Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en zijn derivaten van autoxidatie en nitrosated compounds

4.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63107

⸱

16 februari 2022

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we protocollen voor het detecteren van stikstofmonoxide en zijn biologisch relevante derivaten met behulp van op chemiluminescentie gebaseerde assays met een hoge gevoeligheid.

Samenvatting

Stikstofmonoxide (NO) activiteit in vivo is de gecombineerde resultaten van de directe effecten, de werking van de derivaten gegenereerd door NO autoxidatie, en de effecten van nitrosated verbindingen. Het meten van NO-metabolieten is essentieel voor het bestuderen van NO-activiteit, zowel op vasculaire niveaus als in andere weefsels, vooral in de experimentele omgevingen waar exogene NO wordt toegediend. Op ozon gebaseerde chemiluminescentietests maken nauwkeurige metingen van NO- en NO-metabolieten mogelijk in zowel vloeistoffen (inclusief plasma, weefselhomogenaten, celculturen) als gasmengsels (bijv. Uitgeademde adem). NO reageert met ozon om stikstofdioxide te genereren in een aangeslagen toestand. De daaruit voortvloeiende lichtuitstraling maakt fotodetectie en het genereren van een elektrisch signaal mogelijk dat het NO-gehalte van het monster weerspiegelt. Aliquots uit hetzelfde monster kunnen worden gebruikt om specifieke NO-metabolieten te meten, zoals nitraat, nitriet, S-nitrosothiolen en ijzer-nitrosylcomplexen. Bovendien wordt NO geconsumeerd door celvrij hemoglobine ook gekwantificeerd met chemiluminescentieanalyse. Een illustratie van al deze technieken wordt gegeven.

Inleiding

Sinds Salvador Moncada en Nobelprijswinnaars Robert Furchgott, Louis Ignarro en Ferid Murad stikstofmonoxide (NO) identificeerden als de eerder bekende endotheel-afgeleide relaxatiefactor (EDRF), is de centrale rol van NO vastgesteld in verschillende belangrijke mechanismen die zich uitstrekken over vasculaire biologie, neurowetenschappen, metabolisme en gastheerrespons 1,2,3,4,5,6,7 . Exogene toediening van NO-gas is een gevestigde behandeling geworden voor respiratoire insufficiëntie als gevolg van pulmonale hypertensie bij de pasgeborene8. Stikstofmonoxidegas is ook onderzocht voor de behandeling van respiratoir syncytieel virus (RSV) infectie, malaria en andere infectieuze ziekten, ischemie-reperfusieletsel en voor de preventie van acuut nierletsel bij patiënten die hartchirurgie ondergaan 9,10,11,12. De behoefte aan nauwkeurige meettechnieken om de niveaus van NO, de metabolieten en die van de doeleiwitten en -verbindingen te beoordelen, komt voort uit zowel mechanistische als interventionele studies.

Vanwege de hoge reactiviteit kan NO verschillende reacties ondergaan, afhankelijk van de biologische matrix waarin het wordt geproduceerd en / of vrijgegeven. Bij afwezigheid van hemoglobine (Hb) of andere oxy-hemoproteïnen wordt NO bijna volledig geoxideerd tot nitriet (NO2-).

2NO + O2 → 2NO2

NO2 + NO → N2O3

N2O3 + H2O → NO2- + H+

NO ondergaat eerst autoxidatie met moleculaire zuurstof (O2) om stikstofdioxide (NO2) te verkrijgen en reageert met NO2 zelf om dinitrogentrioxide te genereren (N2O3). Eén molecuul van N2O3 reageert met water (H2O) om twee moleculen van NO2- en een proton (H+)13 te vormen. In volbloed worden14,15, NO en NO2- snel omgezet in nitraat (NO3-) omdat deze moleculen gretig reageren met de geoxideerde heemgroepen van Hb [Hb-Fe2+-O2 of oxyhemoglobine (oxyHb)] tot NO3-. Deze reactie gaat gepaard met de overgang van de heemgroep naar de ijzertoestand [Hb-Fe3+ of methemoglobine (metHb)]:

Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-

De barrière van de rode bloedcel (RBC) en de ruimte direct grenzend aan het endotheel zijn de belangrijkste factoren die deze reactie beperken en waardoor een klein deel van het NO dat door het endotheel vrijkomt, kan fungeren als EDRF16,17. In feite is bekend dat celvrij Hb in de bloedsomloop de vaatverwijding in experimentele en klinische omgevingen verstoort17,18. Binnen de RBC reageert, afhankelijk van oxygenatie en NO 2-concentratie, een deel van NO met deoxyhemoglobine (Hb-Fe2+) om ijzer-nitrosyl Hb (Hb-Fe2+-NO of HbNO) te vormen:

Hb-Fe2+ + NO → Hb-Fe2+-NO

In de RBC15,17 kan NO2- Hb-Fe3+ vormen door Hb-Fe2+ te verlagen wat leidt tot het vrijkomen van NO, wat op zijn beurt Hb-Fe2+-O 2 (bij voorkeur) of Hb-Fe2+ bindt.

De generatie van NO-derivaten moet niet strikt unidirectioneel worden beschouwd, aangezien NO kan worden geregenereerd uit NO2- en NO3- in verschillende weefsels en door verschillende enzymen (bijvoorbeeld door darmbacteriën of in mitochondriën, met name onder hypoxische omstandigheden)19,20.

Een variabele hoeveelheid geproduceerd (of toegediend) NO leidt tot de stroomafwaartse generatie van S-nitrosothiolen, voornamelijk door thioltransnitrosatie van N2O3 in aanwezigheid van een nucleofiel die een NO+ donortussenproduct creëert (Nuc-NO+-NO2-):

N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-

Een andere mogelijkheid voor het genereren van S-nitrosothiolen is nitrosylering van geoxideerde thiolen (NO reageren met een geoxideerd thiol):

RS• + NO → RS-NO

Dit mechanisme en de directe thioloxidatie met NO2 zouden alleen mogelijk kunnen zijn in zeer specifieke omstandigheden die elders worden beschreven21. S-nitrosothiolen variëren van lichte moleculen zoals S-nitrosoglutathione tot grote thiolbevattende eiwitten. S-nitrosohemoglobine (S-NO-Hb) wordt gevormd door nitrosatie van een thiolgroep van een geconserveerd cysteïneresidu in de β-keten (β93C)22.

De generatie en het metabolisme van S-nitrosothiolen maken deel uit van belangrijke regulerende mechanismen. Voorbeelden hiervan zijn regulatie van glutathion, caspasen, N-methyl-D-Aspartaat (NMDA) en ryanodinereceptoren 23,24,25,26,27,28. Eerder beschouwd als een belangrijke mediator van NO-biologie in vivo, lijkt nitrosated albumine (S-nitroso-albumine) een NO / NO + transporter te zijn zonder enige specifieke extra biologische activiteit29.

