Geautomatiseerde tweedimensionale spatiotemporale analyse van mobiele fret-sondes met één molecuul

Summary

Dit artikel presenteert een methode voor spatiotemporale analyse van mobiele, single-molecule Förster resonantie energieoverdracht (smFRET)-gebaseerde probes met behulp van widefield fluorescentiemicroscopie. De nieuw ontwikkelde softwaretoolkit maakt het mogelijk om smFRET-tijdsporen van bewegende sondes te bepalen, inclusief de juiste FRET-efficiëntie en de moleculaire posities, als functies van de tijd.

Abstract

Single-molecule Förster resonantie energieoverdracht (smFRET) is een veelzijdige techniek die rapporteert over afstanden in het sub-nanometer tot nanometer bereik. Het is gebruikt in een breed scala van biofysische en moleculair biologische experimenten, waaronder de meting van moleculaire krachten, karakterisering van conformatiedynamiek van biomoleculen, observatie van intracellulaire colocalisatie van eiwitten en bepaling van receptor-ligand interactietijden. In een widefield-microscopieconfiguratie worden experimenten meestal uitgevoerd met behulp van oppervlakte-geïmmobiliseerde sondes. Hier wordt een methode gepresenteerd die single-molecule tracking combineert met alternating excitation (ALEX) smFRET-experimenten, waardoor smFRET-tijdsporen van oppervlaktegebonden, maar mobiele probes in plasmamembranen of door glas ondersteunde lipide bilayers kunnen worden verkregen. Voor de analyse van geregistreerde gegevens werd een geautomatiseerde, open-source softwareverzameling ontwikkeld ter ondersteuning van (i) de lokalisatie van fluorescerende signalen, (ii) single-particle tracking, (iii) bepaling van FRET-gerelateerde grootheden inclusief correctiefactoren, (iv) strenge verificatie van smFRET-sporen en (v) intuïtieve presentatie van de resultaten. De gegenereerde gegevens kunnen gemakkelijk worden gebruikt als input voor verdere verkenning via gespecialiseerde software, bijvoorbeeld voor de beoordeling van het diffusionele gedrag van sondes of het onderzoek van FRET-overgangen.

Introduction

Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is een belangrijke drijfveer geweest in moleculair biologisch en biofysisch onderzoek, omdat het het onderzoek van processen met sub-nanometer resolutie mogelijk maakt. Aangezien de efficiëntie van de energieoverdracht tussen donor- en acceptorfluooforen sterk afhangt van de inter-kleurstofafstand in het subnanometer-nanometer-nanometerbereik, is het effectief gebruikt als een spectroscopische liniaal om statische en dynamische conformatie van biomoleculen ^te onderzoeken1,2,3,4. Bovendien is het FRET-fenomeen op grote schaal gebruikt voor colocalisatiestudies van membraangeassocieerde en intracellulaire eiwitten op ^{bulkniveau5,6}. In de afgelopen twee decennia werd de methode aangepast voor het monitoren van smFRET-gebeurtenissen7, wat hielp om de temporele en ruimtelijke resolutie aanzienlijk te verhogen en zelfs zeldzame subpopulaties in heterogene monsters op te lossen. Uitgerust met deze technieken werden unieke inzichten verkregen in de dynamiek van moleculaire machines, zoals de transcriptverwerkingssnelheid van RNA-polymerase ^II8, replicatiesnelheid van DNA-polymerasen9,10, nucleosoomtranslocatiesnelheid11, transcriptsplitsing en stagnatiesnelheid van geassembleerde spliceosomen12, de activiteit van ribosomale subpopulaties13 en de loopsnelheid van kinesinemotoren14 , om er maar een paar te noemen. Receptor-ligand interactie ^duur15 en moleculaire ^krachten16 zijn gekwantificeerd.

Op intensiteit gebaseerde smFRET-studies vertrouwen doorgaans op gesensibiliseerde emissie om de FRET-efficiëntie te meten: een bundelsplitser in het emissiepad scheidt ruimtelijk licht afkomstig van donor- en acceptorfluooforen bij donorexcitatie, waardoor de kwantificering van individuele fluorescentie-intensiteiten mogelijk is. Het rendement kan vervolgens worden berekend als de fractie van fotonen die door de acceptor wordt uitgezonden ten opzichte van het totale aantal ^fotonen17. Bovendien maakt acceptor excitatie na donor excitatie (ALEX) het mogelijk om de stoichiometrie van de FRET-gebeurtenissen te meten, wat helpt bij het onderscheid tussen echte lage FRET-signalen van signalen die bijvoorbeeld voortkomen uit sondes met een fotogebleekte acceptorfluoofoor18.

Single-molecule FRET-experimenten worden vaak op twee manieren uitgevoerd. Eerst wordt een klein gebied in het monstervolume belicht met behulp van een confocale microscoop. Enkele sondemoleculen in oplossing worden opgewonden wanneer ze toevallig diffunderen binnen het focale volume. Met deze techniek kunnen snelle detectoren voor het tellen van fotonen worden gebruikt, waardoor een tijdresolutie van minder dan een microseconde mogelijk is. Ten tweede worden sondes specifiek geïmmobiliseerd op oppervlakken en bewaakt via widefield-microscopie, vaak met behulp van totale interne reflectie (TIR) -configuratie om achtergrondfluorescentie te minimaliseren. Probe immobilisatie zorgt voor veel langere opnametijden dan het gebruik van de eerste benadering. Bovendien maakt het grotere gezichtsveld het mogelijk om meerdere sondes parallel te bewaken. De behoefte aan een camera maakt deze methode traag in vergelijking met de hierboven beschreven methode. De tijdresolutie is beperkt tot het milliseconde tot tweede bereik.

Als lange tijdsporen nodig zijn, bijvoorbeeld voor het bestuderen van dynamische processen op een milliseconde tot tweede tijdschaal, is de eerste methode niet van toepassing, omdat de fluorescentie-uitbarstingen meestal te kort zijn. De tweede benadering faalt wanneer immobilisatie niet haalbaar is, bijvoorbeeld in live-celexperimenten met sondes die zich in het celmembraan verspreiden. Bovendien is waargenomen dat biologische modelsystemen hun respons dramatisch kunnen variëren, afhankelijk van de mobiliteit van het gecontacteerde ^oppervlak16.

Hoewel in het verleden gecombineerde smFRET- en single-particle tracking-experimenten met mobiele FRET-sondes zijn ^uitgevoerd19, is er geen openbaar beschikbare software voor de evaluatie van de gegevens. Dit leidde tot de ontwikkeling van een nieuw analyseplatform, dat de bepaling van meerdere eigenschappen van mobiele fluorescerende sondes mogelijk maakt, waaronder smFRET-efficiëntie en stoichiometrie, posities met subpixelnauwkeurigheid en fluorescentie-intensiteiten als functies van de tijd. Methoden voor het filteren van de resulterende sporen door stapsgewijs bleekgedrag, nearest-neighbor afstanden, emissie-intensiteiten en andere eigenschappen te onderzoeken, werden vastgesteld om uitsluitend correct gesynthetiseerde en functionele single-probe moleculen te kiezen. De software ondersteunt ook experimentele en analytische technieken die onlangs zijn overeengekomen in een multilaboratoriumstudie om betrouwbare, kwantitatieve smFRET-gegevens te ^produceren17. In het bijzonder houdt de implementatie zich aan de gevalideerde procedures voor de berekening van FRET-efficiëntie en stoichiometrie. Fluorescentie-intensiteiten bij donorexcitatie in het donoremissiekanaal _IDD en het acceptoremissiekanaal IDA worden gebruikt voor de berekening van de schijnbare FRET-efficiëntie-Eapp met Eq (1).

(1)

Met behulp van de fluorescentie-intensiteit in het acceptoremissiekanaal bij acceptor-excitatie IAA wordt de schijnbare stoichiometrie berekend met behulp van Eq (2).

