Integratieve toolkit om cellulaire signalen te analyseren: krachten, beweging, morfologie en fluorescentie

Samenvatting

Het Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) platform automatiseert het proces van het gelijktijdig meten van een breed scala aan chemische en mechanische signalen in aanhangende cellen. iTACS is ontworpen om community-driven ontwikkeling te vergemakkelijken en onderzoekers in staat te stellen alle platformfuncties te gebruiken, ongeacht hun educatieve achtergrond.

Samenvatting

Kwantitatieve beoordeling van cellulaire krachten en beweging is de afgelopen vier decennia aanzienlijk verbeterd. Deze ontwikkelingen boden het kader om inzichtelijke mechanische signaleringsprocessen in celkweeksystemen te onderzoeken. Het veld wordt momenteel echter geconfronteerd met drie problemen: gebrek aan kwaliteitsstandaardisatie van de verkregen gegevens, technische fouten in gegevensanalyse en visualisatie, en misschien wel het belangrijkste, de technologie blijft grotendeels buiten bereik voor gemeenschappelijke celbiologische laboratoria. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een nieuw experimenteel platform ontwikkeld - Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS). iTACS bestaat uit twee componenten: Acquisitie- en Trainingsmodule (AcTrM) en Analyse- en Visualisatiemodule (AnViM). AcTrM is gebaseerd op μManager - een op NIH-ImageJ gebaseerde microscoopbesturingssoftware - en vergemakkelijkt zelftraining en automatisering van gemeenschappelijke beeldacquisitieprotocollen. AnViM is gebaseerd op NIH-ImageJ en faciliteert gebruiksvriendelijke automatisering van data-analyse en inzichtelijke visualisatie van resultaten. Deze experimenten omvatten het kweken van adherente cellen op hydrogels, het afbeelden van fiduciale markers ingebed in de hydrogel en uiteindelijk het extraheren uit deze afbeeldingen van een uitgebreide mechanische karakterisering van de cellen. Momenteel stelt iTACS de gebruiker in staat om een breed scala aan eigenschappen te analyseren en te volgen, waaronder morfologie, beweging, cytoskeletale krachten en fluorescentie van individuele cellen en hun naburige regio. Het probleem met kwaliteitsstandaardisatie werd in AcTrM opgelost met een referentiebeeldgestuurde herfocussingstechniek. De technische problemen in data-analyse werden in AnViM aangepakt met een veelzijdige beeldsegmentatieprocedure, een gebruiksvriendelijke aanpak om randvoorwaarden te identificeren en een nieuwe op cellulaire eigenschappen gebaseerde datavisualisatie. AcTrM is ontworpen om de eenvoudige transformatie van basisfluorescentiemicroscopen in experimentele celmechanica-rigs te vergemakkelijken, en AnViM is uitgerust om gebruikers in staat te stellen cellulaire mechanische signalen te meten zonder een technische achtergrond te vereisen. iTACS zal beschikbaar zijn voor de onderzoeksgemeenschap als een open-source suite met community-gedreven ontwikkelingsmogelijkheden.

Inleiding

Veelgebruikte optische beeldvormings- en data-analysetools maken gebruik van hardware- en softwaretechnologieën die bijna verouderd zijn. De vertraging in de vertaling en implementatie van vooruitgang in elektronische apparaten, computationele benaderingen en wiskundige analyse in gemeenschappelijke experimentele celbiologische hulpmiddelen is een belangrijke beperking voor het groeitempo van onze kennis van cellulaire fysiologie. Momenteel vinden celbiologische onderzoekers moleculair biologische hulpmiddelen binnen handbereik, maar tools op basis van technische principes zijn buiten bereik. Een van die op engineeringprincipes gebaseerde tools is Monolayer Stress Microscopy (MSM)^1,2. Hoewel MSM is aangepast en bestudeerd in verschillende laboratoria over de hele wereld, is het gebruik ervan voornamelijk beperkt tot laboratoria met technische expertise3,4,5,6,7,8,9.

NIH-ImageJ is een van de meest populaire open-source tools onder celbiologische ^{onderzoekers10}. Door bijdragen van de gebruikersgemeenschap zijn verbeteringen centraal komen te staan in de ^{populariteit11,12}. ImageJ heeft functies waarmee gebruikers applicaties kunnen ontwikkelen met een mix van een geavanceerde programmeertaal en vereenvoudigde scriptbenaderingen. Deze functies vergemakkelijken gebruikers met basisprogrammeerkennis om elke nieuwe bijdrage aan de software te implementeren, aan te passen en te bevorderen. Voortbouwend op deze kwaliteiten van NIH-ImageJ, hebben we de Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) ontwikkeld, die een goedkope integratie van gewenste hardware- en softwaretools mogelijk maakt om de meting van een breed scala aan chemische en mechanische signalen over adherente cellen te ^{automatiseren11,12}.

iTACS bestaat uit twee componenten: Acquisitie- en Trainingsmodule (AcTrM) en Analyse- en Visualisatiemodule (AnViM). AcTrM is gebouwd op μManager - een op NIH-ImageJ gebaseerde beeldacquisitietoepassing - om gebruikers in staat te stellen time-lapse-metingen van traditionele optische eigenschappen en een verscheidenheid aan fysieke eigenschappen van adherente cellen in meerdere monsters ^{in te stellen12}. AcTrM vergemakkelijkt gebruikerstraining door middel van beknopte aanwijzingen in de grafische interface. Bovendien heeft het een nieuw kenmerk van op referentiebeelden gebaseerde autofocus die is ontworpen om realtime metingen van fysieke krachten te vergemakkelijken en kwaliteitsstandaardisatie van de verkregen gegevens mogelijk te maken.

AnViM is gebouwd op ImageJ-plug-ins, versnelde software en scripts voor bestandsafhandeling waarmee gebruikers meer dan 50 eigenschappen kwantitatief kunnen beoordelen, waaronder cellulaire vorm, grootte, oriëntatie, snelheid en bewegingsrichting, tracties uitgeoefend op de extracellulaire matrix (ECM) en op naburige cellen, contractiele en afschuifmomenten van zowel individuele adherente cellen als hun aangrenzende regio. AnViM faciliteert gebruikers om de cellulaire fysieke eigenschappen te kwantificeren zonder de onderliggende technische achtergrond onder de knie te ^krijgen11. Bovendien maakt het gegevensanalyse mogelijk in een interactieve of batchverwerkingsmodus. Het genereert heatmaps die ruimtelijke variatie onthullen en grafieken die de temporele variatie van de eigenschappen van individuele cellen laten zien.

In een typisch experiment kweekt de gebruiker cellen op een elastische hydrogel met geschikte extracellulaire matrixeiwitten op het bovenste oppervlak en twee soorten ingebedde fluorescerende markers. In wezen zijn beelden van deze fluorescerende markers voor en na het kweken van de cellen voldoende om de krachten in en rond individuele cellen te kwantificeren2,13. AnViM brengt deze resultaten in kaart op individuele cellen van de aanhangende cluster en genereert inzichtelijke beelden en grafieken.

Protocol

OPMERKING: Monsters die worden onderzocht met behulp van het iTACS-platform zijn cellen die zich hechten aan een zacht substraat. Het protocol voor het beoordelen van mechanische en chemische signalen is verdeeld in twee opeenvolgende delen: Acquisitie- en trainingsmodule (AcTrM) en Analyse- en visualisatiemodule (AnViM).

1. Acquisitie- en trainingsmodule (AcTrM)

OPMERKING: AcTrM automatiseert het proces van gegevensverzameling en zelftraining van gebruikers. Bereid vóór elke gegevensverzameling een zacht substraat voor dat informatie kan verstrekken die nodig is om de krachten te kwantificeren die cellen erop uitoefenen.

