Ultrasoon-geassisteerde extractie (VAE) verhoogt de extractie-efficiëntie van oplosmiddelen en wanneer toegepast op Cannabis spp. biomassa vermindert het de tijd die nodig is voor extractie. Dit verlaagt de kosten en het potentiële verlies van cannabinoïden als gevolg van degradatie. Bovendien wordt de VAE beschouwd als een groene methode vanwege het lage gebruik van oplosmiddelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ultrasoon-geassisteerde extractie van cannabidiolzuur uit cannabisbiomassa
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Industriële hennep (Cannabis spp.) heeft veel verbindingen van belang met potentiële medische voordelen. Van deze verbindingen zijn cannabinoïden in het middelpunt van de belangstelling komen te staan, met name zure cannabinoïden. De focus ligt op zure cannabinoïden vanwege hun gebrek aan psychotrope activiteit. Cannabisplanten produceren zure cannabinoïden met hennepplanten die lage niveaus van psychotrope cannabinoïden produceren. Als zodanig zou het gebruik van hennep voor zure cannabinoïde-extractie de noodzaak van decarboxylatie voorafgaand aan extractie als bron voor de cannabinoïden elimineren. Het gebruik van extractie op basis van oplosmiddelen is ideaal voor het verkrijgen van zure cannabinoïden, omdat hun oplosbaarheid in oplosmiddelen zoals superkritisch CO2 beperkt is vanwege de hoge druk en temperatuur die nodig zijn om hun oplosbaarheidsconstanten te bereiken. Een alternatieve methode die is ontworpen om de oplosbaarheid te verhogen, is ultrasoon geassisteerde extractie. In dit protocol is de impact van oplosmiddelpolariteit (acetonitril 0,46, ethanol 0,65, methanol 0,76 en water 1,00) en concentratie (20%, 50%, 70%, 90% en 100%) op ultrasoon geassisteerde extractie-efficiëntie onderzocht. De resultaten tonen aan dat water het minst effectief was en acetonitril het meest effectieve onderzochte oplosmiddel. Ethanol werd verder onderzocht omdat het de laagste toxiciteit heeft en over het algemeen als veilig (GRAS) wordt beschouwd. Verrassend genoeg is 50% ethanol in water de meest effectieve ethanolconcentratie voor het extraheren van de hoogste hoeveelheid cannabinoïden uit hennep. De toename van de cannabidiolzuurconcentratie was 28% in vergelijking met 100% ethanol en 23% in vergelijking met 100% acetonitril. Hoewel werd vastgesteld dat 50% ethanol de meest effectieve concentratie is voor onze toepassing, is ook aangetoond dat de methode effectief is met alternatieve oplosmiddelen. Bijgevolg wordt de voorgestelde methode als effectief en snel beschouwd voor het extraheren van zure cannabinoïden.
Inleiding
Industriële hennep (Cannabis spp.) produceert zure cannabinoïden in verschillende plantenweefsels (bloemen, bladeren en stengels), met de hoogste concentratie in de bloem1. De cannabisindustrie gebruikt verschillende methoden om deze verbindingen te extraheren. Een dergelijke methode is oplosmiddelextractie waarbij gebruik wordt gemaakt van een apolair en /of polair oplosmiddel, waarvan ethanol het meest wordt gebruikt. Oplosmiddelextractie alleen is echter beperkt in zijn vermogen; daarom zijn augmentatieve extractietechnieken, zoals microgolfondersteunde extractie (MAE) en ultrasoon geassisteerde extractie (VAE), ontworpen om de opbrengst te verhogen. Bovendien kan cannabidiol (CBD) met hoge concentratie worden geëxtraheerd met behulp van superkritische vloeistoftechnologieën2.
Extractie is een dynamisch proces en verschillende factoren beïnvloeden de efficiëntie ervan, namelijk vochtgehalte, deeltjesgrootte en oplosmiddel3. Specifiek voor de VAE-techniek wordt efficiëntie bepaald door temperatuur, druk, frequentie en tijd4.