(2)

De FRET-efficiëntie E en de stoichiometrie S kunnen worden afgeleid van Eapp en Sapp door rekening te houden met vier correctiefactoren.

α beschrijft de lekkage van donorfluorescentie in het acceptoremissiekanaal en kan worden bepaald met behulp van een monster dat alleen donorfluoroforen bevat of door delen van trajecten te analyseren waar de acceptor is gebleekt. δ corrigeert voor de directe excitatie van de acceptor door de donor excitatie lichtbron en kan worden gemeten met behulp van een monster met alleen acceptor fluoroforen of door het analyseren van delen van trajecten waar de donor is gebleekt.

.

γ schaalt de ID _om divergerende detectie-efficiënties in donor- en acceptoremissiekanalen en verschillende kwantumefficiënties van de fluoroforen te corrigeren. De factor kan worden berekend door de toename van de donorintensiteit te analyseren bij het bleken van de acceptor in trajecten met hoge ^{FRET-efficiëntie20} of door een monster met meerdere discrete FRET-toestanden te bestuderen.

β schaalt IAA om te corrigeren voor ongelijksoortige efficiëntie van donor- en acceptorexcitatie. Als γ werd bepaald via een analyse van het bleken van de acceptor, kon β worden berekend uit een monster van de bekende donor-acceptorverhouding21. Anders levert de multi-state FRET-steekproef ook β op.

Samen maken de correcties het mogelijk om de gecorrigeerde FRET-efficiëntie te berekenen met behulp van Eq (3).

(3)

en de gecorrigeerde stoichiometrie met Eq (4).

(4)

Idealiter geeft de gecorrigeerde stoichiometrie voor een 1:1 donor-to-acceptor ratio S = 0,5. In de praktijk zorgt een verminderde signaal-ruisverhouding voor een spreiding van de gemeten waarden van S, waardoor de discriminatie van donor-only signalen (S = 1) en acceptor-only signalen (S = 0) wordt belemmerd. De resulterende tijdsporen kunnen worden gebruikt als input voor een meer gedetailleerde analyse van de trajecten met één molecuul om informatie te verkrijgen zoals spatiotemporale ^{krachtprofielen16}, de mobiliteit van de single-molecule ^events22 of overgangskinetiek tussen verschillende ^toestanden1.

Het volgende protocol beschrijft experimentele parameters en procedures voor smFRET-trackingexperimenten, evenals het werkingsprincipe achter data-analyse met behulp van de nieuw ontwikkelde softwaresuite. Voor het verzamelen van experimentele gegevens wordt aanbevolen om een microscopie-opstelling te gebruiken die aan de volgende vereisten voldoet: i) het vermogen om de emissie van enkele kleurstofmoleculen te detecteren; ii) widefieldverlichting: met name voor experimenten met levende cellen wordt een configuratie van de totale interne reflectie (TIR23,24,25) aanbevolen; iii) ruimtelijke scheiding van emissielicht volgens golflengte, zodat donor- en acceptorfluorescentie wordt geprojecteerd op verschillende regio's van dezelfde ^camerachip25 of verschillende camera's; iv) modulatie van lichtbronnen voor donor- en acceptorexcitatie met millisecondeprecisie, bijvoorbeeld met behulp van direct modulalabele lasers of modulatie via acousto-optische modulatoren. Dit maakt stroboscopische verlichting mogelijk om fotobleaching van fluoroforen te minimaliseren, evenals afwisselende excitatie om stoichiometrieën te bepalen; v) uitvoer van één bestand per opgenomen beeldreeks in een formaat dat kan worden gelezen door het PIMS ^{Python-pakket26}. In het bijzonder worden TIFF-bestanden met meerdere pagina's ondersteund.

Protocol

1. Softwarevereisten

1. Installeer de miniconda ^{Python-distributie27} (minimaal vereiste Python-versie: 3.7).
2. Open een Anaconda-prompt in het menu Start van Windows of open een terminal en voer conda activate uit als u Linux of macOS gebruikt.
3. Schakel de door de community onderhouden conda-forge-pakket ^repository28 in door de volgende opdrachten uit te voeren:
   conda config --kanalen toevoegen conda-forge
   conda config --set channel_priority strikte
   conda update --alle
4. Installeer de vereiste Python-pakketten door het volgende uit te voeren:
   conda install opencv trackpy lmfit ipympl scikit-learn pyqt sdt-python jupyterlab
5. Raak vertrouwd met JupyterLab, de gebruikersinterface van de analysesoftware (zie de ^{softwaredocumentatie29}).
6. Installeer het git version control systeem, dat later zal worden gebruikt om de analysesoftware te downloaden en bij te werken. Als u Linux gebruikt, gebruikt u de pakketbeheersoftware van de distributie om te downloaden en bij te werken. Voer anders het volgende uit:
   conda git installeren
7. Installeer optioneel het Sidecar Python-pakket om datasets weer te geven na filterstappen tijdens de analyse:
   conda installeren zijspan

2. Meting van monsters

Figuur 1: Beeldacquisitie. (A) Excitatievolgorde. Na het opnemen van een optioneel beeld van een kleurstofbelaste cel met behulp van de 405 nm-laser, worden donor en acceptor afwisselend en herhaaldelijk geëxciteerd voor verlichtingstijd met _{behulp van} respectievelijk 532 nm en 640 nm lasers. De tijd tussen donor- en acceptor-excitatie moet lang genoeg zijn om het beeld door de camera te kunnen uitlezen. De vertragingstijd _tdelay kan worden gebruikt om de acquisitiekadersnelheid en dus de observatietijdspanne vóór het fotograferen aan te passen. Dit paneel is aangepast van ¹⁶. (B) Fiduciale markers worden gebruikt voor de berekening van de coördinatentransformaties tussen de twee emissiekanalen. Overeenkomende fiducials worden aangegeven door kleur. Verschillende verschoven beelden moeten worden opgenomen om ervoor te zorgen dat het hele gezichtsveld wordt bedekt. (C) Laserprofielen voor vlakveldcorrectie worden geregistreerd met behulp van een dicht gelabeld monster. Het acceptorprofiel wordt vastgelegd en gefotobleached, gevolgd door het verwerven van het donorprofiel. Meerdere afbeeldingen moeten worden gemaakt in verschillende monstergebieden, gemiddeld en gladgestreken om de invloed van onvolkomenheden in het monster (bijvoorbeeld de heldere vlek in het midden bovenaan de afbeelding) te verminderen. (D) Flatfield-correctiekaart p(x,y) berekend op basis van 20 laserprofielen geregistreerd zoals beschreven in C. Afkortingen: FRET = Förster resonantie energieoverdracht; ImDD = donoremissiebeeld bij donorexcitatie; ImDA = acceptor emissiebeeld bij donor excitatie; ImAA = acceptor emissiebeeld bij donor excitatie. Schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Wanneer u een emccd-camera (electron-multiplying charge-coupled device) gebruikt, moet u de EM-versterking in staat stellen om signalen van één molecuul te observeren bij hoge signaal-ruisverhoudingen (raadpleeg de instructies van de fabrikant).
2. Excitatievolgorde (zie figuur 1A voor meer details).
   1. Neem eventueel een afbeelding op voor segmentatie om gegevensanalyse te beperken tot bepaalde regio's in het gezichtsveld. Exciteer bijvoorbeeld Fura-2-geladen cellen met behulp van een 405 nm-laser en vang hun emissie rond 510 nm op om alleen sondes te evalueren die zich in interfaces tussen cellen en ondersteunde lipide bilayers (SBS) bevinden. Wacht daarom op tijd tr om camera-uitlezing toe te staan.
      OPMERKING: Op EMCCD-camera's is tr afhankelijk van het aantal lijnen in de gekozen regio van belang (ROI). Daarom kan het kiezen van een kleine ROI voordelig zijn omdat het de vertraging tussen frames en de grootte van geregistreerde gegevens vermindert. Bovendien zorgt het inschakelen van de frame-overdrachtsmodus voor een verdere vermindering van tr.
   2. Afwisselend prikkelen donor- en acceptorfluooforen herhaaldelijk.
      1. Prikkel de donor voor een verlichtingstijd till (5-10 ms is meestal kort genoeg om bewegingsonscherpte te voorkomen) terwijl ook de camera wordt geactiveerd.
      2. Wacht op tijd tr om camera-uitlezing toe te staan.
      3. Prikkel de acceptor voor terwijl je de camera activeert.
      4. Wacht een tijdje _tdelay.
         OPMERKING: Dit moet langer zijn dan tr om uitlezing door de camera mogelijk te maken, maar kan anders willekeurig worden gekozen. Er wordt een evenwicht gevonden tussen de vereisten voor tijdsresolutie en traceerlengte.
      5. Herhaal stap 2.2.2.1-2.2.2.4. Kies het aantal herhalingen dat groot genoeg is om fotobleaching van ten minste één fluorofoor per sonde binnen het gezichtsveld te garanderen, wat stapsgewijze fotobleachinganalyse mogelijk maakt voor discriminatie van signalen van één molecuul van aggregaten.
         OPMERKING: Het kiezen van de juiste till- en excitatielaserintensiteiten vereist vaak wat experimenten: hoe langer de verlichtingstijden en hoe hoger de laserintensiteiten, hoe beter de signaal-ruisverhouding in de resulterende beelden is, maar hoe korter de resulterende tijdsporen.
3. Neem een voldoende aantal films op voor elk voorbeeld.