1. Hydrogel voorbereiding
   OPMERKING: Het doel hier is om een 1.250 Pa shear modulus, ongeveer 100 μm dikte, en 22 mm diameter polyacrylamide (PAA) hydrogel te bereiden.
   1. Bereid polyacrylamide-oplossing door de methode van Yeung et al. te volgen en giet de hydrogels volgens de stappen beschreven door Trepat et ^al.14,15. Een uitzondering op de procedure is dat de kralen direct onder de cellen een diameter van 0,5 μm hebben en gele fluorescentie uitzenden.
   2. Sla de stap over van het bevestigen van 2 μm-kralen aan het afdekglas als het kijkgebied naar verwachting een groot celvrij gebied heeft.
      OPMERKING: Hydrogel-voorbereidingsprotocol is nu redelijk vastgesteld in het ^veld16. In de daaropvolgende beschrijving worden de 0,5 μm kralen aangeduid als 'bovenste kralen', en de 2 μm kralen worden aangeduid als 'onderste kralen'. De onderste kralen zijn echter optioneel wanneer het afgebeelde gebied een groot celvrij gebied bevat. Het bovenste kralenpatroon uit zo'n celvrij gebied zal het doel van het onderste kralenpatroon dienen.
   3. Monteer de hydrogel met ingebedde fluorescerende kralen op het microscoopstadium.
   4. Laat 15-20 minuten duren voordat de temperatuur van de plaat een steady-state bereikt.
      OPMERKING: Het bovenoppervlak van de plaat is gefunctionaliseerd met extracellulaire matrixeiwitten, maar de cellen zijn nog niet gezaaid op de hydrogel.
2. Acquisitie van referentieafbeeldingen
   1. Deel 1: Een positielijst maken
      OPMERKING: Handmatige invoer in deze stap omvat het volgen van de AcTrM-aanwijzingen om locaties te kiezen met de beste kraalverdeling. In deze stap worden geen eerder gemaakte bestanden gebruikt. Belangrijke nieuwe mappen die in deze stap worden geproduceerd, zijn de mappen 't0imgs', 'tnimgs' en 'textfiles' en het geproduceerde bestand bevat het positielijstbestand. Zie figuur 2 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen voor het maken van een positielijst met AcTrM. Het gedemonstreerde voorbeeld verwerft gegevens bij 20x vergroting.
      1. Start μManager 2.0 - Beta.
      2. Voer AcTrM uit door op de knop AcTrM.bsh in het venster IMBL Resources te klikken.
      3. Selecteer in het venster met de titel Define Acquisition Properties de juiste doelstelling, tolerantie voor de nauwkeurigheid van lateraal positieherstel (d.w.z. XY), stapgrootte van de ruwe en verfijnde herfocussing (d.w.z. z) en waarde van een acceptabele beeldcorrelatiecoëfficiënt voor focusherstel.
         OPMERKING: Een fijnere tolerantie voor het laterale positieherstel zal het positieherstel vertragen, maar een aanzienlijke tolerantie vereist positiecorrectie tijdens gegevensanalyse en kan problemen veroorzaken bij focusherstel. Een kleinere stapgrootte zal de herfocussing vertragen, maar een zeer hoge stapgrootte kan snelle beweging veroorzaken met kansen om de focus te missen.
      4. Selecteer in het venster AcTrM - Stap 0 de optie Fresh Acquisition om een positielijst te maken.
         OPMERKING: Het venster met de titel AcTrM - Stap 1 bevat alle belangrijke volgende stappen. Deze stappen omvatten het verplaatsen van het podium, het aanpassen van de focus en het klikken op knoppen in de μManager. Deze stappen helpen bij het samenstellen van de lijst met posities die geschikt zijn voor gegevensverzameling.
      5. Klik op Live in Micromanager om de voorbeelden voor handmatige aanpassingen te visualiseren die worden vermeld in het actrm - stap 1 venster.
      6. Volg de stappen in dit venster.
      7. Verwerf nu het beeld van de kralen. Selecteer het juiste kanaal voor de bovenste kralen.
      8. Zorg ervoor dat je ook naar de onderste kralen kijkt. Selecteer hiervoor de kanalen voor de onderste kralen. Een wazig beeld van onderste kralen is te zien.
         OPMERKING: Kanalen kunnen worden geschakeld vanuit het vooraf ingestelde vervolgkeuzemenu in het hoofdvenster van μManager. Als de onderste kralen in het experiment worden gebruikt, zorg er dan voor dat ze op de geselecteerde positie aanwezig zijn. Deze kralen zien er wazig uit.
      9. Wanneer u de juiste positie selecteert, klikt u op Markeren in het venster Lijst met werkgebiedposities om de positie op te slaan.
         OPMERKING: De beste positie wordt bepaald door een dichte en uniforme verdeling van de bovenste kralen die direct onder het bovenoppervlak zijn ingebed (d.w.z. bovenste kralen) en ten minste twee kralen die aan het dekglas zijn bevestigd (d.w.z. onderste kralen) (aanvullende figuur S1). Focusherstel is sneller als de onderste kralen verschijnen als grote, onscherpe ringen. Als experimenten echter in één positie worden uitgevoerd zonder dat focus of lateraal positieherstel nodig is, negeert u instructies met betrekking tot de afbeelding van de onderste kralen.
      10. Volg de stappen 6-9 die worden beschreven in figuur 2 om extra posities in de lijst op te nemen.
          OPMERKING: Kies een paar extra posities zodat een eliminatieronde de beste posities op de plaat mogelijk kan maken.
   2. Deel 2: Verwerving van referentiebeelden
      OPMERKING: Deze stap omvat geen handmatige invoer. Eerder gemaakte belangrijke bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn onder meer 'textfiles/*.pos'. Belangrijke nieuwe bestanden en mappen die in deze stap worden geproduceerd, zijn die in de mappen 't0imgs' en 'tnimgs'. Zie figuur 3 en aanvullende figuur S2 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen die leiden tot het verkrijgen van referentiebeelden met behulp van AcTrM. Het venster AcTrM - Stap 2 bevat ook alle belangrijke stappen.
      1. Volg de stappen die worden vermeld in het venster AcTrM - Stap 2 en maak de keuzes in het venster Multidimensionale acquisitie . Als u bijvoorbeeld een lange tijdsverloop wilt uitvoeren, geeft u een aantal foto's aan die moeten worden gemaakt, selecteert u het eerste kanaal als fasekanaal en selecteert u vervolgens het volgende kanaal voor de bovenste kralen en het kanaal daarna voor de onderste kralen. Klik op Sluiten in het venster Multidimensionale acquisitie en klik vervolgens op OK in het venster ActrM - Stap 2 .
      2. Kies in het venster AcTrM - Stap 3 ervoor om het op referentieafbeeldingen gebaseerde XYZ-positieherstel in te schakelen. De keuze is over het algemeen ja. Als beelden echter op één positie worden verkregen zonder ruimte voor focus of podiumdrift, is de keuze in het venster AcTrM - Stap 3 Nee.
      3. Stel in het venster AcTrM - XYZ Recovery Options het kanaal in voor ruw XYZ-herstel, of verfijnd XYZ-herstel, regio en kanaal moeten worden uitgevoerd voor verfijnd XYZ-herstel en de richting waarin moet worden begonnen met opnieuw scherpstellen (aanvullende figuur S4). Na voltooiing zal AcTrM referentiebeelden verkrijgen.
         OPMERKING: Typische keuzes voor het kanaal zijn het onderste kralenkanaal. XYZ-herstel werkt het beste wanneer het wordt uitgevoerd met het volledige beeld in de huidige implementatie. Referentiebeelden bevatten meestal een doorgelaten lichtbeeld van de hydrogel, een fluorescerend beeld van de bovenste kralen en een fluorescerend beeld van de onderste kralen. De inhoud van elke afbeeldingenset kan variëren op basis van de keuzes die zijn gemaakt in het venster Multidimensionale acquisitie . Toch krijgt de software het referentiebeeld dat is ingesteld op elke positie die is bepaald in figuur 2. Aan het einde van deze stap worden drie mappen gemaakt in de gekozen map: 't0imgs', 'tnimgs' en 'textfiles'. De map 't0imgs' bevat referentieafbeeldingen in het formaat dat door μManager wordt herkend en in volgende stappen wordt gebruikt; De map 'tnimgs' bevat afzonderlijke TIFF-afbeeldingen met bestandsnamen 'c0_p0_t0.tif', 'c1_p0_t0.tif', enz. Hier staat 'c' voor het kanaal, 'p' staat voor de positie en 't' staat voor de tijd. Na deze letters volgen respectievelijk het kanaalnummer, positienummer en framenummer. De map 'textfiles' bevat de positielijst in XML-formaat en gebruikerskeuzes voor beeldacquisitie en positieherstel.
3. Cel zaaien en groei
   OPMERKING: Het iTACS-platform heeft de flexibiliteit om monstervoorbereidingsprotocollen te accommoderen die worden gebruikt bij gemeenschappelijke in vitro beoordeling van mechanisch gedrag van adherente cellen, waaronder schaarse cellen, volledig confluente monolaag, netwerkvormingstest en monolagen met gaten of significante hiaten.
   1. Kweek pulmonale microvasculaire endotheelcellen van ratten tot samenvloeiing in een ^kolf17,18.
   2. Maak de cellen los met behulp van trypsine. Resuspend de cellen in een kweekmedium met 10% foetaal runderserum tot een concentratie van 1 x ¹⁰⁶ cellen/ml.
   3. Plaats een druppel van 5 μL van de geresuspendeerde cellen op een gedeeltelijk droog hydrogeloppervlak en plaats deze in de celkweekincubator.
      OPMERKING: Na 2 dagen in het kweekmedium dat 10% foetaal runderserum bevat, vormen de cellen in die druppel een overvol eiland van ^cellen1.
4. Geautomatiseerde beeldacquisitie voor het resterende experiment
   OPMERKING: Handmatige invoer voor deze stap omvat het volgen van de AcTrM-aanwijzingen om de afbeeldingsacquisitie te hervatten. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die door deze stap worden gebruikt, zijn 'textfiles/*.pos' en onderste kraalafbeeldingsbestanden in de map 't0imgs'. Belangrijke nieuwe bestanden die in deze stap worden geproduceerd, zijn bijgewerkte positielijstbestanden en afbeeldingen 'tnimgs / * _t * .tif'.
   1. Zorg ervoor dat het microscoop-omgevingscontrolesysteem stabiele weefselkweekomstandigheden bereikt.
   2. Monteer de plaat met gekweekte cellen voorzichtig op het microscoopstadium.
   3. Laat 15-20 minuten intrekken om de temperatuur en vochtigheid te stabiliseren.
      OPMERKING: Zie figuur 4 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen die leiden tot het verkrijgen van afbeeldingen voor het resterende experiment met AcTrM.
   4. Start μManager 2.0 - Beta.
   5. Voer AcTrM uit door op de knop AcTrM.bsh in het venster IMBL Resources te klikken.
      OPMERKING: Negeer de keuzes die zijn gemaakt in het venster Acquisitie-eigenschappen definiëren , maar gebruik de keuzes die in de vorige stap zijn gemaakt.
   6. Selecteer in het venster AcTrM - Stap 0 doorgaan met gepauzeerde acquisitie.
   7. Selecteer de vergroting en map die zijn geïdentificeerd in het venster Multidimensionale acquisitie in de eerdere stap waarin gegevensmappen ('t0imags', 'tnimgs' en 'tekstbestanden') zijn opgeslagen.
      OPMERKING: De titel van het venster begeleidt de gebruiker bij het kiezen van de juiste map.
   8. Selecteer in het venster De plaat verplaatsen de opties voor het verplaatsen van de plaat (drie niet-lineaire posities) samen met het kanaal dat wordt gebruikt voor de herpositionering.
      OPMERKING: Opgeslagen beelden worden in de camera weergegeven. Als overlappende afbeeldingen worden weergegeven als een rode, groene en zwarte kleurenafbeelding, voert u handmatige aanpassingen uit.
   9. Klik op Accepteren om door te gaan met de overname.
      OPMERKING: Deze stap overwint de kleine verschuivingen van de onherleidbaarheid van plaatuitlijning wanneer de plaat opnieuw op het microscooppodium wordt gemonteerd. Volg de AcTrM-aanwijzingen om de uitlijning op elk van de drie posities te versnellen door een samengestelde afbeelding weer te geven van de referentieafbeelding die in het rood wordt weergegeven (meestal van de onderste kralen) en de afbeelding die momenteel wordt waargenomen door het doel dat in het groen wordt weergegeven. Door het groen voldoende dicht bij rood te krijgen, blijft er minder werk voor de software. Wanneer de overlap perfect is, ziet de samengestelde afbeelding er geel en zwart uit. Voldoende dichtbij is meestal wanneer dezelfde onderste kralen zichtbaar zijn in zowel rode als groene afbeeldingen, en de overeenkomstige rode en groene onscherpe ringen elkaar raken. Nadat de herpositionering van de plaat is voltooid, brengt AcTrM het podium naar elke geselecteerde positie en herstelt de XYZ-positie door het referentiebeeld af te stemmen op wat momenteel door de camera wordt gezien. De eerste laterale (XY) positie wordt gematcht en vervolgens wordt de focus (Z) gematcht. Ruw herstel wordt gevolgd door verfijnd herstel van de positie en focus. Updates van de huidige status van het experiment worden op het scherm weergegeven via een vierdelig venster dat wordt weergegeven in aanvullende figuur S3. De verkregen beelden worden opgeslagen in de map 'tnimgs' na '*_t1.tif', '*_t2.tif', waarmee het aantal tijdswaarden voor de afbeeldingenset wordt aangegeven. Als XYZ-herstel een bijgewerkte positie identificeert, wordt de nieuwe positielijst gegenereerd en opgeslagen in de map 'tekstbestanden'.