Bij het meten van de concentratie van NO en zijn derivaten van een specifiek biologisch monster binnen een biologische matrix, is het belangrijk om rekening te houden met kenmerken zoals zuurgraad, oxygenatie, temperatuur en de aanwezigheid van reagentia. Voorbeelden hiervan zijn toegediende exogene NO-donoren en, in de setting van acute ontsteking, waterstofperoxide (H2O2) dat reageert met NO2 , wat leidt tot het genereren van supernormale concentratie van vrije radicalen zoals peroxynitriet (ONOO-)21. Naast de analysemethode die wordt gebruikt, is de preanalytische fase van monstervoorbereiding en -opslag van fundamenteel belang. Stroomafwaartse reacties die niet de in vivo NO-activiteit vertegenwoordigen, moeten worden voorspeld, overwogen en geblokkeerd. Een geldig voorbeeld is de instabiliteit van S-NO-Hb, die een speciale behandeling van bloedmonsters vereist wanneer deze is gericht op meting22.

Chemiluminescentie-gebaseerde assays zijn de gouden standaard voor het detecteren van de niveaus van NO en zijn belangrijkste metabolieten [NO2-, NO3-, S-NO en ijzer-nitrosylcomplexen (Fe-NO)] in elke biologische vloeistof, inclusief weefselhomogenaten30,31. Deze methoden zijn gebaseerd op de chemiluminescentiedetector (CLD), een apparaat dat de reactie van NO met ozon (O3) herbergt en NO2 genereert in een aangeslagen toestand (NO2•). Relaxatie van NO2• veroorzaakt emissie van een foton van licht dat wordt gedetecteerd door een fotomultiplicatorbuis, waardoor een elektrisch signaal wordt gegenereerd dat recht evenredig is met het NO-gehalte van het bemonsterde gasmengsel32. Een vereenvoudigd schema van de CLD wordt weergegeven.

figure-introduction-1
Figuur 1: Vereenvoudigd schema van een chemiluminescentiedetector voor stikstofmonoxidegas. Chemiluminescentie-gebaseerde detectie van stikstofmonoxide (NO) is de stoichiometrische generatie van één foton per NO-gasmolecuul die wordt geïntroduceerd in de chemiluminescentiedetector (CLD). De chemiluminescentiereactie wordt verkregen in een aangewezen kamer die wordt geleverd met ozon (O3) van een interne generator, die op negatieve druk wordt gehouden door verbinding met een externe pomp, waardoor een continue en constante instroom van monstergas mogelijk is. De generatie van O3 vereist diatomische zuurstof (O2) die wordt geleverd door een speciale O2-tank die is aangesloten op de CLD (andere fabrikanten leveren CLD's die werken met omgevingslucht). In de reactiekamer reageert elk molecuul NO-gas in het bemonsterde gas met zuurstof om één molecuul stikstofdioxide in de geactiveerde toestand (NO2*) op te leveren. Door terug te keren naar zijn grondtoestand zendt elk NO2*-molecuul één foton uit dat wordt gedetecteerd door een fotomultiplicatorbuis (PMT) die zich naast de reactiekamer bevindt. De PMT met de bijbehorende versterker en centrale verwerkingseenheid produceert een signaal dat evenredig is met het aantal fotonen en het aantal NO-moleculen in de reactiekamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De monsterinlaat van de CLD kan worden aangesloten op een glaswerksysteem met een reactiekamer voor vloeistofmonsters. Het systeem wordt continu gezuiverd met een inert gas zoals stikstof, helium of argon, waardoor NO van de reactiekamer naar de CLD wordt overgebracht. Vloeistoffasemonsters worden via een speciaal membraan in het spoelvat geïnjecteerd.

figure-introduction-2
Figuur 2: Structuur van een zuiveringsvat voor op chemiluminescentie gebaseerde detectie van stikstofmonoxidegas Het spoelvat (rechts) maakt de detectie van stikstofmonoxide (NO) gas of een andere verbinding mogelijk die gemakkelijk kan worden omgezet in NO-gas wanneer deze vrijkomt uit een vloeibaar fasereagens. De inerte gasinlaat is verbonden met een bron (tank) van een inert gas zoals Argon, Xeon of diatomische stikstof (N2). De naaldklep (opent aan de linkerkant) wordt gebruikt voor drukregeling in het spoelvat en kan volledig worden verwijderd om het vat te reinigen. De injectiepoort wordt afgedekt door een dop met een membraantussenschot voor monsterinjectie. Het membraan moet vaak worden vervangen. Een verwarmde mantel omringt de reactiekamer en is aangesloten op een warmwaterbad om de VCl3 in HCl-assay uit te voeren. De afvoer van het spoelvat is aangesloten op de chemiluminescentiedetector (CLD) of op de NaOH-val (vereist voor VCl3 in HCl-assays). Om de inhoud van de reactiekamer af te tappen, sluit u eerst de stopkranen bij de inerte gasinlaat en de afvoer van het spoelvat, sluit u de naaldklep, verwijdert u de dop bij de injectiepoort en opent u ten slotte de stopkraan bij de afvoer. De NaOH-val (links) moet in lijn tussen het spoelvat en de CLD worden geplaatst als de VCl3 in HCl-test wordt uitgevoerd vanwege de corrosie van HCl. De verbinding met de CLD vereist altijd dat een intens veld diëlektrisch (IFD) filter wordt geplaatst tussen de CLD en de uitgang van het spoelvat (of de NaOH-val, indien gebruikt). Het IFD-filter verwijdert deeltjes in de lucht en voorkomt dat vloeistof door het spoelvat gaat. PTFE = polytetrafluorethyleen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Als gevolg hiervan kan elke verbinding die door een specifieke en gecontroleerde chemische reactie in NO kan worden omgezet, met hoge gevoeligheid worden gedetecteerd in elke biologische vloeistof en weefselhomogenaat24. Directe meting van gasfase NO door chemiluminescentie wordt uitgevoerd in zowel experimentele als klinische omgevingen. Deze technieken worden elders uitgebreid beschreven 33,34,35. Meting van NO2-, S-nitrosothiolen, S-nitrosated eiwitten en Fe-NOs kan worden uitgevoerd door monsters toe te voegen in een reactiemengsel met triiodide (I3-), dat stoichiometrisch GEEN gas vrijgeeft uit al deze verbindingen:

I3- → I2 + I-

2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O

I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NO + I2

terwijl ik3- niet reageert met NO 3-15. Nauwkeurige metingen van elke verbinding worden mogelijk gemaakt door voorbehandeling van monsters met aangezuurd sulfanilamide (AS) met of zonder kwikchloride (HgCl2). In het bijzonder verwijdert de voorbehandeling met AS alle NO 2-inhoud. Als gevolg hiervan weerspiegelt het NO-gehalte gemeten door de CLD alleen de som van de concentratie van S-NOs en Fe-NOs. Injectie van HgCl2 in een monster aliquot vóór AS-injectie zorgt ervoor dat NO2- wordt vrijgegeven door S-NO. Behandeling met AS (leidend tot NO 2-verwijdering) zorgt ervoor dat het gemeten NO-gehalte alleen de concentratie van Fe-NOs weerspiegelt. Een reeks aftrekkingen tussen de beoordelingen maakt het mogelijk om de precieze concentratie van de drie NO-derivaten te berekenen22.