3. Aanvullende metingen voor de bepaling van correctiefactoren

1. Registreer een reeks willekeurig geplaatste fiduciële markers die zichtbaar zijn in beide emissiekanalen voor beeldregistratie (d.w.z. het vinden van de transformatie die coördinaten van het donoremissiekanaal in kaart brengt op het acceptoremissiekanaal en vice versa). Zie figuur 1B.
   OPMERKING: Beeldregistratie wordt uitgevoerd door de software; zie stap 6.1.4.
2. Meet het intensiteitsprofiel voor zowel donor- als acceptor-excitatielichtbronnen voor vlakveldcorrectie (d.w.z. corrigeren voor inhomogene excitatie over het hele gezichtsveld). Bereid hiertoe een monster voor met een hoge dichtheid van FRET-sondes en verkrijg eerst een beeld bij acceptorexcitatie, gevolgd door fotobleaching van de acceptor en daaropvolgende opname van een beeld bij donorexcitatie. Voor meer stabiliteit herhaalt u dit meerdere keren in verschillende steekproefgebieden. Zie figuur 1C,D. U kunt ook een monster opnemen dat is versierd met alleen het donormolecuul en een tweede monster dat is versierd met alleen de fluoroforen van de acceptor.
   OPMERKING: Flatfield-correctie wordt uitgevoerd door de analysesoftware; zie stap 8.1.2.
3. Registreer een monster met één molecuul (zoals in sectie 2) van een sonde zonder een acceptorfluoofoor om te bepalen of de donoremissie in het acceptorkanaal lekt.
   OPMERKING: Donorlekkage kan ook worden berekend op basis van de tijdsporen van de werkelijke sondes na het bleken van de acceptor. Als een voldoende aantal van dergelijke gebeurtenissen wordt geregistreerd, is geen aanvullende meting nodig. Beide opties worden ondersteund door de analysesoftware; zie Aanvullende informatie, rubriek 3.15.
4. Verkrijg opnames van een sonde zonder donorfluoofoor voor de kwantificering van directe acceptorexcitatie door de donorexcitatielichtbron.
   OPMERKING: Directe acceptor-excitatie kan ook worden afgeleid uit de tijdsporen van de werkelijke sondes na het bleken van de donor. Als een voldoende aantal van dergelijke gebeurtenissen wordt geregistreerd, is geen aanvullende meting nodig. Beide opties worden ondersteund door de analysesoftware; zie Aanvullende informatie, rubriek 3.15.
5. Registreer een monster met één molecuul met twee verschillende FRET-efficiënties om te corrigeren voor verschillende detectie-efficiënties van de donor- en acceptoremissiekanalen en verschillende kwantumopbrengsten van de kleurstoffen.
   OPMERKING: Dergelijke monsters kunnen bijvoorbeeld Holliday-juncties1 zijn, die fluctueren tussen twee conformaties, of DNA-staven met FRET-paren bevestigd op verschillende, goed gedefinieerde afstanden. Als sondes een hoge en voldoende constante FRET-efficiëntie hebben, kan de correctie ook worden berekend op basis van acceptorbleekgebeurtenissen van de tijdsporen van sondes, in welk geval geen aanvullende metingen nodig zijn. Beide opties worden ondersteund door de analysesoftware; zie Aanvullende informatie, rubriek 3.15.

4. Lokalisatie-algoritmen met één molecuul

OPMERKING: Verschillende analysestappen vereisen lokalisatie van één molecuul. Kies tussen een Gaussisch aanpassingsalgoritme30 en berekening met het middelpunt van de ^massa31, afhankelijk van de signaaldichtheid, achtergrond en signaal-ruisverhouding.

1. Om Gaussische aanpassing uit te voeren, kiest u het 3D-DAOSTORM30-algoritme via de respectieve gebruikersinterfaces.
   OPMERKING: 3D-DAOSTORM is ontworpen om gelijkmatige signalen met overlappende puntspreidingsfuncties te onderscheiden. Hoewel dit over het algemeen een voordeel is, komt het met een voorbehoud: enkele, heldere signalen worden af en toe geïdentificeerd als twee aangrenzende, wat het trackingalgoritme kan verwarren en kan resulteren in de detectie van twee korte trajecten in plaats van een enkele lange.
   Stel de volgende parameters in (zie de documentatie van de sdt-python ^library32, die de implementatie van het algoritme biedt) voor meer informatie.
   1. straal: stel de initiële σ waarde van de Gaussiaanse pasfunctie in pixels in, afhankelijk van de effectieve pixelgrootte.
   2. drempelwaarde: stel een minimale amplitude in (d.w.z. de helderste pixelwaarde, gecorrigeerd voor de geschatte lokale achtergrond) voor een maximum van de lokale intensiteit.
      OPMERKING: De drempel is misschien wel de belangrijkste parameter. Indien te laag ingesteld, kan ruis worden beschouwd als een fluorescentiesignaal en heldere signalen kunnen worden uitgerust met twee Galliërs. Als ze te hoog zijn ingesteld, passen dimsignalen niet.
   3. model: Ingesteld op 2d om cirkelvormige Gaussians te passen.
      OPMERKING: De andere modellen zijn niet van toepassing op de smFRET-gegevens.
   4. filter zoeken: Pas een filter toe voordat u lokale maxima vindt om ruis te verminderen, wat handig is in situaties met een lage signaal-ruisverhouding. Dit kan i) identiteit zijn: geen filter; ii) Crocker-Grier: bandpassfilter van Het Crocker-Grier-algoritme31,33; of iii) Gaussisch: een gaussiaanse vervaging met σ ingesteld door de sigma-parameter.
      OPMERKING: Voor Crocker-Grier moet de parameter feat. size ongeveer de straal zijn van een puntspreidingsfunctie in pixels.
      OPMERKING: De montage wordt uitgevoerd met behulp van ongefilterde onbewerkte gegevens.
   5. min. afstand: Plaats twee prospectieve signalen gescheiden door minder dan min. afstand pixels door een enkele Gauss.
      OPMERKING: Dit kan helpen in het bovengenoemde scenario waarin een helder signaal ten onrechte wordt gedetecteerd als twee aangrenzende signalen.
   6. groottebereik: Selecteer minimale en maximale σ van de pasvormen om detecties van valse signalen als gevolg van ruis te verwijderen.
2. Kies het Crocker-Grier-algoritme via de respectieve gebruikersinterfaces om center-of-mass-berekeningen uit te voeren (een verfijnd ^algoritme31 op basis van het idee van Crocker en ^Grier33).
   OPMERKING: Dit algoritme is zeer robuust, zelfs in scenario's met weinig signaal-ruis en in het omgaan met signalen met een reeks intensiteiten, maar kan niet precies passen bij moleculen met overlappende puntspreidingsfuncties.
   1. straal: stel de straal (in pixels) in van een schijf die groot genoeg is om de hele puntspreidingsfunctie te bevatten.
   2. signaal dorsen.: Stel de minimale amplitude in (helderste pixel boven geschatte achtergrond) voor een maximale lokale intensiteit die moet worden geanalyseerd.
      OPMERKING: Als het te laag is ingesteld, kan ruis worden beschouwd als een fluorescentiesignaal. Als ze te hoog zijn ingesteld, passen dimsignalen niet.
   3. massa dorsen.: Stel de minimale totale intensiteit (som van achtergrondgecorrigeerde pixelwaarden) in van een te analyseren signaal.
      OPMERKING: Dezelfde overwegingen als hierboven zijn van toepassing.

5. Software-initialisatie

1. Analysescripts downloaden. Navigeer in een Anaconda-prompt naar een map om de analyse op te slaan (met behulp van de opdracht cd ) en uit te voeren
   git kloon https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git doelmap
   1. Vervang de doelmap door een beschrijvende naam zoals 2021-06-14_Force-FRET-experiment.
      OPMERKING: De analysesoftware komt in deze map terecht; zorg ervoor dat deze map niet van tevoren bestaat. Het wordt aanbevolen om voor elk experiment een kopie van de analysescripts te downloaden. Op deze manier is het mogelijk om de analyse later opnieuw te bekijken, de gebruikte parameters op te roepen en wijzigingen aan te brengen.
2. Jupyter notitieboekjes kopiëren (01. Tracking.ipynb, 02. Analyse.ipynb, 03. Plots.ipynb) in de nieuw aangemaakte map (voortaan de hoofdmap genoemd). Als dit de eerste keer is dat u de software gebruikt, haalt u ze uit de submap notitieblokken van de hoofdmap.
   OPMERKING: Als vergelijkbare gegevenssets al zijn geanalyseerd, kan het kopiëren van de notitieblokken uit een eerder experiment een handige optie zijn, omdat de parameters mogelijk slechts licht zijn gewijzigd.
3. Start de JupyterLab-server door de volgende opdracht uit te voeren in de Anaconda-prompt om een webbrowservenster te openen waarin JupyterLab wordt weergegeven.
   jupyter lab
   OPMERKING: De browser is alleen de interface, terwijl het proces dat wordt uitgevoerd in de Anaconda-prompt het eigenlijke werk doet. Als gevolg hiervan heeft het sluiten van het browservenster slechts een minimaal effect; de sessie kan worden hersteld door toegang te krijgen tot http://localhost:8888. Als u echter het JupyterLab-proces in de prompt onderbreekt of de prompt sluit, wordt de analyse beëindigd, wat leidt tot het verlies van niet-opgeslagen werk.
4. Gebruik in het browservenster jupyterLab het linkerdeelvenster om naar de hoofdmap te navigeren. Dubbelklik op 01. Tracking.ipynb om het eerste notitieblok te starten. Zoek na het starten naar een nieuw tabblad dat verschijnt, waarin vakken, zogenaamde cellen, van Python-code worden weergegeven.
   OPMERKING: Alle Jupyter-notitieblokken bevatten opmerkingen waarin de functionaliteit van elke codecel wordt beschreven. Bovendien kan documentatie voor elke methodeaanroep worden weergegeven door de tekstcursor direct voor het openen te plaatsen ( en druk op Shift+Tab.
5. Zie figuur 2 voor een overzicht van het data-analyseproces.

Figuur 2: Overzicht van een typische analysepijplijn. Merk op dat filterstappen onderhevig zijn aan aanpassing volgens het experimentele ontwerp. Dit cijfer is gewijzigd van ¹⁶. Afkorting: FRET = Förster resonantie energieoverdracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

OPMERKING: Voorbeeldgegevens om de software uit te proberen kunnen worden gedownload van https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files

6. Lokalisatie, tracking en fluorescentie-intensiteitsanalyse van afzonderlijke moleculen (01. Tracking.ipynb).

1. Gebruik de 01. Tracking.ipynb Jupyter notebook voor de betrouwbare analyse van fluorescentie-intensiteitswaarden van single-molecule signalen, die is afgestemd op de precieze kwantificering, met name van zwakke signalen die vaak voorkomen in FRET-metingen (bijvoorbeeld als gevolg van lage donorsignalen bij hoge FRET-gebeurtenissen en vice versa).
   OPMERKING: Hiertoe wordt directe integratie van de pixelintensiteiten in de onbewerkte gegevens met correctie voor de lokale achtergrond geïmplementeerd. Voor screenshots van elke analysestap en beschrijving van functieaanroepparameters raadpleegt u de Aanvullende informatie.
   1. Geef de verlichtingsvolgorde op om de selectie van donor- en acceptor-excitatieframes mogelijk te maken, evenals frames voor beeldsegmentatie van opgenomen beeldreeksen.
      OPMERKING: Aangezien de software de verwerking van gegevens mogelijk maakt die zijn vastgelegd met willekeurige verlichtingsprotocollen, is het noodzakelijk om aan te geven welk frame in een beeldreeks is verkregen terwijl u opwindend bent welk type fluorofoor; zie Aanvullende informatie, rubriek 1.2, stap 3. De framenummers van de oorspronkelijke afbeeldingsreeks blijven behouden.
   2. Beschrijf en laad datasets. Analyseer meerdere datasets tegelijk, op voorwaarde dat ze zijn opgenomen met dezelfde verlichtingsinstellingen. Wijs een id en een patroon toe dat overeenkomt met de respectieve bestandsnamen van de afbeeldingsreeks aan elke gegevensset. Definieer daarnaast specifieke datasets voor speciale doeleinden, zoals opnames van fiduciale markers voor beeldregistratie, excitatielichtprofielen voor flatfieldcorrectie en optioneel donor-only en acceptor-only monsters om correctiefactoren te bepalen.
   3. Selecteer emissiekanalen in RAW-beelden als beide kanalen zijn opgenomen met één camera. Gebruik hiervoor de juiste grafische widget om de juiste regio's voor donor- en acceptoremissie te selecteren.
   4. Lokaliseer fiduciale markers in beide emissiekanalen en voer beeldregistratie uit. Gebruik de meegeleverde gebruikersinterface om de juiste parameters te vinden voor het lokalisatiealgoritme voor zowel de donor- als de acceptoremissiekanalen. Zie sectie 4 voor informatie over ondersteunde lokalisatiealgoritmen.
      OPMERKING: Willekeurig verdeelde fiduciale markers kunnen over emissiekanalen worden geïdentificeerd aan de hand van de ruimtelijke verdeling van hun naaste buren (figuur 1B). Een aangepaste implementatie van het algoritme dat wordt voorgesteld voor selectieve vlakverlichtingsmicroscopie34 in de sdt-python-bibliotheek komt automatisch overeen met de positie van elke marker in het donoremissiekanaal met de positie in het acceptor-emissiekanaal. Een transformatie T die de coördinaten van het donoremissiekanaal in kaart brengt met de coördinaten van het acceptor-emissiekanaal wordt gevonden via een lineaire kleinste kwadraten van een affiene transformatie naar de posities van de ^markers35. RANSAC wordt gebruikt om rekening te houden met uitschieters, zoals verkeerd overeenkomende posities uit de vorige stap.
   5. Lokaliseer FRET-sondes onafhankelijk van donor- en acceptorexcitatie in alle frames en voeg resultaten samen in één tabel met het oorspronkelijke framenummer, 2-dimensionale coördinaten en een id die verwijst naar het bronafbeeldingsbestand.
      OPMERKING: Hiertoe biedt de software gebruikersinterfaces om geschikte opties voor het lokalisatiealgoritme te vinden.
      1. Lokaliseer FRET-sondes bij donorexcitatie in de som van de beelden die zijn verkregen van donoremissie _ImDD en acceptoremissie ImDA, die nauwelijks afhankelijk zijn van de FRET-efficiëntie. Voor informatie over de opties voor het lokalisatiealgoritme, zie rubriek 4.
         OPMERKING: Elke somafbeelding wordt berekend door _ImDD te transformeren met behulp van de transformatie T die eerder is verkregen uit beeldregistratie en pixelgewijs is toegevoegd aan ImDA.
      2. Lokaliseer sondes bij acceptatie-excitatie in het acceptoremissiekanaal ImAA (zie sectie 4 voor details over de lokalisatiealgoritmen).
   6. Voer tracking- en fluorescentie-intensiteitsmetingen uit.

Figuur 3: Intensiteitsmeting met één molecuul. (A) Voor een fluorofoor op de oranje pixel wordt de ongecorrigeerde intensiteit _Iuncorr bepaald door de intensiteit van alle pixels in een schijf (gele en oranje pixels) op te tellen die groot genoeg is om alle pixels te dekken die door het signaal worden beïnvloed: . De lokale achtergrond wordt berekend als het gemiddelde van de pixels in een ring (blauwe pixels) rond de schijf: , waarbij nring het aantal pixels in de ring is. De fluorescentie-intensiteit I is het resultaat van het aftrekken van de achtergrond van de ongecorrigeerde intensiteit, I = _Iuncorr - b × ndisk, waarbij ndisk het aantal pixels in de schijf is. De cirkelradius wordt opgegeven via de parameter feat_radius van de trackingmethode. De breedte van de ring wordt gegeven door de parameter bg_frame. Als de puntspreidingsfunctie van het ene signaal overlapt met de achtergrondring van een ander signaal (onderste paneel), worden de betreffende pixels (rood) uitgesloten van lokale achtergrondanalyse. Als twee puntspreidingsfuncties elkaar overlappen, kunnen fluorescentie-intensiteiten niet betrouwbaar worden berekend en worden ze daarom weggegooid. (B, C) Simulaties tonen aan dat het toepassen van een Gaussiaanse onscherpte met een standaarddeviatie van 1 pixel de signaal-ruisverhouding verbetert tot een factor van bijna 2 bij lage fluorescentie-intensiteiten (B) en nauwelijks fouten introduceert (lichte onderschatting van minder dan 1%, (C))¹⁶. Bovendien is de relatieve fout (d.w.z. (_Imeas - _Itruth)/_Itruth, waarbij _Itruth de grondwaarheid is en _Imeas de uitkomst van de analyse) constant over het hele intensiteitsbereik en heft daarom op voor ratiometrische grootheden zoals FRET-efficiëntie en stoichiometrieën. Alle plots zijn gebaseerd op eerder gepubliceerd ^werk16. Afkortingen: SNR = signaal-ruisverhouding; FRET = Förster resonantie energieoverdracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Kies de juiste opties voor de trackpy36algorithm die wordt gebruikt om FRET-sondelokalisaties in trajecten te koppelen. Stel met name de maximale zoekafstand van het ene frame naar het volgende in en het aantal opeenvolgende frames waarvoor een signaal onopgemerkt kan blijven, wat kan optreden als gevolg van bleken of gemiste lokalisaties.
   OPMERKING: Deze hiaten worden opgevuld door interpolatie tussen voorgaande en volgende posities. Deze geïnterpoleerde posities worden gemarkeerd en alleen later gebruikt voor het uitlezen van intensiteitswaarden, maar niet voor diffusieanalyse. Sporen worden geanalyseerd in het coördinatensysteem van het acceptor-emissiekanaal. Voor fluorescentie-intensiteitsanalyse (stap 6.1.6.2) worden sporen bovendien omgezet in het coördinatensysteem van het donoremissiekanaal met behulp van de inverse transformatie ^T-1 verkregen via beeldregistratie (zie stap 6.1.4).
2. Selecteer opties voor het algoritme voor de berekening van de fluorescentie-intensiteit (zie figuur 3A voor meer informatie). Geef i) de straal van een schijf op die, wanneer gecentreerd op de positie van een signaal, alle pixels bevat die door dat signaal worden beïnvloed en ii) de breedte van een ring rond elke schijf die wordt gebruikt om de lokale achtergrond te bepalen.
   OPMERKING: Om ruis in de verkregen intensiteitsmetingen te verminderen, wordt een Gaussiaanse vervaging met een standaardafwijking van 1 pixel toegepast op de afbeeldingen (figuur 3B, C).

7. Gebruik de functionaliteit van de analysesoftware om aanvullende beeldgegevens van beeldreeksen te verwerken.
   1. Extra opgenomen beelden extraheren om segmentatie te vergemakkelijken (zie stap 2.2.1, gemarkeerd door s in de excitatiesequentie (zie Aanvullende informatie, rubriek 1.2, stap 3).
   2. Bepaal donor- en acceptor-excitatielichtprofielen over het hele gezichtsveld op basis van beelden die zijn opgenomen op een dicht gelabeld monster (zie stap 3.2).
      OPMERKING: Het gemiddelde per pixel wordt berekend op basis van de afbeeldingen om de lichtprofielen te berekenen. De camerabasislijn wordt afgetrokken. Afbeeldingen worden wazig met behulp van een Gaussisch filter om effecten als gevolg van onzuiverheden in het monster te verminderen. Ten slotte worden de resulterende afbeeldingen pixelgewijs gedeeld door hun maximale waarde om de profiel p(x,y) mapping coördinaten op het interval te krijgen [0,1].

7. Visualisatie van FRET trajecten (optioneel)

1. Gebruik de inspector-applicatie om tracks met één molecuul weer te geven in onbewerkte beeldgegevens en de bijbehorende fluorescentie-intensiteiten en schijnbare FRET-efficiënties en stoichiometrieën.
   OPMERKING: Dit is een waardevol hulpmiddel om de geldigheid van gekozen parameters te beoordelen en individuele tijdsporen handmatig te accepteren of af te wijzen. Zie Aanvullende informatie voor een screenshot en gedetailleerde gebruiksinformatie.

8. Analyse en filtering van gegevens met één molecuul (02. Analyse.ipynb)

1. Gebruik de 02. Analyse.ipynb Jupyter notebook voor analyse en filtering van de single-molecule data verkregen via de 01. Tracking.ipynb schrift. Zie de onderstaande stappen voor een typische analysepijplijn.
   OPMERKING: Verschillende wetenschappelijke vragen en experimentele ontwerpen kunnen aanpassingen van de instellingen vereisen. Het gebruik van Jupyter-notebooks maakt eenvoudige aanpassing mogelijk door analysestappen weg te laten, te herschikken en aan te passen. Voor screenshots van elke analysestap en beschrijving van functieaanroepparameters raadpleegt u Aanvullende informatie.
   1. Voer de eerste filterstappen uit.
      1. Gooi signalen met overlappende puntspreidingsfuncties weg omdat het moeilijk is om hun fluorescentie-intensiteiten betrouwbaar te bepalen.
      2. In het geval van inhomogene verlichting, accepteer alleen signalen die zich in goed verlichte gebieden binnen het gezichtsveld bevinden om een goede signaal-ruisverhouding te garanderen.
      3. Als u intramoleculaire FRET bestudeert, beperk de analyse dan tot die trajecten die aanwezig zijn vanaf het begin van de beeldsequentie om ervoor te zorgen dat alle bleekstappen worden geregistreerd en later goed kunnen worden geëvalueerd tijdens de stapsgewijze fotobleachinganalyse.
         OPMERKING: Bij het uitvoeren van experimenten met intermoleculaire FRET-sondes, waarbij donor- en acceptorfluooforen geen deel uitmaken van een voorgevormd complex, is het mogelijk dat het niet haalbaar is om de analyse te beperken tot aanvankelijk aanwezige trajecten.
   2. Voer vlakveldcorrectie uit, waarbij gebruik wordt gemaakt van de excitatielichtbronprofielen die zijn verkregen in stap 6.1.7.2 om de positieafhankelijke fluorescentie-intensiteitsvariaties veroorzaakt door inhomogene verlichting om te keren.
      OPMERKING: De fluorescentie-intensiteit I(x,y) van een sonde op de positie (x,y) wordt gecorrigeerd via ; zie figuur 1C,D.
   3. Bereken de schijnbare FRET-efficiëntie-Eapp (d.w.z. de fractie energie die wordt overgedragen van de donorfluoofoor naar de acceptorfluoofoor) en de schijnbare stoichiometrie-sapp (d.w.z. het aantal donorfluorforen gedeeld door het totale aantal fluoroforen binnen een diffractie-beperkte plek).
      OPMERKING: Door E versus S voor elk gegevenspunt uit te zetten, is het mogelijk om veranderingen in de gemeten FRET-efficiëntie als gevolg van verandering in donor-acceptorafstand te onderscheiden van veranderingen als gevolg van veranderingen in de stoichiometrie18. Dit maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen E = 0 als gevolg van kleurstofscheiding van E = 0 als gevolg van de afwezigheid van een actieve acceptor. E-S-percelen worden tijdens de analyse gebruikt als een instrument voor kwaliteitsbeoordeling; zie figuur 4 als voorbeeld.
   4. Voer stapsgewijze analyse uit van fotobleaching voor de discriminatie tussen enkelmoleculaire sondes en aggregaten. Kies ervoor om een van de volgende opties te accepteren.
      OPMERKING: Hiertoe past de analysesoftware een aangepaste ^{implementatie32} van het changepointdetectiealgoritme ^PELT37 afzonderlijk toe op de fluorescentie-intensiteit bij donorexcitatie (_IDD + IDA) en acceptorexcitatie (IAA).
      1. Kies optie 1, waarbij de acceptor fluorofoor in één stap bleekt terwijl de donor geen gedeeltelijke bleeking vertoont (d.w.z. er is geen bleekstap naar niet-nulintensiteit).
         OPMERKING: Deze optie verwerpt verder trajecten waarbij de donor in één stap voor de acceptant bleekt. Optie 1 heeft de voorkeur in het geval van hoge acceptatiefotobleachingsnelheden.
      2. Kies optie 2, waarbij de donor in één stap bleekt terwijl er geen gedeeltelijke acceptorbleking is.
         OPMERKING: Deze optie verwerpt verder trajecten waarbij de donor in één stap na de acceptor bleekt. Optie 2 heeft de voorkeur in het geval van hoge donorfotobleachingspercentages.
      3. Kies optie 3, waarbij fluorofoor in één stap bleekt, terwijl de andere niet gedeeltelijk bleekt.
         OPMERKING: Optie 3 biedt een hogere flexibiliteit dan opties 1 en 2 en zou de voorgestelde voorkeur voor gegevensanalyse zijn.
      4. Kies optie 4, waarbij donor- en acceptorfluooforen eenstapsfotobleaching of helemaal geen fotobleaching vertonen.
         OPMERKING: Optie 4 heeft de voorkeur in het geval van lage fotobleachingsnelheden.
   5. Bereken de correctiefactoren voor donoremissielekkage in het α van het acceptorkanaal, directe acceptorexcitatie δ, detectie-efficiëntie γ en excitatie-efficiëntie β ¹⁷.
   6. Gebruik de correctiefactoren om de FRET-efficiëntie E te berekenen uit de schijnbare efficiëntie-Eapp en de stoichiometrie S uit de schijnbare stoichiometrie-sapp.
   7. Voer verdere filterstappen uit. Selecteer alleen gegevenspunten van vóór de eerste bleekgebeurtenis in elk traject. Accepteer bovendien alleen trajecten met ten minste 75% van de gegevenspunten die voldoen aan 0,35 < S < 0,6 om de analyse te beperken tot sondes met één molecuul (getallen zijn instelbaar).
      OPMERKING: De boven- en ondergrenzen voor moeten worden gekozen op basis van de spreiding van de populatie van belang versus de populaties die van de analyse moeten worden uitgesloten (bijv. populaties die alleen donoren en alleen-acceptorpopulaties zijn). Op basis van ervaring bleek 0,35 < S < 0,6 een goede keuze voor veel experimentele situaties.
   8. Voer beeldsegmentatie uit via globale of adaptieve ^{drempelmethoden35} op de juiste hulpbeelden (zie stappen 2.2.1 en 6.1.7) om de analyse te beperken tot verschillende gebieden binnen het gezichtsveld.
      OPMERKING: Dit maakt bijvoorbeeld exclusieve evaluatie mogelijk van sondes die zich in een cel-SLB-interface of op een patroonstructuur bevinden.

9. Uitzetten van de resultaten en verdere analyse (03. Plot.ipynb)

OPMERKING: Raadpleeg Aanvullende informatie voor schermafbeeldingen van het Jupyter-notitieblok en een beschrijving van functieaanroepparameters.

1. Maak E-S-plots om te controleren of signalen van onjuiste stoichiometrie correct zijn geïdentificeerd en verwijderd.
2. Plot histogrammen van FRET-efficiënties om een goed onderbouwd overzicht te geven van de FRET-efficiëntieverdelingen. Groepeer de histogrammen voor een gemakkelijke vergelijking van resultaten van verschillende experimenten.
3. Evalueer de gegevens verder (bijv. diffusieanalyse, conversie van FRET-efficiëntie naar krachten in experimenten met behulp van moleculaire krachtsensoren of overgangsanalyse) in het notitieblok en profiteer van wetenschappelijke Python-bibliotheken.
   OPMERKING: Gegevens kunnen ook in veel bestandsindelingen worden geëxporteerd als invoer voor andere analysesoftware.

Results

Een verscheidenheid aan informatie op laag en hoog niveau kan worden geëxtraheerd uit smFRET-tracks, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag van het experiment. Hier worden voorbeelden gegeven van analysepijplijnen met analoge en digitale sondes: respectievelijk een op peptiden gebaseerde moleculaire ^{krachtsensor16} en een DNA-sonde met stochastische schakeling van zijn ^{conformatie38}. Zie figuur 5 voor het ontwerp- en werkingsprincipe van deze sondes.

Nadat de lokalisatie- en trackingalgoritmen zijn uitgevoerd zoals beschreven in het protocol, biedt het pakket meerdere gegevensvisualisatietools om de initiële parameters en daaropvolgende filterstappen te optimaliseren: (i) visualisatie van individuele smFRET-gebeurtenissen, (ii) optionele beeldsegmentatie om gegevens in bepaalde interessegebieden te analyseren, (iii) monitoring van filterstappen via FRET-efficiëntie versus stoichiometrie (E-S) plots. De visualisatie van de single-molecule data is weergegeven in figuur 6.

Ten slotte worden de gefilterde FRET-gebeurtenissen weergegeven door een E-S-plot en een FRET-efficiëntiehistogram (figuur 4). De E-S plot is een handig hulpmiddel voor het optimaliseren van de bovengenoemde filterstappen en het onderzoeken van het eindresultaat. Gedeeltelijk gebleekte of onvolledig gelabelde FRET-sensoren kunnen worden uitgesloten door hun stoichiometriewaarde. Mobiliteitsparameters kunnen worden onderzocht door een individueel trajectpad uit te zetten in een x-y plot (figuur 6) of een gemiddelde vierkante verplaatsing (MSD) plot (figuur 4). De eerste methode is vooral nuttig voor het onderscheiden van mobiele van geïmmobiliseerde gebeurtenissen, terwijl de laatste wordt gebruikt om de diffusiecoëfficiënt te berekenen.

Figuur 4: Voorbeeldige output. (A) De FRET-efficiëntie wordt uitgezet versus stoichiometrie (E-S-plot) voor een populatie van de moleculaire krachtsensor (linkerpaneel) die een door glas ondersteunde lipide-bilaag versiert en wordt gespannen door een T-cel. Er is slechts één populatiewolk zichtbaar. Het respectievelijke histogram van FRET-efficiënties illustreert het verschil tussen een krachtsensorpopulatie in aan- en afwezigheid van cellen (middelste paneel). Er kan geen verschuiving naar lagere FRET-efficiëntie van de sensorpopulatie in aanwezigheid van T-cellen worden waargenomen, wat wijst op weinig tot geen krachtafhankelijke uitrekken van de sensormodule. De MSD-plot van deze experimentele omstandigheden bevestigt dat de krachtsensorpopulatie onder een T-cel aanzienlijk langzamer beweegt dan hun ongebonden tegenhangers (rechterpaneel). (B) Dezelfde analyse werd uitgevoerd met Holliday junction DNA-sensor die een door glas ondersteunde vloeibare lipide bilayer decoreerde. De E-S plot toont duidelijk twee populaties, die ook zichtbaar zijn in het FRET efficiëntie histogram. De MSD-plot geeft de aanwezigheid aan van één snel bewegende sensorpopulatie. Afkortingen: FRET = Förster resonantie energieoverdracht; MSD = gemiddelde vierkante verplaatsing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Ontwerp en werkingsprincipe van intramoleculaire FRET-sondes. (A) Analoge peptidesensor voor kwantificering van mechanische moleculaire krachten. De donor- en acceptorfluooforen zijn covalent bevestigd aan beide uiteinden van de peptide-ruggengraat. De sensormodule is plaatsspecifiek bevestigd aan een specifiek ligand, dat op zijn beurt een celbewonende oppervlaktereceptor van belang bindt (hier een antilichaamfragment dat specifiek de bètaketen van de T-celreceptor herkent). Bij receptor-ligandbinding wordt kracht uitgeoefend en de sensormodule strekt zich uit en deinst uiteindelijk terug na de splitsing van de binding. Dit paneel is aangepast van ¹⁶. (B) Digitale DNA-sensor voor kwantificering van FRET-overgangen. De FRET-sensor bestaat uit vier DNA-strengen die een Holliday-junctie vormen. De donor en acceptor fluorofoor zijn covalent bevestigd aan twee strengen. Holliday-juncties veranderen vaak hun bevleesdheid afhankelijk van de omringende bufferomstandigheden. De stochastische schakeling van deze conformaties kan worden bewaakt door de FRET-efficiëntie van individuele sondes te kwantificeren. Afkortingen: TCR = T cell receptor; FRET = Förster resonantie energieoverdracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Voorbeelden van lokalisatie en tracking van FRET-sondes. (A) De FRET-efficiëntie en stoichiometrie van individuele gebeurtenissen worden berekend door de intensiteit van de donorfluoofoor bij donorexcitatie (D → D), de acceptorfluoofoor bij donorexcitatie (D → A) en de acceptorfluoofoor bij acceptorexcitatie (A → A) te kwantificeren. Nearest neighbor filtering voorkomt bias door overlappende puntspreidingsfuncties van dichte emitters. Beeldsegmentatie stelt de gebruiker in staat om bepaalde smFRET-gebeurtenissen te kiezen die gelokaliseerd zijn binnen een interessegebied (bijvoorbeeld een cel of een micropattern). Als voorbeeld van beeldsegmentatie werden T-cellen gekleurd met Fura-2 (links weergegeven) en onderworpen aan adaptieve drempels om de celranden te identificeren (oranje stippellijn). Schaalstaven = 5 μm. (B) smFRET-trajecten met behulp van de moleculaire krachtsensor. Individuele trajecten kunnen worden uitgezet in het x-y-vlak , waarbij hun diffusiegedrag en lokalisatie worden gevisualiseerd (linkerpaneel). Bovendien kunnen de intensiteiten van elk traject in de loop van de tijd worden uitgezet om FRET-overgangen of bleekstappen te identificeren (het middelste paneel toont het rode traject vanaf het linkerpaneel). De resulterende FRET-efficiëntie en stoichiometrie kunnen op dezelfde manier worden gevisualiseerd (rechterpaneel). (C) smFRET-trajecten met behulp van de Holliday junction DNA-sensor. HBSS + 12 mM _MgCl2 werd gebruikt als buffer tijdens de metingen. Afgezien van de schijnbare acceptorbleekstap nabij het sequentie-einde van deze voorbeelden, kan de frequentie van FRET-overgangen voor elke sensor worden bepaald. De Holliday-juncties schakelen hun conformatie met een hoge frequentie, terwijl de moleculaire krachtsensor geen FRET-overgangen vertoont. Deze informatie maakt het mogelijk om de experimentele omstandigheden, zoals de vertraging tussen de frames, aan te passen om het aantal waargenomen overgangen te vergroten of te verminderen. Afkortingen: FRET = Förster resonantie energieoverdracht; smFRET = single-molecule FRET; HBSS = Hank's gebalanceerde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende informatie: Lokalisatie en tracking van afzonderlijke moleculen (01. Tracking.ipynb). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Dit artikel beschrijft een pijplijn voor de geautomatiseerde registratie en kwantitatieve analyse van smFRET-gegevens afkomstig van mobiele maar aan het oppervlak vastgebonden sondemoleculen. Het vormt een aanvulling op de twee overheersende benaderingen van smFRET-experimenten, waarbij ofwel oppervlakte-geïmmobiliseerde sondes of sondes diffunderen in oplossing in en uit een confocale ^{excitatievolume17}. Het biedt de juiste FRET-efficiëntie en de moleculaire posities als functie van de tijd. Het kan daarom worden gebruikt als input voor gespecialiseerde analyseprogramma's, bijvoorbeeld om overgangskinetiek1, FRET-histogrammen39 of tweedimensionale ^diffusie22 te kwantificeren.

De software wordt uitgebracht onder een gratis en open-source licentie die is goedgekeurd door het Open Source Initiative en die de gebruiker het eeuwigdurende recht op gratis gebruik, wijziging en herdistributie verleent. Github is gekozen als ontwikkelings- en distributieplatform om het zo gemakkelijk mogelijk te maken om de software te verkrijgen en deel te nemen aan het ontwikkelingsproces door bugs te melden of ^code40 bij te dragen. Geschreven in Python, is de software niet afhankelijk van propriëtaire componenten. De keuze voor Jupyter-notebooks als gebruikersinterfaces vergemakkelijkt de inspectie van gegevens bij elke analysestap en maakt het mogelijk om de pijplijn specifiek voor het experimentele systeem aan te passen en uit te breiden. De sdt-python ^library32 dient als basis en implementeert functionaliteit om fluorescentiemicroscopiegegevens te evalueren, zoals lokalisatie van één molecuul, diffusieanalyse, fluorescentie-intensiteitsanalyse, kleurkanaalregistratie, colocalisatieanalyse en ROI-verwerking.

In principe kan single-particle tracking worden uitgevoerd in een-, twee- of driedimensionale systemen. Hier werd de single-molecule analysepijplijn afgestemd op de studie van 2D mobiele systemen. Deze keuze weerspiegelt de beschikbaarheid van eenvoudige systemen, zoals planair ondersteunde lipide bilayers (SLBs), om mobiele fluorescerende sondes te presenteren. Dergelijke lipide dubbellaagssystemen zijn meestal samengesteld uit twee of meer fosfolipiden moieties, waarbij de bulkfractie de belangrijkste fysisch-chemische parameters van de SLB bepaalt (zoals fase en viscositeit), en de kleine fractie zorgt voor hechtingsplaatsen voor biomoleculen. Deze hechtingsplaatsen kunnen gebiotinyleerde fosfolipiden zijn voor op avidine of streptavidin gebaseerde eiwitplatforms of nikkel-NTA geconjugeerde fosfolipiden voor eiwitplatforms met histidinetags41. De keuze van het geschikte platform voor het koppelen van eiwitten aan de SLB hangt af van de wetenschappelijke vraag. Lezers kunnen de literatuur16,38,42 raadplegen voor voorbeelden van succesvol toegepaste strategieën. De dichtheid van sondes in het monster moet voldoende laag zijn om overlappende puntspreidingsfuncties te voorkomen; doorgaans worden minder dan 0,1 moleculen per ^μm2 aanbevolen. Zie de sectie representatieve resultaten (met name figuur 6) voor een voorbeeld met een geschikte sondedichtheid. De analysemethode is ook toepasbaar op enkele fluorescerend gelabelde eiwitmoleculen die diffunderen in het plasmamembraan van levende cellen.

Een cruciaal aspect van smFRET-experimenten is de productie en karakterisering van de FRET-sondes zelf. Bij het kiezen van fluoroforen voor een FRET-paar moet hun Förster-straal overeenkomen met de verwachte ^{interkleurafstanden43}. Kleurstoffen die bestand zijn tegen fotobleaching hebben de voorkeur omdat ze lange tijd sporen opleveren. Voor verhoogde bleeksnelheden kan echter één fluorofoorsoort worden gebruikt om multiemittergebeurtenissen afkomstig van geglokaliseerde moleculen te herkennen via stapsgewijze fotobleachinganalyse; zie stap 8.1.4 in de protocolsectie. Fluorofoorparen moeten plaatsspecifiek en covalent aan de betreffende moleculen worden bevestigd en intra- of intermoleculaire FRET-paren vormen.

Het combineren van smFRET met andere direct beschikbare technieken kan de ruimtelijke resolutie verhogen tot boven de diffractielimiet (via ^STED44). Het hier gepresenteerde smFRET-trackingalgoritme verbreedt de toepasbaarheid van de aanpak op nieuwe experimentele instellingen en modelsystemen. Dit omvat studies van (i) kinetische veranderingen in de stoichiometrie van mobiele biomoleculen, (ii) dynamische associatie van mobiele biomoleculen, (iii) de snelheid van enzymatische reacties van vrij diffunderende reactanten, en (iv) de kinetiek van conformationele veranderingen van mobiele biomoleculen. De eerste twee voorbeelden vereisen modelsystemen die intermoleculaire FRET laten zien, d.w.z. donor en acceptor worden geconjugeerd om biomoleculaire entiteiten van belang te scheiden. Deze laatste voorbeelden kunnen gebruik maken van biosensoren die donor en acceptor binnen dezelfde moleculaire entiteit dragen (intramoleculaire FRET).

Intramoleculaire FRET-gebaseerde sensoren kunnen inzicht geven in intrinsieke conformatieveranderingen van biomoleculen1,2,3,4, conformationele veranderingen veroorzaakt door endogene of externe krachtbelasting (moleculaire ^{krachtsensoren16}) of ionenconcentraties in de nano-omgeving zoals ^calcium45 en pH46 . Afhankelijk van het modelsysteem en het gewenste verankeringsplatform kunnen dergelijke smFRET-gebeurtenissen in 2D of 3D worden gevolgd: (i) planaire tracking van smFRET-gebeurtenissen kan worden gebruikt voor de kwantificering van receptor-ligandinteractietijden binnen een plasmamembraan, de associatie van membraan-verankerde signaalversterkingscascades en de stoichiometrieveranderingen van oppervlaktereceptoren; ii) volumetracking van smFRET-voorvallen kan worden gebruikt voor intra- of intermoleculaire FRET-sondes in levende cellen of in in vitro gereconstitueerde systemen.

De smFRET-trackingmethode is voornamelijk ontwikkeld met intramoleculaire FRET-sondes in gedachten. Deze sondes hebben een vast en bekend aantal fluorescerende labels, een feit dat werd gebruikt om gegevens van geagglomereerde en onjuist gesynthetiseerde (bijv. Onvolledig gelabelde) moleculen af te wijzen, evenals van sondes waar een van de fluoroforen is gefotobleekt. Door de filterstappen aan te passen, kan de methode echter ook worden toegepast op intermoleculaire FRET-sondes. In plaats van alleen moleculen met een enkele donor en een enkele acceptorfluoofoor te accepteren, zou men bijvoorbeeld de ruimtelijke trajecten van donor- en acceptorkleurstoffen kunnen onderzoeken en bijvoorbeeld kunnen selecteren voor co-diffusie van donor-acceptortrajecten.

Omdat het 3D-DAOSTORM-algoritme ondersteuning biedt voor het bepalen van de positie van een signaal langs de optische as via het astigmatisme als gevolg van een cilindrische lens in het emissiestraalpad, kunnen 3D-experimenten eenvoudig worden geïntegreerd in de analysepijplijn. In dit geval zou het acceptorsignaal bij acceptorexcitatie dienen om de stoichiometrie en de axiale positie te bepalen. De analysesoftware kan ook worden gebruikt om gegevens van experimenten met geïmmobiliseerde sondes te evalueren door gebruik te maken van de grote mate van automatisering en filterschema's. In feite werden smFRET-efficiëntiedatasets van Holliday-juncties geïmmobiliseerd op gel-fase ^bilayers38 geanalyseerd met behulp van een vroege versie van de software.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)	Avanti Polar Lipids	790404P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375P
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457P
α Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective	Zeiss	000000-1084-514
Axio Observer microscope body	Zeiss
Bandpass filter	Chroma Technology Corp	ET570/60m	donor emissiefilter
Bandpass filter	Chroma Technology Corp	ET675/50m	acceptor emissiefilter
conda-forge	conda-forge community		community-maintained Python-pakketenrepository voor Anaconda/miniconda
Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5	MENZEL
Dichroic mirror	Semrock Inc	FF640-FDi01-25×36	scheiding van donor- en acceptoremissie
Dichroic mirror (quad band)	Semrock Inc	Di01-R405/488/532/635-25×36	scheiding van excitatie- en emissielicht
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537
FCS	Sigma-Aldrich	F7524	voor beeldvormingsbuffer
fret-analysis	Schütz-groep bij TU Wien		Python-pakket voor smFRET-gegevensanalyse; versie 3
Fura-2 AM	Thermo Fisher Scientific	11524766
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	voor beeldvormingsbuffer
iBeam Smart 405-S 405 nm laser	Toptica Photonics AG
iXon Ultra 897 EMCCD-camera	Andor Technology Ltd
Lab-Tek-kamers (8 putjes)	Thermo Fisher Scientific	177402PK	voor monstervoorbereiding en beeldvorming
Millenia Prime 532 nm laser	Spectra Physics
miniconda	Anaconda Inc.		Python 3-distributie. Min. versie: 3.7
Monovalente streptavidin (plasmiden voor bacteriële expressie)	Addgene	20860 & 20859
OBIS 640 nm laser	Coherent Inc	1185055
Optosplit II	Cairn Research
Ovalbumine	Sigma-Aldrich	A5253	voor beeldvormingsbuffer
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-002
sdt-python	Schütz-groep bij TU Wien		Python-bibliotheek voor gegevensanalyse; versie 17
TetraSpek bead size kit	Thermo Fisher Scientific	T14792	Willekeurig verdeelde, geïmmobiliseerde fiduciale markeringen voor beeldregistratie
USC500TH-ultrasoonbad	VWR		voor SUV-vorming