Ultrasoon-geassisteerde extractie is het proces waarbij ultrasone golven door een vloeistof worden geleid om deeltjes te roeren. Tijdens het roerproces ervaren plantaardige materialen akoestische cavitatie, cycli van compressie en expansie die bellen vormen die in de oplossing instorten, wat resulteert in het genereren van extreme temperatuur en druk5. De druk- en temperatuurveranderingen veranderen de fysische eigenschappen van de oplosmiddelen, wat kan resulteren in een verhoogde effectiviteit van extractie6. Bovendien kan cavitatie moleculaire interacties verstoren die leiden tot organische en anorganische verbindingen die uit de plantenmatrix7 lekken. Het proces omvat twee hoofdtypen fysische verschijnselen: (1) diffusie over de celwand en (2) spoelen van de cellulaire inhoud na het breken van de wand8. Het gebruik van de VAE is echter niet zonder valkuilen; er zijn verschillende rapporten dat de VAE verbindingen 9,10 kan afbreken. Bovendien zijn de temperaturen die op de cavitatieplaatsen worden gegenereerd hoger dan die welke nodig zijn voor decarboxylatie van cannabinoïden. Mudge et al.11 gebruikten echter de VAE en observeerden geen grote decarboxylatie van CBD of tetrahydrocannabinol (THC), waardoor werd aangetoond dat de VAE een efficiënte en groene methode is voor de extractie van cannabinoïden, omdat ze snel kunnen worden geëxtraheerd met behulp van lage energie.
De Vita et al.12 onderzochten specifiek het gebruik van MAE- en VAE-methoden en ontdekten dat bij het toepassen van de optimale omstandigheden voor elke methode, de VAE meer van de zure en neutrale CBD en THC in het plantmateriaal extraheerde. Evenzo vergeleken Rožanc et al.13 meerdere extractiemethoden (VAE, soxhlet, maceratie en superkritische vloeistof) en onderzochten de biologische activiteit van de extracten. Rožanc toonde aan dat alle methoden effectief waren in het extraheren van cannabinoïden; superkritische vloeistof en VAE waren echter het meest effectief in het extraheren van cannabidiolzuur (CBDA). Bovendien had de VAE-extractie de hoogste biologische activiteit wanneer gemeten met de 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) -test. De studie van Rožanc toonde ook aan dat hoewel de extractieprocessen effectief zijn in het produceren van ruwe extracten, er een deel van niet-cannabinoïde verbindingen overblijft die de biologische activiteit van de extracten beïnvloeden. Bovendien kunnen deze verbindingen de isolatie en zuivering van individuele cannabinoïdeverbindingen uit de ruwe extracten13 bemoeilijken.
Superkritische vloeistofextractietechnieken (SFE) zijn gebruikt om neutrale cannabinoïden te extraheren. Verschillende studies toonden aan dat SFE plus een organisch oplosmiddel, zoals ethanol, resulteerde in een hogere extractie-efficiëntie van neutrale cannabinoïden 2,3. Wanneer de druk werd verhoogd tot niveaus die in staat waren om de zure cannabinoïden te extraheren, nam ook het niet-cannabinoïdegehalte toe. Als zodanig zijn deze hoge drukken niet praktisch voor industriële verwerking, omdat de selectiviteit van SFE voor cannabinoïden afneemt en extra nabewerking vereist is. Daarom moet decarboxylatie worden uitgevoerd voorafgaand aan SFE, wat kan resulteren in cannabinoïdeverliezen tot 18%2. Om de efficiëntie in SFE te verhogen, is het gecombineerd met technieken zoals vastefase-extractie om de zuiverheid van het uiteindelijke extract14 te verhogen. Ondanks de hoge zuiverheid als eindproduct worden echter alleen neutrale cannabinoïden verkregen.
Traditioneel werden cannabinoïden in het analytisch laboratorium geëxtraheerd in een 9:1 methanol:chloroform mengsel. Mudge et al.11 toonden echter aan dat effectieve extractie kan worden uitgevoerd met enkele oplosmiddelen bij gebruik van de VAE. De studie toonde aan dat 80% methanol net zo effectief was als de traditionele 9:1 methanol:chloroform extractie, wat aangeeft dat groenere oplosmiddelen net zo effectief kunnen zijn. Als zodanig werd de VAE onderzocht op het potentiële gebruik ervan vanwege verschillende voordelen, waaronder lage kapitaalkosten, kortere extractietijd en lager energieverbruik en oplosmiddelvolumes. In het geval van de VAE kunnen chlorofyl en andere niet-cannabinoïden echter worden geëxtraheerd wanneer polaire oplosmiddelen worden gebruikt, wat een probleem in kleur7 kan veroorzaken. Om het potentieel voor het verkrijgen van zure cannabinoïden op commerciële schaal te onderzoeken, werd de VAE daarom gebruikt met behulp van de industriële hennepvariëteit Cherry Wine. Cherry Wine is een hybride van C. sativa en C. indica, een kruising tussen de variëteiten van The Wife en Charlotte's Cherries. De Cherry Wine-variëteit is een hoge CBDA-producerende soort (15% tot 25% CBD) met lage niveaus van tetrahydrocannabinolzuur (THCA). De variëteit is een C. indica-gedomineerde soort die 7 tot 9 weken bloei heeft.
Om het optimale extractieprotocol van de VAE vast te stellen, werden twee benaderingen gevolgd: de traditionele one factor at a time (OFT) -optimalisatie en een Design of Experiment (DoE) -benadering met behulp van een Central Composite Design (CCD)15. Voor de DoE werd CBDA /CBD-extractie geoptimaliseerd op basis van de verhouding tussen monster en oplosmiddel, extractietijd en oplosmiddelconcentratie als factoren, en de resulterende gegevens werden geanalyseerd door Response Surface Methodology (RSM). Kortom, het beschreven protocol schetst de optimale methode voor het extraheren van de hoogste hoeveelheid CBDA / CBD.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van plantaardig materiaal
- Verkrijg Cherry Wine bloeiwijzen van planten die in het veld worden gekweekt, geplant in een zuid-naar-noord configuratie, met planten 1 m uit elkaar in het midden en rijen 1,2 m uit elkaar (teelt in Longmont, Colorado, VS).
- Droog de bloeiwijzen aan de lucht bij 35 °C gedurende 48 uur. Maal de bloeiwijzen met behulp van een maalmachine van 177 μm.
- Laat het verpulverde materiaal door de no. 80 gaaszeef gaan. Bewaar het resulterende poeder in een verzegelde zak bij kamertemperatuur voor toekomstig gebruik.
2. Ultrasone extractie
- Weeg 0,5 g van het Cannabis bloeiwijzepoeder in een conische buis van 50 ml. Voeg 40 ml van het oplosmiddel (bijv. 50% ethanol in gedeïoniseerd water) toe aan het vat.
- Plaats het extractievat in het ultrasone bad op 40 kHz en bij kamertemperatuur (ultrasoonapparaatvermogen is 100 W).
- Voer de extractie gedurende 30 minuten uit in het ultrasone bad en verhoog de temperatuur van het bad van 25 ° C tot 30 ° C.
- Decanteer de extractievloeistof in een centrifugebuis.
- Centrifugeer de vloeistof bij 3.000 x g bij 15 °C gedurende 15 minuten. Filtreer het supernatant onder vacuüm door een filterpapier van 8 μm.
3. High-performance vloeistofchromatografie (HPLC) kwantitatieve analyse
- Verdun zeven cannabinoïdestandaarden: cannabichromeen (CBC), CBD, CBDA, cannabinol (CBN), tetrahydrocannabinolzuur (THCA), Δ8-THC en Δ9-THC tot werkconcentraties van 100, 50, 25 en 12,5 μg/ml in 100% methanol. Mix en soniceer gedurende 5 minuten in een ultrasoon bad op 40 kHz en ultrasoonapparaatvermogen van 100 W
- Filter de normen door een spuitfilter van 0,45 μm polytetrafluorethyleen (PTFE). Filtreer het monstersupernatant (vanaf stap 2.5) door een PTFE-spuitfilter van 0,45 μm.
- Plaats het te analyseren monster in een injectieflacon van 1,5 ml in de HPLC-autosampler en laad 10 μL per keer.
- Voer HPLC uit volgens de voorwaarden en parameters in tabel 1. Leid cannabinoïdeconcentraties in 50-200 μg/ml af uit de gegenereerde standaardcurve.
- Vermenigvuldig met het volume van het oplosmiddel (40 ml) dat in het extractieproces wordt gebruikt om μg cannabinoïde te verkrijgen. Zet de μg cannabinoïde om in mg cannabinoïde door deze te delen door 1000.
- Verdeel met het oorspronkelijke gewicht van het plantaardige materiaal (0,5 g) dat bij de extractie is gebruikt om mg/g drooggewicht te verkrijgen.
4. Optimalisatie met behulp van responsoppervlakmethodologie
- Stel het model vast, bestaande uit 15 experimentele runs met 12 factoriële punten en drie middelpunten zoals weergegeven in tabel 4 met behulp van een data-analysetool.
- Optimaliseer de extractieparameters, extractietijd (T), oplosmiddelconcentratie (S) en monster/oplosmiddelverhouding (R) met behulp van responsoppervlakmethodologie en centraal composietontwerp. Stel het bereik van de variabelen T, S en R in op respectievelijk 5-30 min, 20%-100% en 60-100 (1:X).
- Selecteer de totale opbrengst van lipofiel extract en de opbrengsten van geëxtraheerde CBD en CBDA als responsfactoren (RF).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De gebruikte oplosmiddelen variëren van het midden van de polariteitsindex (0,460 - ACN) tot polair (1,000 - water). Uit tabel 2 kan worden gezien dat water geen effectieve extractiestof voor cannabinoïden was, wat niet onverwacht is, omdat cannabinoïden een beperkte oplosbaarheid in water hebben vanwege hun hydrofobiciteit13. In tegenstelling tot water hadden de andere oplosmiddelen vergelijkbare geëxtraheerde waarden van CBD en CBDA, waarbij het minst polaire oplosmiddelacetonit...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De polariteit van een oplosmiddel speelt een cruciale rol bij de effectieve extractie van verbindingen. Omdat zure cannabinoïden licht polair van aard zijn, grotendeels te wijten aan het carbonzuurgedeelte, werd aangenomen dat een polair oplosmiddel zoals methanol of ethanol het meest effectief zou zijn. Garrett en Hunt19 toonden in hun studie met THC aan dat de oplosbaarheid in waterige ethanol gebaseerd was op procent ethanol in de oplossing en ionische sterkte van de oplossing. Hoewel ionische ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door het Institute of Cannabis Research aan de Colorado State University-Pueblo, de Korea Innovation Foundation-subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (2021-DD-UP-0379) en Chuncheon city (Hemp R & D and industrialization, 2020-2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Acetonitrile | J.K.Baker | 9017-88 | solvent |
| Cannabichromene | Cerilliant | C-143 | Cannabinoïden standaard |
| Cannabidiol | Cerilliant | C-045 | Cannabinoïden standaard |
| Cannabidiolic acid | Cerilliant | C-144 | Cannabinoïden standaard |
| Cannabidivarin | Cerilliant | C-140 | Cannabinoïden standaard |
| Cannabigerol | Cerilliant | C-141 | Cannabinoïden standaard |
| Cannabinol | Cerilliant | C-046 | Cannabinoïden standaard |
| Centrifuge | Hanil Scientific Inc | Supra 22K | Centrifuge |
| Cherry Wine hemp | CFH, Ltd. | - | Bloesem extractie materiaal |
| Gedestilleerd water | TEDIA | WS2211-001 | solvent |
| Ethanol | TEDIA | ES1431-001 | solvent |
| Filterpapier | Whatman | #2 | Filteren |
| Molen | Daesung Artlon | DA280-S | Malen |
| HPLC | Shimadzu | LC-10 systeem | Analyse van Cannabinoïde |
| Methanol | TEDIA | MS1922-001 | solvent |
| Minitab 16.2.0 | Minitab Inc. | ||
| Spuitfilters | Whatman | 6779-1304 | Filteren |
| Tetrahydrocannabivarin | Cerilliant | T-094 | Cannabinoïden standaard |
| Trifluorazijnzuur | Sigma-aldrich | 302031-1L | HPLC stroming solvent |
| Ultrasoon bad | Jinwoo | 4020P | Ultrasoon extractie |
| Zorbax Eclipse plus C18 HPLC kolom | Agilent | 9599990-902 | HPLC kolom |
| Δ8 - Tetrahydrocannabinol | Cerilliant | T-032 | Cannabinoïden standaard |
| Δ9 - Tetrahydrocannabinol | Cerilliant | T-005 | Cannabinoïden standaard |
| Δ9 - Tetrahydrocannabinolzuur | Cerilliant | T-093 | Cannabinoïden standaard |
Referenties
- Hemphill, J. K., Turner, J. C., Mahlberg, P. G. Cannabinoid content of individual plant organs from different geographical strains of Cannabis sativa L. Journal of Natural Products. 43 (1), 112-122 (1980).
- Baldino, L., Scognamiglio, M., Reverchon, E. Supercritical fluid technologies applied to the extraction of compounds of industrial interest from Cannabis sativa L. and to their pharmaceutical formulations: A review. Journal of Supercritical Fluids. 165, 104960(2020).
- Daniel, R. G., et al. Supercritical extraction strategies using CO2 and ethanol to obtain cannabinoid compounds from cannabis hybrid flowers. Journal of CO2 Utilization. 30, 241-248 (2019).
- Azmir, J., et al. Techniques for extraction of bioactive compounds from plant materials: A review. Journal of Food Engineering. 117 (4), 426-436 (2013).
- Ohl, C. D., Kurz, T., Geisler, R., Lindau, O., Lauterborn, W. Bubble dynamics, shock waves and sonoluminescence. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 357 (1751), 269-294 (1999).
- Castro-Puyana, M., Marina, M. L., Plaza, M. Water as green extraction solvent: Principles and reasons for its use. Current Opinion in Green and Sustainable Chemistry. 5, 31-36 (2017).