figure-introduction-3
Figuur 3: Stappen in monstervoorbereiding voor de I3- in azijnzuur chemiluminescentietest. De opeenvolgende stappen voor de bereiding van de I3- in azijnzuur chemiluminescentietest worden geïllustreerd. Het gebruik van lichtbeveiligde centrifugebuizen is vereist. De buizen 1, 2 en 3 worden gebruikt om de test voor te bereiden. Een ander monster aliquot (buis 4) is nodig voor de VCl3 in HCl-test als de meting van nitraat (NO3-) vereist is. Stappen worden aangegeven met cijfers in het rood. Voorvullen (stap 1) zoals aangegeven met fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) of HgCl2 voordat het monstervolume wordt toegevoegd. Voeg het monstervolume (2) toe zoals aangegeven, vortex, en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT). Voeg (3) PBS of aangezuurd sulfanilamide (AS) toe zoals aangegeven, vortex en incubeer gedurende 3 minuten bij RT. Voer de test uit (4). De concentratie gemeten met de test is de som van de concentratie van de verbindingen die onder elke buis worden gerapporteerd. Buis nummer 1 maakt metingen van nitriet (NO2-), S-nitrosothiolen (S-NO) en ijzer-nitrosylcomplexen (Fe-NOs) als één signaal mogelijk. Voor nitraatmetingen (NO3-) moeten monsters worden uitgevoerd met zowel I3- in azijnzuur als VCl3 in HCl-assays, en de waarde verkregen uit buis 1 moet worden afgetrokken van die verkregen uit buis 4. *voorgestelde hoeveelheden die moeten worden gebruikt voor Hb-analyse voor de bepaling van restnummer2-, S-nitrosohemoglobine en ijzer-nitrosyl-hemoglobine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voor NO 3-meting wordt Vanadium (III) chloride (VCl3) in zoutzuur (HCl) gebruikt voor de omzetting van NO3- in NO in het spoelvat om NO3- stoichiometrisch te meten met de CLD:

2 NO3-+ 3V+3 + 2H2O → 2NO + 3VO2+ + 4H+

Om een voldoende snelle omzetting te bereiken, moet de reactie worden uitgevoerd bij 90-95 °C. Reductie van NO3- naar NO2- gaat gepaard met reductie van NO2- naar NO door HCl. Vanadiummetaal vermindert ook S-NOs waardoor hun NO-deelwordt bevrijd 22,36. De eindconcentratie verkregen door CLD met VCl3 in HCl weerspiegelt de totale concentratie van NO3-, NO2 en andere nitrosaatverbindingen. Aftrekking van deze laatste waarde van de met CLD met I3- opgewekte concentratie maakt het mogelijk om NO3- concentratie36,37 te berekenen (figuur 3).

In de NO-consumptietest genereert de continue afgifte van NO in het spoelvat door NO-donoren zoals (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolaat (DETA-NONOaat) een stabiel signaal waardoor celvrije oxyHb in de geïnjecteerde monsters kan worden gekwantificeerd. De hoeveelheid NO die in het zuiveringsvat wordt verbruikt, staat in een stoichiometrische relatie met de hoeveelheid oxyHb in het monster38.

Protocollen voor het meten van NO2-, NO3-, S-nitrosothiolen, ijzer-nitrosylcomplexen en NO-consumptie door celvrij Hb in plasmamonsters worden geïllustreerd. Studies naar NO in de RBC-omgeving vereisen een specifieke monsterbehandeling gevolgd door exclusiechromatografie om extreem fragiele S-NO-Hb en Hb-NO te meten in combinatie met de bepaling van de totale Hb-concentratie15,22. Monstervoorbereiding is instrumenteel bij het corrigeren van metingen. Het pre-bestaan van NO2- in H2O en het vrijkomen van NO2- tijdens de test kan leiden tot meting van kunstmatig hogere concentraties NO-derivaten zoals S-NO-Hb14,39. Belangrijke aspecten van monstervoorbereiding worden ook gepresenteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De procedures die in dit protocol worden aangegeven, zijn in overeenstemming met de beoordelingsraad van het Massachusetts General Hospital. De bloedmonsters die werden gebruikt, waren verzameld tijdens een eerdere studie en werden gedeïdentificeerd voor het huidige doel18.

OPMERKING: Zie de instructies van de fabrikant voor specifieke richtlijnen met betrekking tot optimale verbindingen tussen buizen en glaswerk die het spoelvat vormen, wassen en algemeen onderhoud. Verbindingen moeten stevig en zorgvuldig worden gemaakt om het glaswerk niet te beschadigen. Identificeer de componenten van het glazen spoelvat: gasinlaatleiding, spoelvat met verwarmingsmantel en condensor, natriumhydroxide (NaOH) gasbelvanger, verbindingslijn tussen het spoelvat en de bubbler, purgevat uitlaatgasleiding (naar CLD) begiftigd met een intens veld diëlektrisch (IFD) filter. Een IFD-filterlijn tussen het spoelvat en de monsterinlaat van de CLD moet aanwezig zijn telkens wanneer GEEN metabolieten in vloeibare vorm (plasma, celculturen, weefselhomogenaten) worden gemeten (alle in het protocol gepresenteerde testen). Monstervoorbereiding hangt af van de vloeistof of het weefsel dat wordt geanalyseerd en van de verbindingen van belang. Belangrijke aspecten van de preanalytische fase worden behandeld in hoofdstuk 1 en 2. Specifieke voorbereidingsstappen voor specifieke testen zijn opgenomen in rubrieken 3-5. Secties 6-8 zijn van toepassing op alle testen.

1. Voorbereiding van specifieke reagentia

OPMERKING: Voor meer details, zie eerdere publicaties15,22.

  1. Bereid 5% (290 mM) aangezuurde sulfanilamide (AS) oplossing voor NO 2-verwijdering door 500 mg sulfanilamide op te lossen in 10 ml 1N HCl. Deze oplossing is maandenlang stabiel.
  2. Bereid 50 mM kwikchloride (HgCl2) oplossing voor NO 2-afgifte van S-NOs door 67,9 mg HgCl2 op te lossen in 5 ml PBS. Bescherm de stockoplossing tegen licht.
  3. Bereid NO2- blokkerende oplossing met 800 mM ferricyanide [K3Fe(CN)6] om Hb te oxideren samen met 100 mM N-ethylmaleimide (NEM) om thiolgroepen te blokkeren en (OPTIONEEL) 10% nonylfenyl-polyethyleenglycoloplossing (Nonidet p-40) om de membranen van de rode cel op te lossen.
    1. Voeg K3Fe(CN)6 toe aan gedeïoniseerd en gedestilleerd water (ddH2O, 263,5 g poeder per liter) om een eindconcentratie van 800 mM te verkrijgen.
    2. Voeg NEM toe aan de 800 mM K3Fe(CN)6 in ddH2O-oplossing (12,5 g poeder per liter om een concentratie van 100 mM te hebben) en meng de oplossing om alle kristallen op te lossen.
    3. Voeg een deel van 10% NP-40 toe aan negen delen van de 800 mM NEM K3Fe(CN)6 100 mM NEM-oplossing (111 ml per liter) en meng goed (verplichte stap voor volbloedanalyse).
  4. Bereid de S-NO-Hb stabilisatieoplossing met 12 mM K3Fe(CN)6, 10 mM NEM, 100 μM diethyleentriaminepenta-azijnzuur (DTPA, voor metaalchelatie) en 1% Nonidet p-40 wasmiddel uit hun stamoplossingen.
    1. Bereid een NEM-oplossing van 200 mM door NEM-kristallen toe te voegen aan PBS (25 mg /ml, bijvoorbeeld 250 mg in 10 ml PBS) en meng de oplossing totdat alle kristallen zijn opgelost (te maken op de dag van het experiment).
    2. Bereid een 800 mM K3Fe(CN)6-oplossing door K3Fe(CN)6 toe te voegen aan ddH2O (263,5 mg/ml, bijvoorbeeld 1,32 g in 5 ml ddH2O om een eindconcentratie van 800 mM te verkrijgen) (te maken op de dag van het experiment).
    3. Bereid een 10 mM DTPA-stamoplossing door 786 mg DTPA toe te voegen aan 200 ml ddH2O en stel de pH in op 7,0 met 5N NaOH om DTPA volledig op te lossen.
    4. Voeg 5 ml 200 mM NEM-oplossing, 1,5 ml 800 mM K3Fe(CN)6-oplossing en 1 ml DTPA-stamoplossing toe aan 81,5 ml PBS bij 7,2 pH en voeg ten slotte ten slotte 11 ml 10% NP-40 toe om het uiteindelijke volume op 100 ml te brengen.

2. Monsterverzameling

OPMERKING: Voor meer informatie over het verzamelen van monsters, zie eerder gepubliceerde werken 15,22,40.

  1. Volbloed verzamelen
    1. Verzamel bloed in met heparine beklede buizen en geef de voorkeur aan veneuze boven arteriële bloedvaten (tenzij specifiek vereist) en geef de voorkeur aan katheterplaatsing boven venapunctuur (indien mogelijk) met katheter of naaldboring van ten minste 20 G of groter om hemolyse te minimaliseren.
    2. Voeg onmiddellijk de NO 2-blokkerende oplossing (1 deel van de oplossing aan 4 delen volbloed) toe, proces (rubrieken 3 of 4) of vries in en bewaar bij -80 °C.
  2. Verzamel plasma en rode bloedcellen (RBC's)
    1. Verzamel bloed in met heparine beklede buizen die de voorkeur geven aan veneus boven arterieel bloed (tenzij specifiek vereist) en naalden van ten minste 20 G of meer om hemolyse te minimaliseren en centrifugeer onmiddellijk gedurende 5 minuten bij 4000 x g bij 4 °C.
    2. Meng het supernatant (plasma) met de NO 2-blokkerende oplossing (1 deel van de oplossing op 4 delen van het supernatant) in een nieuwe buis en proces (secties 3 of 4), of vries in en bewaar bij -80 °C.
      OPMERKING: Voor de NO-verbruikstest kan de NO 2-blokkerende oplossing niet worden gebruikt. De test kan worden uitgevoerd zonder plasmavoorbehandeling.
    3. Resuspend de RBC-pellet van de bodem naar een nieuwe buis voorgevuld met S-NO stabilisatieoplossing (zie stap 1.4) (1 ml pellet tot 9 ml oplossing) en incubeer gedurende 5 minuten.
    4. Passeer het RBC-lysaat in een maatkolom met G-25 Sephadex-polymeer dat eerder is gespoeld met ddH2O voor uitsluitingschromatografie
    5. Verzamel de Hb-fractie om te verwerken (rubriek 4) en om de Hb-concentratie te meten met behulp van drabkin's reagens (voor Hb-meting, zie eerder gepubliceerd werk22).
      OPMERKING: Om een specifiek weefsel / orgaan voor te bereiden en te bemonsteren, identificeert u het hilum en isoleert u het chirurgisch. Snijd in de ader, doorprik de slagader en injecteer met gehepariniseerde zoutoplossing (10 E / ml) via de slagader. Verwijder het weefsel wanneer zoutoplossing begint terug te stromen bij de veneuze incisie. Homogeniseer het weefsel met een mechanische homogenisator en voeg 1 deel NO 2-blokkerende oplossing toe aan 4 delen gehomogeniseerd weefsel.

3. VCl3 in HCl-testpreparaat

OPMERKING: Voor meer details over VCl3 in HCl-assayvoorbereiding, zie eerder gepubliceerde werken37,41.

LET OP: De CLD zal beschadigd raken als de NaOH-val niet goed op zijn plaats zit bij het uitvoeren van deze test. Dit komt door de corrosie van HCl.

  1. Bereid standaardoplossingen van NO3- voor standaardcurve voor
    1. Los 85 mg NaNO3 op in 10 ml ddH2O om 0,1 M NaNO3- te verkrijgen (deze oplossing blijft enkele weken stabiel).
    2. Gebruik de stamoplossing om normen te bereiden door verdunning in ddH2O om concentraties van 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μM NaNO3 te verkrijgen om een kalibratiecurve uit te voeren voor plasma- of urinemonsters (gebruik lagere concentraties bij het werken met celculturen).
  2. Bereid VCl3 (vanadiumchloride) verzadigde oplossing voor NO3- reductie in het spoelvat
    LET OP: De reactie van water en VCl3 is exotherm. Let op een hoge glaswerktemperatuur bij het toevoegen van zuur en bij het spoelen van het glaswerk aan het einde van het experiment.
    1. Los 1,6 g VCl3 op in 200 ml van 1 M HCl door eerst VCl3 toe te voegen in een schone kolf en vervolgens 200 ml van 1 M HCl toe te voegen.
    2. Filter de oplossing vacuüm door filterpapier (zoals 11 μm filtreerpapier, maar elk filtreerpapier kan worden gebruikt).
      OPMERKING: De gefilterde oplossing moet helderblauw worden, terwijl de ongefilterde VCl3-oplossing bruin is vanwege onopgeloste deeltjes.
    3. Houd de verzadigde oplossing bedekt met aluminiumfolie of polytetrafluorethyleen (PTFE) tape omdat de verbinding lichtgevoelig is.
  3. Bereid het circulerende waterbad voor
    1. Sluit een circulerend waterbadapparaat aan op de watermantel van het spoelvat. Zorg ervoor dat de lijnen droog zijn voordat je gaat primen.
    2. Start het waterbad bij 95 °C en controleer of er geen lekken op de waterleidingen zijn door (niet-gevaarlijke) papieren handdoeken rond de lijnen aan te brengen.
  4. De gasbellerval instellen
    1. Controleer of de PTFE-huls van de bubbler op zijn plaats zit en of deze niet beschadigd is.
    2. Open de gasbeller en injecteer 15 ml van 1 M NaOH in de bubblerbasis.
    3. Verplaats de gasbeller en sluit de verbinding goed af door de onderkant naar boven te drukken en de twee delen lichtjes te draaien. De onmogelijkheid om de bovenkant van de bubbler te draaien zonder kracht uit te oefenen, duidt op een juiste afdichting.
    4. Sluit de uitlaat van het spoelvat aan op de inlaat van de gasborrelvanger.

