., Sansonetty, F., Goncalves, M. J., O'Connor, J. E. Flow cytometric kinetic assay of calcium mobilization in whole blood platelets using Fluo-3 and CD41. Cytometry. 35 (4), 302-310 (1999).
  19. Vines, A., McBean, G. J., Blanco-Fernandez, A. A flow-cytometric method for continuous measurement of intracellular Ca(2+) concentration. Cytometry. Part A : The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1091-1097 (2010).
  20. Weber, A. A., Schror, K. Differential inhibition of adenosine diphosphate- versus thrombin receptor-activating peptide-stimulated platelet fibrinogen binding by abciximab due to different glycoprotein IIb/IIIa activation kinetics. Blood. 98 (5), 1619-1621 (2001).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Trombocytenfunctieanalysekinetische metingenfibrinogeenbindinggranuleafgiftecalciumfluxreal time analyseopensourcesoftwaretrombusvorming
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen