Hier presenteren we protocollen voor het detecteren van stikstofmonoxide en zijn biologisch relevante derivaten met behulp van op chemiluminescentie gebaseerde assays met een hoge gevoeligheid.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en zijn derivaten van autoxidatie en nitrosated compounds
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Stikstofmonoxide (NO) activiteit in vivo is de gecombineerde resultaten van de directe effecten, de werking van de derivaten gegenereerd door NO autoxidatie, en de effecten van nitrosated verbindingen. Het meten van NO-metabolieten is essentieel voor het bestuderen van NO-activiteit, zowel op vasculaire niveaus als in andere weefsels, vooral in de experimentele omgevingen waar exogene NO wordt toegediend. Op ozon gebaseerde chemiluminescentietests maken nauwkeurige metingen van NO- en NO-metabolieten mogelijk in zowel vloeistoffen (inclusief plasma, weefselhomogenaten, celculturen) als gasmengsels (bijv. Uitgeademde adem). NO reageert met ozon om stikstofdioxide te genereren in een aangeslagen toestand. De daaruit voortvloeiende lichtuitstraling maakt fotodetectie en het genereren van een elektrisch signaal mogelijk dat het NO-gehalte van het monster weerspiegelt. Aliquots uit hetzelfde monster kunnen worden gebruikt om specifieke NO-metabolieten te meten, zoals nitraat, nitriet, S-nitrosothiolen en ijzer-nitrosylcomplexen. Bovendien wordt NO geconsumeerd door celvrij hemoglobine ook gekwantificeerd met chemiluminescentieanalyse. Een illustratie van al deze technieken wordt gegeven.
Inleiding
Sinds Salvador Moncada en Nobelprijswinnaars Robert Furchgott, Louis Ignarro en Ferid Murad stikstofmonoxide (NO) identificeerden als de eerder bekende endotheel-afgeleide relaxatiefactor (EDRF), is de centrale rol van NO vastgesteld in verschillende belangrijke mechanismen die zich uitstrekken over vasculaire biologie, neurowetenschappen, metabolisme en gastheerrespons 1,2,3,4,5,6,7 . Exogene toediening van NO-gas is een gevestigde beha....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De procedures die in dit protocol worden aangegeven, zijn in overeenstemming met de beoordelingsraad van het Massachusetts General Hospital. De bloedmonsters die werden gebruikt, waren verzameld tijdens een eerdere studie en werden gedeïdentificeerd voor het huidige doel18.
OPMERKING: Zie de instructies van de fabrikant voor specifieke richtlijnen met betrekking tot optimale verbindingen tussen buizen en glaswerk die het spoelvat vormen, wassen en algemeen onderhoud. Verbindingen moeten stevig en zorgvuldig worden gemaakt om het glaswerk niet te beschadigen. Identificeer de componenten van het glazen spoelvat: gasinl....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De NO-consumptie door celvrije Hb-test werd gebruikt in monsters met bekende concentraties celvrij oxyHb (figuur 4). Omdat één heem oxyHb stoichiometrisch één NO-molecuul vrijgeeft in de test, wordt gezuiverde celvrije oxyHb gebruikt om de kalibratiecurve voor de test te bouwen (aanvullende figuur 3).
De dosis-responsrelatie tussen celvrij Hb (gemeten met een colorimetrische assay) en NO-consumptie bij patiënten die tijdens hartchirurgie van cardi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Vanwege de hoge gevoeligheid hebben op chemiluminescentie gebaseerde assays voor de bepaling van NO en gerelateerde verbindingen een hoog risico op NO 2-contaminatie. Elk reagens (met name de NO2-blokkerende oplossing) en verdunningsmiddel (inclusief ddH2O) dat in het experiment wordt gebruikt, moet worden getest op zijn NO 2-gehalte om te corrigeren voor achtergrondsignaal. Nitriet is extreem reactief met een halfwaardetijd in volbloed rond de .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
L.B. ontvangt salarissteun van K23 HL128882/NHLBI NIH als hoofdonderzoeker voor zijn werk aan hemolyse en stikstofmonoxide. LB ontvangt subsidies van "Fast Grants for COVID-19 research" aan het Mercatus Center van de George Mason University en van iNO Therapeutics LLC. B.Y. wordt ondersteund door subsidies van een NHLBI/#R21HL130956 en DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. ontving patenten bij MGH op de elektrische opwekking van stikstofmonoxide.