2. Analyse en Visualisatie Module (AnViM)

1. Geautomatiseerde data-analyse instellen
   OPMERKING: Handmatige invoer in deze stap omvat het identificeren van de locatie van de map 'tnimgs'. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn 'tnimgs /* .tif'. Belangrijke nieuwe bestanden en mappen die in deze stap worden geproduceerd, zijn de map 'analyse' in dezelfde bovenliggende map als 'tnimgs' en mappen voor elke positie 'analyse/p*'. Binnen elke 'analyse/p*' maakt deze stap een nieuwe '*.tif' afbeeldingsbestanden aan in de mappen 'phs' en 'tny'. Deze afbeeldingen zijn bijgesneden en gede-drifted afbeeldingen van cellen en bovenste kralen. De andere gecreëerde bestanden zijn 'analysis/analysisChoices.txt' met analysekeuzes, 'analysis/p*/skipAnalysis.txt', waarin gevallen worden vermeld waarin analyse wordt overgeslagen vanwege significante reeds bestaande drift, en 'analysis/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat' waarin geschatte driftwaarden worden vermeld. AnViM wijzigt de onbewerkte gegevens in de map 'tnimgs' niet. Zie figuur 5 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen die leiden tot het instellen van geautomatiseerde gegevensanalyse met behulp van AnViM.
   1. Start de Fiji-software en selecteer de eerste optie in het vervolgkeuzemenu MSM met het label MSM - voorbewerking.
   2. Selecteer in het dialoogvenster van de bestandsbrowser de map met de map 'tnimgs', die de geanalyseerde gegevens bevat.
   3. Definieer het kanaal voor de afbeeldingen. Volg de richtlijnen van aanvullende figuur S5 en identificeer de kanaalnummers van het doorgelaten lichtbeeld van de cellen (fasecontrastbeeld van de cellen), onderste kralenafbeelding en bovenste kralenafbeelding. De volgende drie selectievakjes ('Bestanden naar de positiemap verplaatsen', 'Extra correctie uitvoeren voor starre bewegingen' en 'Gegevens bijsnijden en opslaan in positiemap') zijn meestal aangevinkt. Definieer ten slotte de tolerantie voor het afwijzen van sterk afgedreven gegevens, pixelgrootte en zijden van de afbeelding waar de cellen elkaar kruisen.
   4. Reageer op de prompt om de helderheid en het contrast van de onderste kraalafbeeldingen te verbeteren, zodat de kralen prominent worden weergegeven. Pas dit aan met behulp van de schuifbalk in het menu en klik op OK.
   5. Voer nu positiecorrectie uit om van de eventuele verschuivingen af te komen. Als u klaar bent, wordt een analysemap gemaakt.
      OPMERKING: Contrastverbetering is meestal niet nodig, maar deze voorziening is beschikbaar voor experimenten waarbij de blootstelling aan lasers moet worden geminimaliseerd. Na die keuze kopieert AnViM de bestanden van de map 'tnimgs' naar de map 'analyse'. De bestanden die overeenkomen met elke positie worden opgeslagen in mappen 'analyse/p0, analyse/p1', enz. Binnen elk van deze positiemappen maakt AnViM 'cels', 'defs' en 'refs'-mappen met respectievelijk de originele doorgelaten lichtafbeelding, afbeeldingen van bovenste kralen en afbeeldingen van onderste kralen (aanvullende figuur S6). AnViM analyseert vervolgens de starre beweging in de afbeeldingen van de onderste kralen en creëert een 'phs'-map met een gecorrigeerd doorgelaten lichtbeeld van de cellen en een 'tny'-map met bijgewerkte bovenste kralenafbeeldingen. Ten slotte worden gebruikerskeuzes van de kanalen, bewerkingen, tolerantie, pixelgrootte en grensoverschrijding opgeslagen in het bestand 'analysisChoices.txt' (aanvullende figuur S6).
2. Kwantificering van vervorming van hydrogel en monolaag
   OPMERKING: Het is belangrijk op te merken dat kwantificering van beweging uit een reeks afbeeldingen een snel evoluerend veld ^is19. De technologie wordt voortdurend geoptimaliseerd voor functies, waaronder snelheid, nauwkeurigheid, specifieke functies in de onbewerkte afbeeldingen en specifieke vervormingspatronen. Daarom is het waarschijnlijk dat sommige gebruikers een andere deformatiekwantificeringsbenadering gebruiken dan degene die hier wordt gepresenteerd.
   1. Deel 1: Kwantificering van hydrogelvervorming
      OPMERKING: Handmatige invoer in deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap en de selectie van de rasterresolutie. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn onder meer 'p*/tny/*.tif'. Belangrijke nieuwe bestanden die hierin worden geproduceerd, zijn onder meer 'p*/displacement/*_disp.dat' dat verplaatsingsvectoren van het bovenste oppervlak van de hydrogel opsomt. Zie figuur 6 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen om via AnViM de Particle Image Velocimetry-analyse op de bovenste kralenafbeeldingen in te ^schakelen20.
      1. Start de Fiji-software en selecteer in het vervolgkeuzemenu MSM - Gel Deformation.
      2. Selecteer hier de optie die geschikt is voor het experiment.
      3. Selecteer in het dialoogvenster van de bestandsbrowser de bovenliggende map van de map 'analyse' met de geanalyseerde gegevens.
      4. Selecteer in het venster Parameters voor het berekenen van gelvervorming de juiste kruiscorrelatievenstergrootte, geluidsniveau en drempelwaarde (aanvullende figuur S7)²⁰.
         OPMERKING: De resultaten worden opgeslagen in een nieuw aangemaakte 'verplaatsingsmap' binnen elke positiemap 'analyse/p0, analyse/p1', enz. Hier worden alle uitvoerbestanden opgeslagen.
   2. Deel 2: Kwantificering van monolaagvervorming
      OPMERKING: Handmatige invoer in deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap en de selectie van de rasterresolutie. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn onder meer 'p*/tny/*.tif'. Belangrijke nieuwe bestanden die hierin worden geproduceerd, zijn onder meer 'p*/velocity/*_vel.dat' dat bewegingsvectoren van de cellen weergeeft. Zie figuur 7 voor de visuele beschrijving van de stappen om via AnViM de Particle Image Velocimetry-analyse op de bovenste kralenafbeeldingen in te ^schakelen20. De procedure is vergelijkbaar met de procedure die wordt gevolgd voor het kwantificeren van hydrogelvervorming en selecteert MSM - Cellular Motion in het vervolgkeuzemenu MSM . De resultaten worden opgeslagen in een nieuw aangemaakte 'velocity' directory binnen elke positiemap 'analysis/p0', 'analysis/p1', etc.
3. Kwantificering van cel-ECM en cel-celkrachten
   OPMERKING: Handmatige invoer in deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap, het aangeven van de hydrogelstijfheid en het reageren op cellulaire clustersegmentatieprompts om cellen uit het niet-celgebied te detecteren. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn onder meer 'p*/displacement/*_disp.dat'. Belangrijke nieuwe bestanden die in deze stap worden geproduceerd, zijn onder meer: 'p*/traction/*_trac.dat', waarin de krachten worden vermeld die door de cellen op de hydrogel worden uitgeoefend; "p*/traction/*_domain.dat", waarin de locatie van rasterpunten die cellen bevatten, wordt vermeld; en voer bestanden 'p*/traction.in, p*/clusterInput.txt' en 'p*/prestress.in' in in die gebruikerskeuzes voor deze stap vastleggen. Na de eerste kwantitatieve beoordeling van cel-ECM en cel-celkrachten zijn verschillende variaties op de techniek ^{ontwikkeld1,15}. De variaties richten zich op specifieke gevallen van substraten, cellen, experimentele omstandigheden of numerieke hulpmiddelen7,8,21,22. Zie figuur 8 voor de visuele beschrijving die via AnViM, de Fourier Transform Traction Microscopy en Monolayer Stress Microscopy analyse van de hydrogel deformatiegegevens1,2,15 in werking treedt.
   1. Start de Fiji-software en selecteer in het vervolgkeuzemenu MSM - Cell-ECM en Cell-Cell Forces (derde optie in het vervolgkeuzemenu).
   2. Selecteer in het dialoogvenster bestandsbrowser de bovenliggende map van de map 'analyse' met de mappen 'tnimgs' en 'analyse' met geanalyseerde gegevens. Klik op Selecteren.
   3. Voer in het venster Parameters voor het berekenen van cellulaire krachten de schuifmodulus, de dikte van de hydrogel en het verwachte geluidsniveau in. Selecteer OK. Hierdoor kan het tractie uitvoeren via de MATLAB-functie.
      OPMERKING: Na deze ingangen berekent AnViM cel-ECM-krachten.
   4. Geef daarna aan of de monolaag confluent is. Als het hele celbeeld bedekt is met cellen, is het antwoord Ja. In dat geval worden de cel-celkrachten over het hele frame berekend. Aan de andere kant, als een deel van de afbeelding geen cellen heeft, is het antwoord Nee. Volg in dat geval de AnViM-aanwijzingen om segmentatie van het afbeeldingsgebied dat cellen bevat, te vergemakkelijken.
   5. Als het antwoord nee is, tekent u handmatig een veelhoek rond het niet-celobject wanneer de software daarom vraagt en selecteert u vervolgens een geschikte methode(n) voor segmentatie. De software vraagt om de kleur (zwart of wit) van de cellen.
   6. Vink de optie Fill Spots Automatically in de software aan en klik op OK.
      OPMERKING: De stappen voor het segmenteren van een niet-confluente monolaag worden behandeld in het eerste deel van 'Punt 2.4. Cel-ECM-krachten worden opgeslagen in '*_trac.dat'-bestanden in een nieuw aangemaakte map 'traction' binnen elke positiemap, en de invoer in de cel-ECM-krachtberekeningssoftware wordt opgeslagen in het bestand 'traction.in' (aanvullende figuur S8). Cel-celkrachten worden opgeslagen in '*_prestress.dat'-bestanden in een nieuw aangemaakte map 'prestress' binnen elke positiemap, en de invoer in de cel-celkrachtberekeningssoftware wordt opgeslagen in het bestand 'prestress.in' (aanvullende figuur S9).
4. Rasterpuntwaarden toewijzen aan afzonderlijke cellen
   OPMERKING: Een van de huidige aandachtspunten van iTACS is het introduceren van een eenvoudige benadering om de gemeten mechanische signalen in het veld te interpreteren. Deze aanpak is gunstig voor het onderzoeken van mechanische interacties tussen naburige cellen van een cluster¹⁸. Over het algemeen bevinden de tot nu toe gekwantificeerde eigenschappen zich op regelmatig verdeelde rasterpunten over het cellulaire cluster. Deze gegevens identificeren de mediane, gemiddelde en standaarddeviatie van geselecteerde eigenschappen binnen de morfologische grens van individuele cellen en wijzen die toe als cellulaire fysieke eigenschappen / signalen. Hieruit wordt de standaarddeviatie gebruikt om variabiliteit aan te geven, het verschil tussen gemiddelde en mediaan wordt gebruikt om de aard van de verdeling aan te geven en de mediaanwaarde wordt gebruikt om de algehele toestand van de cellen voor de geselecteerde eigenschappen aan te geven.
   1. Deel 1: Segmentatie van het afbeeldingsgebied dat cellen bevat
      OPMERKING: Handmatige invoer voor deze stap omvat het identificeren van gegevensmap en het reageren op de segmentatieprompts om cellen uit het gebied zonder cel te detecteren. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn onder meer 'p*/phs/*.tif'. Belangrijke nieuwe bestanden die in deze stap worden geproduceerd, zijn 'p*/phs/bwImages/*.tif', binaire afbeeldingen die celgebieden scheiden van gebieden zonder cel, 'p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt', waarin het percentage afbeeldingsgebied wordt vermeld dat in elke instantie door cellen wordt bedekt, en 'p*/clusterInput.txt', waarin gebruikerskeuzes worden vastgelegd die zijn ingevoerd in de AcTrM-interface. Zie Afbeelding 9 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen om het afbeeldingsgebied dat cellen bevat te segmenteren. Dit deel moet worden voltooid voordat de cel-celkrachten worden berekend. In dat geval hoeven deze stappen niet te worden herhaald. Ook als deze stappen worden uitgevoerd vóór de cel-celkrachtberekeningen, worden ze niet gevraagd aan het begin van de krachtberekeningen.
      1. Start de Fiji-software en selecteer segmentatie - cellulair cluster in het vervolgkeuzemenu MSM.
      2. Selecteer in het dialoogvenster van de bestandsbrowser de positiemap 'analyse/p0', 'analyse/p1', enz., die eigenschappen bevat die zijn gekwantificeerd op regelmatig verdeelde rasterpunten.
      3. Geef aan of de monolaag confluent is.
         OPMERKING: De onderstaande stappen worden alleen aangeroepen als de monolaag niet samenvloeit. Volg de AnViM-aanwijzingen om de nieuwe meerledige benadering toe te passen om de afbeeldingsgebieden te identificeren die cellen bevatten. Het proces omvat vier methoden - elk benadert segmentatie op een andere manier. Een of meerdere van deze methoden die in combinatie worden gebruikt, bestrijken een breed scala aan afbeeldingen van de cellen. Probeer daarom verschillende benaderingen om erachter te komen welke combinatie het beste werkt voor hun gegevens.
      4. Pas de 'Domain connection factor' en 'Smear factor' aan om optimale segmentatie te verkrijgen.
         OPMERKING: De 'Uitstrijkfactor' maakt de gebieden die cellen bevatten groter.
      5. Geef aan of de cellen zwart of wit worden weergegeven in de binaire afbeelding.
      6. Kies in het venster Routebeschrijving om de grensafbeelding op te schonen of u de afbeelding automatisch of handmatig wilt opschonen.
         OPMERKING: Ongewenste kenmerken van de afbeeldingen zijn zwarte vlekken op de pixels bezet door cellen en witte vlekken op de pixels die zijn losgekoppeld van het te analyseren celcluster. Analyse kan alleen worden gedaan op de regio's die zijn aangesloten. Dus meerdere losgekoppelde regio's moeten afzonderlijk worden geanalyseerd.
   2. Deel 2: Segmentatie van de individuele cellen in de afbeeldingen
      OPMERKING: Handmatige invoer voor deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap en het reageren op de segmentatieprompts om individuele cellen in de afbeelding te detecteren. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn 'p*/phs/*.tif' en 'p*/phs/bwImages/*.tif'. Belangrijke nieuwe geproduceerde bestanden zijn onder meer 'p*/phs/textResults/*.csv', die cellulaire morfologische eigenschappen bevatten. Zie figuur 10 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen om individuele cellen van de monolaag te segmenteren.
      1. Start de Fiji-software en selecteer segmentatie - afzonderlijke cellen in het vervolgkeuzemenu MSM.
      2. Selecteer in het dialoogvenster van de bestandsbrowser de positiemap 'analyse/p0', 'analyse/p1', enz., die eigenschappen bevat die zijn gekwantificeerd op regelmatig verdeelde rasterpunten.
      3. Geef in het venster Kies de invoerparameters de maximale beeldverhouding, de prominentie van hoeveel het celcentrum opvalt ten opzichte van de celgrens en twee vervagende parameters om de detectie van de cellen te begeleiden (aanvullende figuur S10).
      4. Teken op de afbeeldingsstapel voor elke positie een veelhoek op de kleinste normale cel. Dit wordt gebruikt om het gebied te berekenen. Alles wat kleiner is dan dit, wordt door de software niet als een cel beschouwd.
      5. Teken vervolgens een veelhoek rond de grootste normale cel en geef aan of het celcentrum of de cel-celinterface helderder is.
         OPMERKING: AnViM maakt vervolgens bestanden 'phs/textResults/0001.csv', 'phs/textResults/0002.csv' , enz., Voor elk frame met informatie over cellen binnen dat frame. In dit stadium bevat dit bestand morfologische informatie over de cellen, waaronder gebied, centroïde, omtrek, oriëntatie, circulariteit, beeldverhouding, afgerondheid, soliditeit, afstand tot het niet-celgebied. De lengte-eenheid in deze eigenschappen is pixels en de hoek is in graden. Ten slotte wordt dit bestand bijgewerkt om cellulaire pixelintensiteit, beweging en krachten in de volgende stappen te bevatten.
   3. Deel 3: In kaart brengen van de pixelintensiteiten op de cellen
      OPMERKING: Handmatige invoer in deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap en het selecteren van toewijzingseigenschappen en parameters. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn 'p*/phs/*.tif' (of 'p*/fluo/*.tif ') en 'p*/phs/bwImages/*.tif'. Belangrijke nieuwe bestanden die in deze stap worden geproduceerd, zijn 'p*/phs/textResults/*.csv', waarin cellulaire morfologische eigenschappen worden vermeld. Zie figuur 11 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen om de pixelintensiteiten in het gebied van individuele cellen en hun aangrenzende gebied te beoordelen en te definiëren als eigenschappen van de cellen.