4. I3- in azijnzuurtestpreparaat

OPMERKING: Voor meer details over I3- in azijnzuurtestpreparaat, zie eerder gepubliceerde werken 15,22,38,41,42.

  1. Standaardcurve voorbereiden voor NO2-
    1. Bereid een stamoplossing door 69 mg natriumnitriet (NaNO2) op te lossen in 10 ml ddH2O om een oplossing van 100 mM te verkrijgen. Deze oplossing is stabiel als deze wordt bewaard in een luchtdichte container, gekoeld en beschermd tegen licht.
    2. Verdun de stamoplossing serieel in een microcentrifugebuis van 1,5 ml, voorgevuld met 900 μL ddH2O: voeg 100 μL van de stamoplossing toe aan de eerste centrifugebuis, meng, etiketteer en gebruik 100 μL van de buis voor de tweede buis, herhaal dit, wat resulteert in 10 mM, 1 mM en vervolgens 100 μM.
    3. Verder verdunnen met ddH2O om 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM en 500 nM NaNO 2-aliquots te verkrijgen voor gebruik in de kalibratiecurve.
  2. Bereid het I3- in azijnzuur voor op het spoelvat (kan gedurende 1 week bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard)22
    1. Voeg 2 g kaliumjodide (KI) en 1,3 g jodium (I2) toe aan 40 ml ddH2O en 140 ml azijnzuur.
    2. Meng grondig door het mengsel minstens 30 minuten te roeren.
  3. Bereid de monsters voor voor differentiële bepaling van NO2-, S-nitrosothiolen (S-NO-Hb, als Hb wordt verzameld) en ijzer-nitrosylcomplexen (Hb-NO als Hb wordt verzameld) (figuur 3)
    1. Verdeel elk monster in 3 aliquots van 270 μL (900 μL Hb bij meting van S-NO-Hb en Hb-NO) in lichtbeveiligde microcentrifugebuizen, waarvan 2 vooraf gevuld met 30 μL 1x PBS (100 μL bij meting van S-NO-Hb en Hb-NO) en de derde buis met 30 μL HgCl2 (100 μL bij meting van S-NO-Hb en Hb-NO), vortex en incubateer bij RT gedurende 2 min (figuur 3).
    2. Voeg 30 μL van 5% AS toe aan het monster met HgCl2 om Fe-NOs te meten (100 μL voor Hb-NO) en aan een met toegevoegde PBS om S-NOs en Fe-NOs te meten (100 μL voor S-NO-Hb en Hb-NO) en voeg 30 μL PBS toe aan de derde die al vooraf gevuld is met 1x PBS om NO2-, S-NOs en Fe-NOs te meten (100 μL voor residuele NO2- uit Hb-verzameling, S-NO en Hb-NO). Vortex en incubeer bij RT gedurende 3 min (figuur 3).

5. GEEN verbruik door celvrije Hb-opstelling

OPMERKING: Raadpleeg voor meer details het eerder gepubliceerde werk38.

  1. Bereid standaard oxyHb-oplossingen uit een gezuiverde hb-oplossing met een bekende concentratie
    1. Verdun de stamoplossing serieel in microcentrifugebuizen van 1,5 ml door toevoeging van ddH2O om de oplossingen te verkrijgen die voor de kalibratiecurve zullen worden gebruikt: 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM, 1,56 μM.
  2. Bereid de DETA-NONOate oplossing
    1. Voeg 10 mg DETA-NONOaat toe aan 610 μL 10 μM NaOH in pH 7,4 PBS om 100 mM DETA-NONOaat te genereren en houd het op ijs.

6. Start de chemiluminescentiedetector (CLD) en bereid het spoelvat voor

OPMERKING: Voor de voorbereiding van het zuiveringsvat, zie het eerder gepubliceerde werk43.

  1. Controleer de hoofdverbindingen van en naar de CLD
    1. Sluit de zuurstofleiding aan op de CLD en open de zuurstoftank met een druk die in overeenstemming is met de fabrikant van de CLD.
    2. Zorg ervoor dat de Intense Field Dielectric (IFD) filterleiding is aangesloten op de CLD, maar niet op het spoelvat of de NaOH-val
  2. Start de CLD
    1. Begin op de CLD-interface met het uitvoeren van het detectieprogramma voor vloeistoffasetests.
    2. Controleer of de zuurstoftoevoer voldoende is. Als dit het geval is, zal de CLD met succes beginnen met het nemen van monsters vanaf de inlaat en detectie aangeven door een signaal in millivolts (0-5 mV). Anders zal de CLD een negatief diagnostisch signaal geven.
  3. Bereid het zuiveringsvat voor
    1. Sluit het spoelvat op alle drie de poorten: schroef de naaldklep volledig naar rechts, sluit de inlaat- en uitlaatstopkranen.
    2. Verwijder de dop van het spoelvat en voeg een voldoende hoeveelheid van het reagens dat specifiek is voor de geplande test toe aan de reactiekamer (tabel 1) zodat de naald van de spuit die wordt gebruikt om de monsters te injecteren, de vloeistofkolom kan bereiken.
    3. Controleer de aanwezigheid van een stabiele gewenste uitgangswaarde (tabel 1).
  4. Start de spoelgasstroom
    1. Zorg ervoor dat de inerte gastank (bijv. N2) is uitgerust met een tweetrapsregelaar en sluit de inerte gastank aan op de gasinlaat van het vat.
    2. Open het gas met een uitlaatdruk op de regelaar van 1-5 psi, open de inlaat van het spoelvat en open langzaam de naaldklep van het spoelvat om de instroom van gas mogelijk te maken. Controleer of het borrelt in het zuiveringsvat.
  5. Pas de gasstroom aan
    1. Registreer de celdruk gemeten door de CLD met de IFD-filterleiding die omgevingslucht bemonstert.
    2. Plaats de dop op het spoelvat, sluit de IFD-filterleiding aan op het spoelvat (of op de NaOH-val in de VCl3 in HCl-test) en open de uitlaat van het spoelvat.
    3. Gebruik de naaldklep om dezelfde celdruk te bereiken op CLD-niveau dat wordt geregistreerd in de omgevingslucht.

7. Experimenteer

OPMERKING: Voor meer details over het experiment, zie het eerder gepubliceerde werk43.

  1. Start het chemiluminescentiesignaalacquisitieprogramma
    1. Sluit de seriële poort van de CLD aan op de seriële poort van de computer waarop het acquisitieprogramma is geïnstalleerd.
    2. Voer het analyseprogramma uit.
    3. Klik op Verwerven, selecteer de map om het .data-bestand op te slaan, typ de bestandsnaam en klik op Opslaan.
      OPMERKING: Let op de vooraf ingestelde uitvoeringstijd op het scherm, omdat de opname automatisch stopt wanneer de vooraf ingestelde tijd is verstreken. Indien nodig kan de vooraf ingestelde looptijd worden verlengd.
  2. Bereid u voor op herhaalde monsterinjecties
    1. Pas de spanningsschaal op het scherm aan om controle te hebben over de beoogde basislijn door op de knoppen Minimum en/of Maximum te klikken en vervolgens de gewenste waarde in te voeren.
    2. Neem een buis van 20 of 50 ml gevuld met ddH2O om de spuit tussen de monsters door te spoelen.
    3. Zorg dat er een doos met delicate taakdoekjes bij de hand is.
  3. Monster injectie
    OPMERKING: Begin met de standaardoplossingen voor de kalibratiecurve (injecteer van de minst geconcentreerde naar de meest geconcentreerde monsters) en ga vervolgens verder met de experimentmonsters (overweeg dit in duplicaten of drielicaten te doen).
    1. Spoel de spuit ten minste tweemaal of meer met ddH2O voordat u elk monster optrekt (en na elke injectie) en controleer elke keer dat onbelemmerd water wordt uitgeworpen op een taakdoekje.
    2. Plaats de spuit in de monsterbuis terwijl u zowel de spuit als de buis op korte afstand houdt, trek de zuiger op tot het gewenste volume terwijl u ervoor zorgt dat er geen luchtbel en/of niet-gehomogeniseerde vaste delen worden opgesloten.
    3. Reinig de punt van de spuit met een taakwisser, steek de spuit vervolgens in de septa-dop bij de injectiepoort en injecteer nadat u hebt gecontroleerd of de punt van de spuit zich in de vloeistoffase in de reactiekamer bevindt.
  4. Markeer de injectie in het softwareprogramma en wacht
    1. Controleer of de injectie een opwaartse verandering in het signaal veroorzaakt (aanvullende figuur 1) (naar beneden in de NO-consumptie door celvrije Hb-test) en typ de monsternaam door op het grijze vak onder Monsternamen te klikken en klik vervolgens op Injectie markeren.
      OPMERKING: Vermoed obstructie van de spuit als het monsterinjectie geen signaal genereert.
    2. Wacht tot het elektrische signaal de basislijn weer bereikt (dit duurt meestal 3-4 minuten). Deze tijd kan worden gebruikt om stap 7.3.1 uit te voeren.
  5. Herhaal alle stappen die zijn aangegeven in stap 7.3 en 7.4 tijdens en na elke injectie tot het einde van het experiment. Vergeet niet om een voorbeeld van de conserveringsoplossing uit te voeren (indien gebruikt)
  6. Het experiment stoppen
    1. Klik op STOP om de signaalacquisitie te onderbreken, stop de CLD en schakel het waterbad uit (als NO3- wordt gemeten).
    2. Onderbreek de gasstroom, open de naaldklep, verwijder de dop van het spoelvat, plaats een afvalcontainer onder de afvoer en open de afvoerstopkraan.
      OPMERKING: Als het experiment langer dan 60 minuten gegevensverzameling vereist, moet u de acquisitie na 60 minuten runtime opnieuw starten (herhaal stap 7.1.3) en een nieuw bestand maken.

8. Metingen en berekeningen

OPMERKING: Metingen en berekeningen worden offline uitgevoerd en kunnen op een ander moment worden uitgevoerd.

  1. Start het chemiluminescentie-acquisitieprogramma voor offline data-analyse
    1. Start het programma en klik op Verwerken.
    2. Selecteer het experimentbestand en klik vervolgens op Openen.
  2. Bereken het gebied onder de curve voor elke toediening
    1. De software brengt automatisch de basislijn (aanvullende figuur 2A, horizontale gele lijn) en de piekas van elke golf die door elke monsteradministratie wordt gegenereerd (verticale gele lijnen) op het scherm in kaart: controleer hun juiste positie (of pas deze aan door op elke lijn te klikken en deze met de muis of de pijlen te verplaatsen) en klik op Threshold OK (Supplemental Figure 2B).
      OPMERKING: In de NO consumption by cell-free Hb measurement assay slaagt de software er doorgaans niet in om de golfvorm die door monsterinjectie wordt gegenereerd, correct vast te leggen. Door in te zoomen op elke golfvorm kan de operator de software eenvoudig helpen bij de gebiedsberekening (aanvullende figuur 2).
    2. De software brengt automatisch het begin (verticale groene lijn) en het einde (verticale rode lijn) van elke piek veroorzaakt door elke monsteradministratie in kaart: controleer hun juiste positie (of pas aan door op elke lijn te klikken en deze met de muis of de pijlen te verplaatsen) en klik op Integreren (aanvullende figuur 2C).
      OPMERKING: Sommige gebieden in het spoor kunnen op dit punt ten onrechte worden gedefinieerd als injecties en sommige pieken kunnen automatisch twee keer worden geteld. Beide fouten kunnen opnieuw worden geïdentificeerd en verwijderd tijdens stap 8.2.2
    3. De software matcht automatisch elk signaalgebied na een injectie die tijdens het experiment is gemarkeerd en de toegewezen naam: navigeer door elke piek (aangegeven door een gele verticale lijn) met de toegewezen naam door op Next Peak en Previous Peak te klikken en klik vervolgens op de knop All OK om uiteindelijk de berekening voor alle gebieden op het scherm te verkrijgen.
    4. Om alle naamgevings- of matchingfouten van de gebruiker of het programma te corrigeren, gebruikt u indien nodig de knoppen die worden aangegeven in Aanvullend bestand 1.
  3. Breng de waarden van de kalibratiecurve over naar een spreadsheet en genereer een lineaire regressievergelijking (aanvullende figuur 3)
    1. Breng de gegevens van het CLD-programma over naar een nieuwe spreadsheet via copy-paste. Rangschik de twee kolommen in het gegevensblad als Monsterconcentratie en Gebied onder de curve en voeg een overeenkomende waarde van nul toe aan beide kolommen.
    2. Selecteer de twee kolommen, klik op Invoegen > spreiding en selecteer vervolgens onder het menu Grafiekontwerp de optie Grafiekelement toevoegen > Trendlijn > Lineair.
    3. Klik met de rechtermuisknop op de gegenereerde trendlijn, klik op Trendlijn opmaken en klik vervolgens op de opties Vergelijkingen weergeven in Grafiek en R-kwadraatwaarde weergeven in Grafiek in het menu Trendlijn opmaken om een eenvoudige lineaire kalibratievergelijking te verkrijgen.
  4. Breng het berekende gebied van elk monster over om de concentratie te berekenen (aanvullende figuur 3)
    1. Rapporteer elke waarde in de spreadsheet. Pas in de volgende kolom de vergelijking uit stap 8.3.3 toe om de concentratie van elk geïnjecteerd monster te verkrijgen, waarbij y de concentratie is (waarde van de nieuwe kolom) en x het gebied onder de curve is dat na injectie is gemeten.
      OPMERKING: Vergeet niet om rekening te houden met de concentratie gemeten in de conserveringsoplossing (indien gebruikt) en trek de waarden dienovereenkomstig af.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De NO-consumptie door celvrije Hb-test werd gebruikt in monsters met bekende concentraties celvrij oxyHb (figuur 4). Omdat één heem oxyHb stoichiometrisch één NO-molecuul vrijgeeft in de test, wordt gezuiverde celvrije oxyHb gebruikt om de kalibratiecurve voor de test te bouwen (aanvullende figuur 3).

De dosis-responsrelatie tussen celvrij Hb (gemeten met een colorimetrische assay) en NO-consumptie bij patiënten die tijdens hartchirurgie van cardi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Vanwege de hoge gevoeligheid hebben op chemiluminescentie gebaseerde assays voor de bepaling van NO en gerelateerde verbindingen een hoog risico op NO 2-contaminatie. Elk reagens (met name de NO2-blokkerende oplossing) en verdunningsmiddel (inclusief ddH2O) dat in het experiment wordt gebruikt, moet worden getest op zijn NO 2-gehalte om te corrigeren voor achtergrondsignaal. Nitriet is extreem reactief met een halfwaardetijd in volbloed rond de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

L.B. ontvangt salarissteun van K23 HL128882/NHLBI NIH als hoofdonderzoeker voor zijn werk aan hemolyse en stikstofmonoxide. LB ontvangt subsidies van "Fast Grants for COVID-19 research" aan het Mercatus Center van de George Mason University en van iNO Therapeutics LLC. B.Y. wordt ondersteund door subsidies van een NHLBI/#R21HL130956 en DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. ontving patenten bij MGH op de elektrische opwekking van stikstofmonoxide.

L.B. en B.Y. hebben een patentaanvraag ingediend voor NO delivery in COVID-19 disease PCT application number: PCT/US2021/036269 ingediend op 7 juni 2021. RWC ontvangt salarissteun van Unitaid als hoofdonderzoeker voor technologische ontwikkeling gericht op gedecentraliseerde diagnose van tuberculose bij kinderen in omgevingen met weinig middelen.

Dankbetuigingen

De protocollen die in dit manuscript worden gerapporteerd, werden mogelijk gemaakt door de verzamelde bijdragen van eerdere fellows van Dr. Warren Zapol's laboratorium voor anesthesieonderzoek in kritieke zorg, afdeling anesthesie in het Massachusetts General Hospital. We erkennen de bijdrage van Drs. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli en Emanuele Rezoagli.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AzijnzuurSigma45754500 mL - vloeistof
Antifoam B EmulsieSigmaA5757250 mL - vloeistof
DETA NONOateCayman8212010 mg
Gibco DPBS (1x) zonder calcium, zonder magnesiumThermoFisher14190144500 mL
Zoutzuur 37% (1 M)Sigma258148500 mL - vloeistof
JodiumSAFC207772100 g - vast
KimwipesKimtech34155
Kwik(II)chloride ACS reagens > 99,5%Sigma215465100 g - vast (oplossen in water)
Mili-Q WaterzuiveringssysteemMillipore
Model 705 RN 50 µL spuitHamilton80530Microliter spuit
Model 802 N 25 µL spuitHamilton84854Microliter spuit
N-ethylmaleïmideSigma426025 g - kristallijn
Stiikstofmonoxide-analysator + bundelsoftware - uitspoelvatZysenseNOA 280iChemiluminescentie detector
Nonidet p-40  (NP-40)ThermoFisher8512510% - 500 mL
Kaliumhexacyanoferraat (III) ACS reagens > 99%Sigma244023100 g - poeder
Kaliumjodide ACS reagens > 99%Sigma221945100 g - vast
Kaliumnitriet kristallen. Voor analyse EMSURE ACSSupelco105067250 g - kristallijn
PowerGen 125Fisher Scientific14-359-251Mechaanse homogenisator
RV3 Tweedelige roterende schotpompEdwardsA65201906Vacuümpomp - Gebundeld met analyaor
Natriumheparine - BD Hemogard CloBD BiosciencesBD36787175 USP eenheden
Natriumhydroxide watervrij ACS reagens > 97%Sigma7954291 kg - pellets
Natriumnitraat ACS reagens > 99%Sigma221341500 g - poeder
Natriumnitriet > 99%SigmaS2252500 g - kristallijn
Sulfanilamid > 98%SigmaS9251100 g - vast
Vanadium(III)chlorideSigma11239325 g - vast - Voorzichtig (exotherm)
Whatman 1 FilterpapierSigmaWHA10010155

Referenties

  1. Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  2. Furchgott, R. F. The discovery of endothelium-derived relaxing factor and its importance in the identification of nitric oxide. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 276 (14), 1186(1996).
  3. Ignarro, L. J., Buga, G. M., Byrns, R. E., Wood, K. S., Chaudhuri, G. Endothelium-derived relaxing factor and nitric oxide possess identical pharmacologic properties as relaxants of bovine arterial and venous smooth muscle. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 246 (1), 218-226 (1998).
  4. Arnold, W. P., Mittal, C. K., Katsuki, S., Murad, F. Nitric oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3':5'-cyclic monophosphate levels in various tissue preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (8), 3203-3207 (1977).
  5. Hayashida, K., et al. Depletion of vascular nitric oxide contributes to poor outcomes after cardiac arrest. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (10), 1288-1290 (2019).
  6. Ignarro, L. J. Inhaled NO and COVID-19. British Journal of Pharmacology. 177 (16), 3848-3849 (2020).
  7. Gantner, B. N., LaFond, K. M., Bonini, M. G. Nitric oxide in cellular adaptation and disease. Redox Biology. 34, 101550(2020).
  8. Clark, R. H., et al. Low-dose nitric oxide therapy for persistent pulmonary hypertension of the newborn. New England Journal of Medicine. 342 (7), 469-474 (2000).
  9. Goldbart, A., et al. Inhaled nitric oxide therapy in acute bronchiolitis: A multicenter randomized clinical trial. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
  10. Bangirana, P., et al. Inhaled nitric oxide and cognition in pediatric severe malaria: A randomized double-blind placebo controlled trial. PloS One. 13 (1), 0191550(2018).
  11. Jiang, S., Dandu, C., Geng, X. Clinical application of nitric oxide in ischemia and reperfusion injury: A literature review. Brain Circulation. 6 (4), 248-253 (2020).
  12. Lei, C., et al. Nitric oxide decreases acute kidney injury and stage 3 chronic kidney disease after cardiac surgery. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (10), 1279-1287 (2018).
  13. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  14. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radical Biology and Medicine. 43 (5), 645-657 (2007).
  15. Macarthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. Journal of Chromatography B. 851 (1-2), 93-105 (2007).
  16. Helms, C., Kim-Shapiro, D. B. Hemoglobin-mediated nitric oxide signaling. Free Radical Biology and Medicine. 61, 464-472 (2013).
  17. Kim-Shapiro, D. B., Schechter, A. N., Gladwin, M. T. Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (4), 697-705 (2006).
  18. Rezoagli, E., et al. Pulmonary and systemic vascular resistances after cardiopulmonary bypass: role of hemolysis. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 31 (2), 505-515 (2017).
  19. Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
  20. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
  21. Heinrich, T. A., Da Silva, R. S., Miranda, K. M., Switzer, C. H., Wink, D. A., Fukuto, J. M. Biological nitric oxide signalling: chemistry and terminology. British Journal of Pharmacology. 169 (7), 1417-1429 (2013).
  22. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of s -nitrosothiols, iron-nitrosyls, and nitrite in biological samples. Free Radical Research. 37 (1), 1-10 (2003).
  23. Hayashida, K., et al. Improvement in outcomes after cardiac arrest and resuscitation by inhibition of s-nitrosoglutathione reductase. Circulation. 139 (6), 815-827 (2019).
  24. Rodríguez-Ortigosa, C. M., et al. Biliary secretion of S-nitrosoglutathione is involved in the hypercholeresis induced by ursodeoxycholic acid in the normal rat. Hepatology. 52 (2), Baltimore, Md. 667-677 (2010).
  25. Mitchell, D. A., Marletta, M. A. Thioredoxin catalyzes the S-nitrosation of the caspase-3 active site cysteine. Nature Chemical Biology. 1 (3), 154-158 (2005).
  26. Mannick, J. B., et al. Fas-induced caspase denitrosylation. Science. 284 (5414), New York, NY. 651-654 (1999).
  27. Choi, Y. -B., et al. Molecular basis of NMDA receptor-coupled ion channel modulation by S-nitrosylation. Nature Neuroscience. 3 (1), 15-21 (2000).
  28. Eu, J. P., Sun, J., Xu, L., Stamler, J. S., Meissner, G. The skeletal muscle calcium release channel: Coupled O2 sensor and NO signaling functions. Cell. 102 (4), 499-509 (2000).
  29. Stamler, J. S., et al. Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (16), 7674-7677 (1992).
  30. Dunham, A. J., Barkley, R. M., Sievers, R. E. Aqueous nitrite ion determination by selective reduction and gas phase nitric oxide chemiluminescence. Analytical Chemistry. 67 (1), 220-224 (1995).
  31. Hogg, N., Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Detection of Nitric Oxide and Peroxynitrite in Biological Systems: A State-of-the-Art Review. Nitric Oxide (Third Edition). Ignarro, L. J., Freeman, B. A. , Academic Press. Chapter 3 23-44 (2017).
  32. Gudem, M., Hazra, A. Mechanism of the chemiluminescent reaction between nitric oxide and ozone. The Journal of Physical Chemistry A. 123 (4), 715-722 (2019).
  33. Ishibe, Y., Liu, R., Hirosawa, J., Kawamura, K., Yamasaki, K., Saito, N. Exhaled nitric oxide level decreases after cardiopulmonary bypass in adult patients. Critical Care Medicine. 28 (12), 3823-3827 (2000).
  34. American Thoracic Society, European Respiratory Society. ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide, 2005. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (8), 912-930 (2005).
  35. Cuthbertson, B. H., Stott, S. A., Webster, N. R. Exhaled nitric oxide as a marker of lung injury in coronary artery bypass surgery. British Journal of Anaesthesia. 89 (2), 247-250 (2002).
  36. Ewing, J. F., Janero, D. R. Specific S-nitrosothiol (thionitrite) quantification as solution nitrite after vanadium(III) reduction and ozone-chemiluminescent detection. Free Radical Biology and Medicine. 25 (4-5), 621-628 (1998).
  37. Braman, R. S., Hendrix, S. A. Nanogram nitrite and nitrate determination in environmental and biological materials by vanadium(III) reduction with chemiluminescence detection. Analytical Chemistry. 61 (24), 2715-2718 (1989).
  38. Wang, X., et al. Biological activity of nitric oxide in the plasmatic compartment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11477-11482 (2004).
  39. Bryan, N. S., Rassaf, T., Rodriguez, J., Feelisch, M. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10 (4), 221-228 (2004).
  40. Kida, K., Shirozu, K., Yu, B., Mandeville, J. B., Bloch, K. D., Ichinose, F. Beneficial effects of nitric oxide on outcomes after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in hypothermia-treated mice. Anesthesiology. 120 (4), 880-889 (2014).
  41. Gladwin, M. T., et al. S-Nitrosohemoglobin is unstable in the reductive erythrocyte environment and lacks O2/NO-linked allosteric function. The Journal of Biological Chemistry. 277 (31), 27818-27828 (2002).
  42. Feelisch, M., et al. and heme-nitros(yl)ation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. The FASEB Journal. 16 (13), 1775-1785 (2002).
  43. Liu, T., et al. L-NAME releases nitric oxide and potentiates subsequent nitroglycerin-mediated vasodilation. Redox Biology. 26, 101238(2019).
  44. Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54879(2016).
  45. Keefer, L. K., Nims, R. W., Davies, K. M., Wink, D. A. 34;NONOates" (1-substituted diazen-1-ium-1,2-diolates) as nitric oxide donors: Convenient nitric oxide dosage forms. Methods in Enzymology. , Academic Press. 281-293 (1996).
  46. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radical Biology and Medicine. 42 (8), 1146-1154 (2007).
  47. Doctor, A., et al. Hemoglobin conformation couples erythrocyte S-nitrosothiol content to O2 gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5709-5714 (2005).
  48. Zhang, Y., Keszler, A., Broniowska, K. A., Hogg, N. Characterization and application of the biotin-switch assay for the identification of S-nitrosated proteins. Free Radical Biology and Medicine. 38 (7), 874-881 (2005).
  49. Davies, I. R., Zhang, X. Nitric Oxide Selective Electrodes. Methods in enzymology. Poole, R. K. , Academic Press. Chapter 5 63-95 (2008).
  50. Saito, J., et al. Comparison of fractional exhaled nitric oxide levels measured by different analyzers produced by different manufacturers. Journal of Asthma. 57 (11), 1216-1226 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Chemiluminescentie assaydetectie van stikstofmonoxidestikstofmonoxidemetabolietenozon chemiluminescentiecelvrij hemoglobinenitrietmetingnitraatmetingdetectie van S nitrosothiolenijzer nitrosylcomplexen
Chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en zijn derivaten van autoxidatie en nitrosated compounds
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.