- Herrera, M. C., De Castro, M. L. Ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from strawberries prior to liquid chromatographic separation and photodiode array ultraviolet detection. Journal of Chromatography A. 1100 (1), 1-7 (2005).
- Mason, T. J., Paniwnyk, L., Lorimer, J. P. The uses of ultrasound in food technology. Ultrasonics Sonochemistry. 3 (3), 253-260 (1996).
- Soares, V. P., et al. Ultrasound assisted maceration for improving the aromatization of extra-virgin olive oil with rosemary and basil. Food Research International. 135, 109305(2020).
- Kshitiz, K., et al. Ultrasound assisted extraction (UAE) of bioactive compounds from fruit and vegetable processing by-products: A review. Ultrasinics Sonochemistry. 70, 105325(2017).
- Mudge, E. M., Murch, S. J., Brown, P. N. Leaner and greener analysis of cannabinoids. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (12), 3153-3163 (2017).
- De Vita, D., et al. Comparison of different methods for the extraction of cannabinoids from cannabis. Natural Product Research. 34 (20), 2952-2958 (2020).
- Rožanc, J., et al. Different Cannabis sativa extraction methods result in different biological activities against a colon cancer cell line and healthy colon cells. Plants. 10 (3), 566(2021).
- Karğili, U., Aytaç, E. Supercritical fluid extraction of cannabinoids (THC and CBD) from four different strains of cannabis grown in different regions. The Journal of Supercritical Fluids. 179, 105410(2022).
- Sushma, C., et al. Optimization of ultrasound-assisted extraction (UAE) process for the recovery of bioactive compounds from bitter gourd using response surface methodology (RSM). Food and Bioproducts Processing. 120, 120-122 (2022).
- David, J. P., et al. Potency of Δ9-THC and Other Cannabinoids in Cannabis in England in 2005: Implications for Psychoactivity and Pharmacology. Journal of Forensic Sciences. 11, 129(2008).
- Agarwal, C., Máthé, K., Hofmann, T., Csóka, L. Ultrasound-assisted extraction of cannabinoids from Cannabis Sativa L. optimized by response surface methodology. Journal of Food Science. 83 (3), 700-710 (2018).
- Oroian, M., Ursachi, F., Dranca, F. Influence of ultrasonic amplitude, temperature, time and solvent concentration on bioactive compounds extraction from propolis. Ultrasonics Sonochemistry. 64 (2020), 105021(2020).
- Garrett, E. R., Hunt, A. Physiochemical properties, solubility, and protein binding of Δ9-tetrahydrocannabinol. Journal of Pharmaceutical Sciences. 63 (7), 1056-1064 (1974).
- Metcalf, D. G. Chemical Abstracts. United States patent. , US10555914 267166 (2020).
- Lazarjani, M. P., Young, O., Kebede, L., et al. Processing and extraction methods of medicinal cannabis: a narrative review. Journal of Cannabis Research. 3 (1), 1-15 (2021).
- Lewis-Bakker, M. M., Yang, Y., Vyawahare, R., Kotra, L. P. Extractions of medical cannabis cultivars and the role of decarboxylation in optimal receptor responses. Cannabis and Cannabinoid Research. 4 (3), 183-194 (2019).
- Brighenti, V., Pellati, F., Steinbach, M., Maran, D., Benvenuti, S. Development of a new extraction technique and HPLC method for the analysis of non-psychoactive cannabinoids in fibre-type Cannabis sativa L.(hemp). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 143, 228-236 (2017).
- FDA. , Available from: https://www.cfsanappsexternal.fda.gov/scripts/fdcc/?set=SCOGS (2021).
- Rae, J., et al. Estimation of ultrasound induced cavitation bubble temperatures in aqueous solutions. Ultrasonics Sonochemistry. 12, 325-329 (2005).
- Moreno, T., Montanes, F., Tallon, S. J., Fenton, T., King, J. W. Extraction of cannabinoids from hemp (Cannabis sativa L.) using high pressure solvents: An overview of different processing options. Journal of Supercritical Fluids. 161, 104850(2020).
- Zhang, Q. W., Lin, L. G., Ye, W. C. Techniques for extraction and isolation of natural products: a comprehensive review. Chinese Medicine. 13 (20), 1-26 (2018).
- Fathordoobady, F., Singh, A., Kitts, D. D., Singh, A. P. Hemp (Cannabis sativa L.) extract: Anti-microbial properties, methods of extraction, and potential oral delivery. Food Reviews International. 35 (7), 664-684 (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