      1. Start de Fiji-software en selecteer in het vervolgkeuzemenu MSM de optie Kaart op cellen - Intensiteiten.
      2. Selecteer in het dialoogvenster van de bestandsbrowser de positiemap 'analyse/p0', 'analyse/p1', enz., die eigenschappen bevat die zijn gekwantificeerd op regelmatig verdeelde rasterpunten.
      3. Selecteer Celdeling detecteren of Cellulaire fluorescentie kwantificeren wanneer de software daarom vraagt. Definieer de grootte van de aangrenzende regio. Schakel de selectievakjes Eigenschappen van het aangrenzende gebied verzamelen en Eigenschappen van cellen verzamelen in. Klik op OK.
      4. Geef in het venster Doel van het opnemen van de cellulaire intensiteit aan welk type afbeelding moet worden gebruikt voor intensiteitstoewijzing, de grootte van het aangrenzende gebied en of er gegevens worden verzameld voor individuele cellen of beide cellen en hun aangrenzende regio's (aanvullende figuur S11).
         OPMERKING: Het in kaart brengen van de pixelintensiteiten van een fasecontrastbeeld maakt het mogelijk om celdelingsgebeurtenissen te detecteren. Het in kaart brengen van fluorescerende beeldintensiteiten zal het mogelijk maken om fluctuaties in de fluorescerend gelabelde cytoplasmatische moleculen te detecteren. De uitvoer van de bovenstaande stappen is de gemiddelde, mediane, standaarddeviatie, minimale en maximale pixelintensiteitswaarden voor individuele cellen. Deze nummers worden als nieuwe kolommen ingevoerd in de bestanden "phs/textResults/0001.csv", "phs/textResults/0002.csv" , enz.
   4. Deel 4: In kaart brengen van de krachten en beweging op de cellen
      OPMERKING: Handmatige invoer voor deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap en het selecteren van toewijzingseigenschappen en parameters. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn 'p*/phs/textResults/*.csv', 'p*/velocity/*_vel.dat', 'p*/displacement/*_disp.dat', 'p*/traction/*_trac.dat', 'p*/prestress/*_prestress.dat' en 'p*/phs/bwImages/*.tif '. Tijdens deze stap worden geen nieuwe bestanden gemaakt. In plaats daarvan wordt de nieuwe informatie (cellulaire kracht en bewegingseigenschappen) toegevoegd aan de bestanden 'p*/phs/textResults/*.csv '. Zie figuur 12 voor de visuele beschrijving van de stappen om de krachten en beweging in het gebied van individuele cellen en hun aangrenzende gebied te beoordelen en te definiëren als eigenschappen van de cellen.
      1. Kies uit het MSM-vervolgkeuzemenu Kaart op cellen - Bewegings-/krachtgegevens (aanvullende figuur S12).
      2. Volg vervolgens de stappen in stap 2.4.3.
         OPMERKING: Nieuwe kolommen worden toegevoegd aan de bestanden 'phs/textResults/0001.csv', 'phs/textResults/0002.csv', enz. en omvatten de gemiddelde, mediane en standaardafwijking van snelheid, de oriëntatie van snelheid, gemiddelde cytoskeletspanning, spanningsanisotropie, spanningsenergie in de hydrogel, de oriëntatie van de hoogste spanning en de grootte van cel-ECM-tractie (aanvullende figuur S13).
5. Visualisatie van resultaten
   1. Deel 1: Het volgen van de cellulaire identiteiten in het experiment
      OPMERKING: Handmatige invoer voor deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap en het selecteren van toegewezen eigenschappen om te visualiseren. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn 'p*/phs/textResults/*.csv'. Belangrijke nieuwe bestanden die tijdens deze stap worden geproduceerd, zijn onder meer 'p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv', dat een tijdsspoor van de mobiele data bevat. Zie figuur 13 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen om de eigenschappen van individuele cellen gedurende de gehele duur van het experiment te volgen.
      1. Start de Fiji-software en selecteer in het vervolgkeuzemenu MSM de optie Resultaten - Gegevens bijhouden.
      2. Selecteer in het dialoogvenster van de bestandsbrowser de positiemap 'analyse/p0', 'analyse/p1', enz., met cellulaire eigenschappen die moeten worden bijgehouden. Als u klaar bent, klikt u op Selecteren.
      3. Kies in het venster Startpunt kiezen voor traceren het startframe voor bewaking en het aantal frames dat tegelijkertijd wordt bijgehouden (aanvullende afbeelding S14). Begin altijd vanaf framenummer 2, omdat de snelheid niet kan worden bepaald voor framenummer 1. Als u klaar bent, klikt u op OK.
      4. Kies in het venster De variabelen controleren om tracks te maken door de namen van de variabelen te typen of door de termen in de selectievakjes te selecteren (Aanvullende afbeelding S15). Klik vervolgens op OK.
         OPMERKING: Tracking genereert 'phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv'-bestanden waarbij elke kolom een uniek celnummer bevat en elke opeenvolgende rij de opeenvolgende tijdinstantie vertegenwoordigt.
   2. Deel 2: Generatie van tijdsporen van de beoordeelde cellulaire eigenschappen
      OPMERKING: Handmatige invoer voor deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap en het selecteren van toegewezen eigenschappen om te visualiseren. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn 'p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv'. Belangrijke nieuwe bestanden die tijdens deze stap worden geproduceerd, zijn 'p*/phs/trackedDataPlots/*.tif', die tijdspoorplots bevatten en 'p*/phs/trackedDataPlots/*.csv', die plotgegevens bevatten. Zie figuur 14 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen om tijdsporen van de beoordeelde cellulaire eigenschappen te genereren.
      1. Start de Fiji-software en selecteer in het vervolgkeuzemenu MSM de optie Resultaten - plot.
      2. Selecteer in het dialoogvenster van de bestandsbrowser de positiemap 'analyse/p0', 'analyse/p1', enz., met bijgehouden cellulaire eigenschappen die moeten worden uitgezet.
      3. Kies of u het plotten wilt beperken tot cellen met ononderbroken tracks door op de knop Ja of Nee te klikken.
         OPMERKING: Met deze optie worden de cellen genegeerd, die in een of meer tijdsgevallen niet konden worden gedetecteerd.
      4. Kies het aantal variabelen dat tegelijkertijd moet worden uitgezet en klik op OK.
         OPMERKING: Momenteel staat AnViM toe dat maximaal drie variabelen in dezelfde plot worden weergegeven.
      5. Kies afzonderlijke variabelen voor het plotten met behulp van een vervolgkeuzemenu.
         OPMERKING: Met deze stappen maakt u een TIFF-bestand (Tagged Image File Format) en een door komma's gescheiden gegevensbestand in de map 'phs/trackedDataPlots/'. De bestandsnaam bestaat uit variabelenamen gescheiden door een onderstrepingsteken en eindigt met een celnummer.
   3. Deel 3: Genereren van heatmaps van de beoordeelde cellulaire eigenschappen
      OPMERKING: Handmatige invoer in deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap en het selecteren van toegewezen eigenschappen om te visualiseren. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn 'p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv'. Belangrijke nieuwe bestanden die in deze stap worden gegenereerd, zijn 'p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif', de heatmaps van cellulaire eigenschappen. Zie figuur 15 voor de visuele beschrijving van de stappen om heatmaps van de beoordeelde cellulaire eigenschappen te genereren.
      1. Kies uit het msm-vervolgkeuzemenu Resultaten - Afbeelding.
      2. Volg de stappen die worden beschreven in stap 2.5.2.
         OPMERKING: De uitvoer wordt opgeslagen als TIFF-bestand bestanden in de map 'phs/segmentedImages/cellPropMaps/'. De bestandsnamen zijn het tijdinstantienummer en de naam van de variabele, gescheiden door een onderstrepingsteken.