L.B. en B.Y. hebben een patentaanvraag ingediend voor NO delivery in COVID-19 disease PCT application number: PCT/US2021/036269 ingediend op 7 juni 2021. RWC ontvangt salarissteun van Unitaid als hoofdonderzoeker voor technologische ontwikkeling gericht op gedecentraliseerde diagnose van tuberculose bij kinderen in omgevingen met weinig middelen.
Dankbetuigingen
De protocollen die in dit manuscript worden gerapporteerd, werden mogelijk gemaakt door de verzamelde bijdragen van eerdere fellows van Dr. Warren Zapol's laboratorium voor anesthesieonderzoek in kritieke zorg, afdeling anesthesie in het Massachusetts General Hospital. We erkennen de bijdrage van Drs. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli en Emanuele Rezoagli.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Azijnzuur | Sigma | 45754 | 500 mL - vloeistof |
| Antifoam B Emulsie | Sigma | A5757 | 250 mL - vloeistof |
| DETA NONOate | Cayman | 82120 | 10 mg |
| Gibco DPBS (1x) zonder calcium, zonder magnesium | ThermoFisher | 14190144 | 500 mL |
| Zoutzuur 37% (1 M) | Sigma | 258148 | 500 mL - vloeistof |
| Jodium | SAFC | 207772 | 100 g - vast |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | |
| Kwik(II)chloride ACS reagens > 99,5% | Sigma | 215465 | 100 g - vast (oplossen in water) |
| Mili-Q Waterzuiveringssysteem | Millipore | ||
| Model 705 RN 50 µL spuit | Hamilton | 80530 | Microliter spuit |
| Model 802 N 25 µL spuit | Hamilton | 84854 | Microliter spuit |
| N-ethylmaleïmide | Sigma | 4260 | 25 g - kristallijn |
| Stiikstofmonoxide-analysator + bundelsoftware - uitspoelvat | Zysense | NOA 280i | Chemiluminescentie detector |
| Nonidet p-40 (NP-40) | ThermoFisher | 85125 | 10% - 500 mL |
| Kaliumhexacyanoferraat (III) ACS reagens > 99% | Sigma | 244023 | 100 g - poeder |
| Kaliumjodide ACS reagens > 99% | Sigma | 221945 | 100 g - vast |
| Kaliumnitriet kristallen. Voor analyse EMSURE ACS | Supelco | 105067 | 250 g - kristallijn |
| PowerGen 125 | Fisher Scientific | 14-359-251 | Mechaanse homogenisator |
| RV3 Tweedelige roterende schotpomp | Edwards | A65201906 | Vacuümpomp - Gebundeld met analyaor |
| Natriumheparine - BD Hemogard Clo | BD Biosciences | BD367871 | 75 USP eenheden |
| Natriumhydroxide watervrij ACS reagens > 97% | Sigma | 795429 | 1 kg - pellets |
| Natriumnitraat ACS reagens > 99% | Sigma | 221341 | 500 g - poeder |
| Natriumnitriet > 99% | Sigma | S2252 | 500 g - kristallijn |
| Sulfanilamid > 98% | Sigma | S9251 | 100 g - vast |
| Vanadium(III)chloride | Sigma | 112393 | 25 g - vast - Voorzichtig (exotherm) |
| Whatman 1 Filterpapier | Sigma | WHA10010155 |
Referenties
- Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
- Furchgott, R. F.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