Resultaten

We presenteren hier twee van de belangrijkste outputs voor het gedemonstreerde voorbeeld. De eerste output is het tijdsspoor van cellulaire snelheid en cytoskeletspanning voor cel nummer 1 (figuur 16). De eigenschappen worden weergegeven op een gedeelde verticale as om de visuele koppeling tussen de eigenschappen te vergemakkelijken, en de horizontale as geeft het tijdinstantienummer aan. In dit experiment werden opeenvolgende frames verkregen met een interval van 15 minuten. De tweede output is een reeks heatmaps 1 uur in het experiment (figuur 17). De hier getoonde eigenschappen omvatten verspreidingsgebied, oriëntatie, circulariteit, snelheid, bewegingsrichting, maximale spanningsoriëntatie, cytoskeletale spanning, substraattractie en spanningsanisotropie van individuele cellen.

Figuur 1: Structuur van integratieve toolkit om cellulaire signalen te analyseren (iTACS). Twee belangrijke componenten van iTACS zijn Acquisition and Training Module (AcTrM) en Analysis and Visualization Module (AnViM). AcTrM kan verschillende hydrogelpreparaattechnieken gebruiken die momenteel bestaan voor het bereiden van hydrogels die stevig op een microscoopstadium kunnen worden gehouden, elke celzaaiing en een groeiprotocol dat cellen in één focusvlak behoudt. AnViM kan verschillende technieken gebruiken om de hydrogel- en monolaagvervorming, cel-ECM-krachten en cel-celkrachten te kwantificeren. Al deze door de gebruiker gewenste componenten van het krachtmetingsprotocol kunnen worden ondergebracht in iTACS en ze zijn geïdentificeerd met onderbroken dozen. De componenten geïdentificeerd met massieve dozen zijn nieuwe bijdragen aan cellulaire krachtmetingstechnologie. Visualisatie in het AnViM richt zich op de mediane waarde en variabiliteit van de eigenschappen over individuele cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Referentiebeeldverwerving - deel 1. Stappen voor het maken van een positielijst met AcTrM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Referentiebeeldverwerving - deel 2. Stappen voor het verkrijgen van referentiebeelden met AcTrM. Gedetailleerde weergaven van stap 2, 4 en 6 worden weergegeven in respectievelijk aanvullende figuren S2, S3 en S4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Geautomatiseerde beeldacquisitie voor het resterende experiment. Stappen voor het hervatten van beeldacquisitie om cellulair gedrag te beoordelen met behulp van AcTrM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Het opzetten van geautomatiseerde data-analyse. Stappen om te beginnen met geautomatiseerde beeldanalyse met behulp van AnViM. De software herkent het beeldformaat dat door AcTrM wordt gebruikt. Een gedetailleerd overzicht van de panelen in stap 3 en 5 wordt weergegeven in respectievelijk aanvullende figuur S5 en aanvullende figuur S6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Kwantificering van vervorming van hydrogel en monolaag - deel 1. Stappen om, via AnViM, de Particle Image Velocimetry-implementatie van Tseng, Q. et al., PNAS (2012)²⁰ in te schakelen om vervorming van het bovenoppervlak van de hydrogel te kwantificeren. Gebruikers kunnen binnen AnViM ook andere benaderingen implementeren om hydrogelvervorming te kwantificeren. Een gedetailleerd overzicht van stap 3 is weergegeven in aanvullende figuur S7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Kwantificering van vervorming van hydrogel en monolaag - deel 2. Stappen om, via AnViM, de Particle Image Velocimetry implementatie van Tseng, Q. et al., PNAS (2012)²⁰ in te schakelen om de lokale beweging van individuele cellen te kwantificeren. Gebruikers kunnen binnen AnViM ook andere benaderingen implementeren om cellulaire beweging te kwantificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Kwantificering van cel-ECM en cel-celkrachten. Stappen om beeldanalyse uit te voeren om, via AnViM, de Fourier Transform Traction Microscopy-implementatie van Trepat et al., Nature Physics (2009)¹⁵ in te schakelen om krachten te kwantificeren die door de cellen op de hydrogel worden uitgeoefend, en de Monolayer Stress Microscopy-implementatie van Tambe et al., Nature Materials (2011)¹ om krachten in individuele cellen en tussen naburige cellen te kwantificeren. Gebruikers kunnen binnen AnViM ook andere benaderingen implementeren om cel-ECM en cel-celkrachten te kwantificeren. Een gedetailleerd overzicht van stap 6 wordt weergegeven in aanvullende figuur S8 en aanvullende figuur S9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Rasterpuntwaarden toewijzen op individuele cellen - deel 1. Stappen om de afbeeldingsgebieden die cellen bevatten te segmenteren met behulp van een nieuwe, veelzijdige benadering. Deze benadering kan worden gebruikt om fasecontrast-, brightfield- of fluorescentiebeelden van de cellen te segmenteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Rasterpuntwaarden toewijzen op individuele cellen - deel 2. Stappen om individuele cellen van een monolaag te segmenteren met behulp van een nieuwe multi-pronged benadering ontwikkeld in AnViM. Deze benadering kan worden gebruikt om fasecontrast-, brightfield- of fluorescentiebeelden van de cellen te segmenteren. Een gedetailleerd overzicht van stap 2 is weergegeven in aanvullende figuur S10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11: Rasterpuntwaarden toewijzen op afzonderlijke cellen - deel 3. Stappen om pixelintensiteiten in het gebied binnen individuele cellen en binnen het aangrenzende gebied van individuele cellen te beoordelen met behulp van AnViM. De beoordeelde intensiteiten omvatten de intensiteit van het doorgelaten licht en de fluorescentie-intensiteit. Dit deel brengt de mediaanwaarde en standaarddeviatie van de pixelintensiteiten binnen individuele cellen en binnen een aangrenzend gebied van individuele cellen in kaart. Een gedetailleerd overzicht van stap 2 is weergegeven in aanvullende figuur S11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 12: Rasterpuntwaarden toewijzen op afzonderlijke cellen - deel 4. Stappen om de krachten en bewegingseigenschappen van de rasterpunten binnen individuele cellen en binnen het aangrenzende gebied van individuele cellen te beoordelen met behulp van AnViM. Dit deel brengt de mediane waarde en standaarddeviatie van de eigenschappen binnen individuele cellen en binnen een naburig gebied van individuele cellen in kaart. Een gedetailleerd overzicht van stap 2 en 3 is weergegeven in aanvullende figuur S12 en aanvullende figuur S13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 13: Visualisatie van resultaten - deel 1. Stappen om eigenschappen van individuele cellen bij te houden gedurende de gehele duur van het experiment met AnViM. Een gedetailleerd overzicht van stap 2 en 3 is weergegeven in aanvullende figuur S14 en aanvullende figuur S15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 14: Visualisatie van resultaten - deel 2. Stappen om tijdsporen van de beoordeelde eigenschappen te genereren met behulp van AnViM. De gebruiker heeft de mogelijkheid om maximaal drie eigenschappen in één grafiek uit te zetten. Tijdsporen worden gegenereerd voor alle cellen of alleen voor die cellen waarvoor tracking succesvol was gedurende het hele experiment. Een gedetailleerd overzicht van stap 5 wordt weergegeven in aanvullende figuur S16 en aanvullende figuur S17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 15: Visualisatie van resultaten - deel 3. Stappen om heatmaps van de beoordeelde eigenschappen te genereren met behulp van AnViM. Heatmaps worden gegenereerd voor alle frames na het beginframe en alle geselecteerde eigenschappen. Een gedetailleerd overzicht van stap 3 wordt weergegeven in aanvullende figuur S18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 16: Tijdsporen voor cel-ID 1. Twee weergegeven eigenschappen zijn de cellulaire cytoskeletspanning ("avgtenMedian") en cellulaire snelheid ("speedMedian"). Zowel cellulaire cytoskeletspanning als cellulaire snelheid worden gekwantificeerd als de mediane waarde over de rasterpunten in de cellen. De twee eigenschappen worden op dezelfde as uitgezet met willekeurige eenheden om relaties tussen de beoordeelde eigenschappen te visualiseren. Aanvullende namen van variabelen zijn opgenomen in aanvullende tabel S1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 17: Heatmaps van de eigenschappen van individuele cellen over de geanalyseerde monolaag. Elke cel wordt gekleurd met de mediaanwaarde van de eigenschap die in het deelvenster wordt aangegeven. Zo geeft dieprood de maximale cellulaire waarde in het kleurenspectrum aan en diepblauw de minimale cellulaire waarde over de geanalyseerde monolaag. Zoals beschreven in Tambe et al., PLoS One (2013)², hebben de cellen die zich dichter bij de grens bevinden mechanische krachten die worden beïnvloed door onbekende eigenschappen van de cellen buiten het beeld. Vandaar dat de heatmap wordt gegenereerd voor cellen ver van de grens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur S1: Voorbeeldafbeeldingen van de bovenste en onderste fluorescerende kraal. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S2: Een gedetailleerd overzicht van stap 2 uit figuur 3. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S3: Een gedetailleerd overzicht van stap 4 uit figuur 3. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S4 A: gedetailleerd overzicht van stap 6 uit figuur 3. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S5: Een gedetailleerd overzicht van stap 3 uit figuur 5. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S6: Een gedetailleerd overzicht van stap 5 uit figuur 5. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S7: Een gedetailleerd overzicht van stap 3 uit figuur 6. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S8: Een gedetailleerd overzicht van de cel-ECM-krachtoutput van stap 6 uit figuur 8. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S9: Een gedetailleerd overzicht van de cel-celkrachtoutput van stap 6 uit figuur 8. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S10: Een gedetailleerd overzicht van stap 2 uit figuur 10. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S11: Een gedetailleerd overzicht van stap 2 uit figuur 11. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S12: Een gedetailleerd overzicht van stap 2 uit figuur 12. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S13: Een gedetailleerd overzicht van de uitvoer van stap 3 uit figuur 12. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S14: Een gedetailleerd overzicht van stap 2 in figuur 13. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S15: Een gedetailleerd overzicht van stap 3 uit figuur 13. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S16: Een gedetailleerde weergave van gegevensbestanden gegenereerd in stap 5 uit figuur 14. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S17: Een gedetailleerd overzicht van een plot gegenereerd in stap 5 uit figuur 14. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S18: Een gedetailleerde weergave van een heatmap en het bestand met het bereik van het kleurenspectrum gegenereerd in stap 4 uit figuur 15. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Tabel S1: Een lijst met geselecteerde eigenschappen gekwantificeerd door iTACS. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Aanhangende cellen gebruiken zowel mechanische als chemische signalen om te overleven, te groeien en te functioneren. Een breed scala aan microscopiesoftware optimaliseert de gebruikerservaring bij het beoordelen van de chemische signalen door middel van fluorescentiegebaseerde beeldvorming. Bij de beoordeling van de mechanische signalen zijn echter mogelijkheden betrokken die niet beschikbaar zijn in de standaard microscopiesoftware. Bovendien is de beoordeling van mechanische signalen het meest efficiënt wanneer data-acquisitie wordt geïntegreerd met data-analyse. Het ontbreken van een uniform platform dat voldoet aan de unieke behoeften van mechanische signaalbeoordeling is een belangrijke technologische leemte in de experimentele celbiologie. De Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) is ontworpen om deze kloof te dichten. De twee componenten van iTACS, AnViM en AcTrM, voorzien gebruikers van de nodige mogelijkheden om cellulaire eigenschappen van vier brede categorieën te kwantificeren: krachten, beweging, morfologie en fluorescentie / helderheid. In deze categorieën is iTACS momenteel in staat om meer dan 50 unieke aspecten van individuele adherente cellen te onthullen. Deze aspecten omvatten specifieke eigenschappen van elke brede categorie, inclusief hun representatieve waarde en variabiliteit in de cel (aanvullende tabel S1). Binnen de krachten zijn er bijvoorbeeld trekkrachten over het cytoskelet, anisotropie van deze spanning, de oriëntatie van maximale spanning en schuifspanning over de cel-ECM-interface die een diepgaande invloed heeft op het gedrag van aanhangende ^cellen1,3,6.

Een nieuwe benadering om het mechanische gedrag van individuele cellen van een monolaag te onderzoeken
Individuele cellen van een monolaag zijn bezig met een uitwisseling van signalen van chemische en mechanische ^aard3. Deze twee soorten signalen worden op een andere manier over de cellulaire monolaag ^verzonden23. De kennis van mechanische signaaloverdracht blijft echter achter bij die van chemische signaaloverdracht. Deze kenniskloof valt samen met een aanhoudend gebrek aan eenvoudige en intuïtieve benaderingen om cellulaire mechanische signalen te beoordelen. De nieuwe data mapping-aanpak die hier wordt beschreven, is uitgerust om deze leemte op te vullen. Een dergelijke mapping onthult dat fluctuatie van intrinsieke cytoskeletale spanning in het naburige gebied van een cel dient als ontspannings-, fluidisatie- en verankeringssignalen die veranderingen in cellulaire vorm, grootte en snelheid van de cel ^reguleren18. Kaarten van de eigenschappen van aangrenzende regio's vertonen "meercellige onderverdelingspatronen" waarbij cellen binnen de onderverdeling worden blootgesteld aan een relatief uniforme micro-omgeving en de cellen aan de grens van de onderverdeling worden blootgesteld aan een opmerkelijk niet-uniforme ^{micro-omgeving18}.

Toegankelijkheid van de krachtmeettechnologie
Er bestaat een verscheidenheid aan protocollen om PAA-hydrogels te maken, hydrogelvervorming en cellulaire beweging te analyseren en cel-ECM en celcelkrachten1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27 te kwantificeren ^,28,29,30,31,32. Deze ontwikkelingen blijven echter buiten het bereik van gemeenschappelijke celbiologische laboratoria en beperkt tot laboratoria met technische expertise. Door de technische aspecten van deze benaderingen te automatiseren en te integreren onder een uniform en gebruiksvriendelijk platform, is het doel van iTACS om de beoordeling van mechanische signalen een routineactiviteit te maken in experimenteel celbiologisch onderzoek en onderwijs.

ImageJ stelt gebruikers in staat om applicaties te ontwikkelen met behulp van benaderingen die weinig of geen training ^vereisen11. iTACS is grotendeels gebouwd met behulp van eenvoudige scripting-benaderingen om community-driven voortdurende ontwikkeling te vergemakkelijken. Een groot deel van AcTrM wordt geprogrammeerd met behulp van BeanShell-scripts en het grootste deel van AnViM wordt geprogrammeerd met ImageJ Macros. Deze scripts en richtlijnen voor het implementeren van deze mogelijkheden op de microscoop van de gebruiker zijn beschikbaar via GitHub (https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS).

Kwaliteitsstandaardisatie van de verkregen beelden
Hoewel de op elastisch substraat gebaseerde technieken om fysieke krachten in aanhangende cellen te kwantificeren in verschillende laboratoria zijn ontwikkeld en geïmplementeerd, mist het protocol nog steeds standaardisatie. Een gebied dat het meest moet worden gestandaardiseerd, is de kwaliteit van de verkregen afbeeldingen van de bovenste kralen (aanvullende figuur S1). Belangrijke problemen komen voort uit de verschuiving in focus gedurende het experiment. Onze nieuwe op referentiebeelden gebaseerde heroriëntatiebenadering maakt zo'n focus een objectief proces. De parameters die in de allereerste stap van AcTrM zijn gedefinieerd, leggen de nodige objectieve kwaliteitslimieten op. Andere standaardisatiemaatregelen kunnen worden geprogrammeerd in toekomstige versies van AcTrM.

De brede toepasbaarheid van iTACS
Naast het kwantificeren van tal van aspecten van adherente cellen, vergemakkelijkt de iTACS-structuur het gebruik ervan voor verschillende experimentele protocollen en behoeften. AcTrM maakt softwaregestuurde zelftraining van gebruikers mogelijk. Snelle beeldvorming die vereist is door bijvoorbeeld gelijktijdige beoordeling van cytoplasmatische calciumfluctuaties wordt momenteel beperkt door de snelheid van herpositionering en heroriëntatie van hardware en kan het beste op één locatie tegelijk worden uitgevoerd. De huidige implementatie is echter goed uitgerust voor langetermijnbeeldvorming, onderbroken beeldvorming, waarbij het monster gedurende de gehele duur van het experiment niet op het microscoopstadium kan worden gehouden. Omdat de referentiebeelden aan het begin van het experiment worden verkregen, maakt iTACS real-time beeldvorming van mechanische signalen mogelijk, waardoor nieuwe wegen worden geopend in toepassingen voor geneesmiddelenscreening. AnViM stelt gebruikers in staat om zeer technische informatie te verstrekken in lekentermen. Het vermogen om een breed spectrum van cellulaire eigenschappen te kwantificeren en ze gedurende het hele experiment te volgen, vormt kritieke mogelijkheden die nodig zijn om nieuwe intercellulaire communicatiemechanismen te ontdekken.

Voor de toekomstige ontwikkeling van iTACS hebben we vier aandachtsgebieden geïdentificeerd: (1) verbetering van de snelheid van gegevensverzameling en gegevensanalyse, (2) implementatie van benaderingen om nieuwe cellulaire signalen te ^beoordelen13, (3) ontwikkeling van workshops en onderwijsmodules over iTACS-gebaseerde cellulaire signaalbeoordeling, (4) ontwikkeling van goedkope automatiseringsoplossingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagents en componenten gebruikt bij het voorbereiden van het glasoppervlak voor hydrogelcoating
(3-Aminopropyl)trimethoxysilaan, 97%	Aldrich chemie	13822565
2% Bis-oplossing	Bio-rad	1610142
3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylaat, 98%	Acros organics	2530850
40% Acrylamide-oplossing	Bio-rad	1610140
Glasbodem 35 mm schaal/ 6 of 12 of 24 wel platen	MatTek of CellVis
Glutaraldehyde, EM-kwaliteit, 25%	Polysciences	1909100
Natriumhydroxide	Sigma-aldrich	1002074706
Reagentia en componenten gebruikt bij het bereiden van geschikte hydrogel
2% Bis-oplossing	Bio-rad	1610142
40% Acrylamide-oplossing	Bio-rad	1610140
Ammoniumpersulfaat	Bio-rad	1610700
Dekglasjes	Electron Microscopy Sciences	7222301
Dulbecco's Fosfaat Buffered Saline (1M)	Gibco	14190136
FluoSpheres carboxylaat 0,2 um, geel-groen(505/515)	Invitrogen	F8811
FluoSpheres carboxylaat 0,5 um, rood(580/605)	Invitrogen	F8812
FluoSpheres carboxylaat 2,0 um, rood(580/605)	Invitrogen	F8826
Rain-X
TEMED	Bio-rad	1610801
Reagentia gebruikt bij het coaten van extracellulaire matrix op de hydrogel
Collageen Type I Rat Tail	Corning	354236
HEPES(1M)	Gibco	15630080
Fosfaat Buffered Saline (1M)	Gibco	10010023
Sulfo-SANPAH	CovaChem	102568434
Microscoop hardware gebruikt in het huidige onderzoek
Camera	Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera	C11440-42U
H117 ProScanTM Stages	Prior Scientific
Lichtbron- Lambda DG4 en Lambda DG5	Sutter instrument company
Microscoop	Nikon eclipse TE2000-S	550372
ProScan III Universal Microscope Automation Controller	Prior Scientific
Stagetop incubator	ibidi	11922
Stepper Motor Focus Drive	Prior Scientific