Methodenartikel

Lichtgestuurde fermentaties voor microbiële chemische en eiwitproductie

4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63269

⸱

22 maart 2022

 ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2The Andlinger Center for Energy and the Environment, Princeton University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4High Meadows Environmental Institute, Princeton University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Optogenetische controle van microbieel metabolisme biedt flexibele dynamische controle over fermentatieprocessen. Het protocol hier laat zien hoe blauw licht-gereguleerde fermentaties voor chemische en eiwitproductie op verschillende volumetrische schalen kunnen worden opgezet.

Samenvatting

Microbiële celfabrieken bieden een duurzaam alternatief voor het produceren van chemicaliën en recombinante eiwitten uit hernieuwbare grondstoffen. Het overbelasten van een micro-organisme met genetische modificaties kan echter de fitheid en productiviteit van de gastheer verminderen. Dit probleem kan worden opgelost door dynamische controle te gebruiken: induceerbare expressie van enzymen en routes, meestal met behulp van chemische of op voedingsstoffen gebaseerde additieven, om cellulaire groei en productie in evenwicht te brengen. Optogenetica biedt een niet-invasieve, zeer afstembare en omkeerbare methode voor het dynamisch reguleren van genexpressie. Hier beschrijven we hoe lichtgecontroleerde fermentaties van gemanipuleerde Escherichia coli en Saccharomyces cerevisiae kunnen worden opgezet voor de productie van chemicaliën of recombinante eiwitten. We bespreken hoe licht op geselecteerde tijden en doseringen kan worden toegepast om microbiële groei en productie te ontkoppelen voor verbeterde fermentatiecontrole en productiviteit, evenals de belangrijkste optimalisatie-overwegingen voor de beste resultaten. Daarnaast beschrijven we hoe lichtregelaars kunnen worden geïmplementeerd voor bioreactorexperimenten op laboratoriumschaal. Deze protocollen vergemakkelijken de toepassing van optogenetische controles in gemanipuleerde micro-organismen voor verbeterde fermentatieprestaties.

Inleiding

Optogenetica, de controle van biologische processen met lichtgevoelige eiwitten, biedt een nieuwe strategie om microbiële fermentaties dynamisch te beheersen voor chemische en eiwitproductie1,2. De belasting van gemanipuleerde metabole routes en de toxiciteit van sommige tussenproducten en producten schaadt vaak de celgroei3. Dergelijke spanningen kunnen leiden tot een slechte accumulatie van biomassa en verminderde productiviteit3. Deze uitdaging kan worden aangepakt door fermentaties tijdelijk te verdelen in een groei- en productiefase, die metabolische middelen besteden aan respectievelijk biomassaaccumulatie of productsynthese4. We hebben onlangs aangetoond dat de overgang van groei naar productie in deze tweefasige gisting kan worden geïnduceerd met veranderingen in verlichtingsomstandigheden5,6,7. De hoge tonijnbaarheid, omkeerbaarheid en orthogonaliteit van lichtinputs8 bieden unieke voordelen voor lichtgecontroleerde fermentaties die moeilijk of onmogelijk te repliceren zijn met chemische inductoren die worden gebruikt bij dynamische controle van conventionele tweefasige fermentaties4,9,10,11.

Het blauw-licht responsieve EL222-eiwit afgeleid van Erythrobacter litoralis is gebruikt om verschillende optogenetische circuits te ontwikkelen voor metabole engineering in Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. EL222 bevat een licht-zuurstof-spanningssensor (LOV) domein dat een conformatieverschuiving ondergaat bij activering van blauw licht (465 nm), waardoor het kan binden aan zijn verwante DNA-sequentie (C120) 13. Het fuseren van EL222 met het virale VP16-activeringsdomein (VP16-EL222) resulteert in een blauw-licht responsieve transcriptiefactor die reversibel genexpressie in S. cerevisiae7 en andere organismen14 van de synthetische promotor PC120 kan activeren. Verschillende circuits op basis van EL222 zijn ontwikkeld en gebruikt voor chemische productie in S. cerevisiae, zoals het basis lichtgeactiveerde OptoEXP-systeem7, waarin het gen van belang direct tot expressie komt uit PC120 (figuur 1A). Bezorgdheid over lichtpenetratie bij de hoge celdichtheden die typisch zijn in de productiefase van fermentaties motiveerde ons echter om omgekeerde circuits te ontwikkelen die in het donker worden geïnduceerd, zoals de OptoINVRT- en OptoQ-INVRT-circuits (figuur 1B) 5,7,13. Deze systemen maken gebruik van de galactose (GAL) of quinic acid (Q) regulons van respectievelijk S. cerevisiae en N. crassa, en regelen hun overeenkomstige repressoren (GAL80 en QS) met VP16-EL222, om genexpressie in het licht te onderdrukken en sterk te induceren in het donker. De combinatie van OptoEXP- en OptoINVRT-circuits resulteert in bidirectionele controle van genexpressie, waardoor tweefasige fermentaties mogelijk zijn waarbij de groeifase wordt geïnduceerd met blauw licht en de productiefase met duisternis (figuur 2A)5,7.

Het gebruik van licht in plaats van duisternis om genexpressie tijdens de productiefase te induceren, zou de mogelijkheden van optogenetische controles aanzienlijk uitbreiden, maar zou ook het overwinnen van de lichtpenetratiebeperkingen van de hoge celdichtheden vereisen die typisch worden aangetroffen in deze fase van fermentatie. Hiertoe hebben we circuits ontwikkeld, bekend als OptoAMP en OptoQ-AMP, die de transcriptionele respons op stimulatie van blauw licht versterken. Deze circuits gebruiken wild-type of overgevoelige mutanten van VP16-EL222 om de productie van de transcriptionele activatoren Gal4p of QF2 van respectievelijk de GAL- of Q-regulons te regelen, waardoor een verhoogde gevoeligheid en sterkere genexpressie met licht12,13 wordt bereikt (figuur 1C). OptoAMP-circuits kunnen volledige en homogene lichtinductie bereiken in 5 L bioreactoren met een optische dichtheid (gemeten bij 600 nm; OD600) waarden van ten minste 40 met slechts ~ 0,35% verlichting (5% lichtdosis op slechts ~ 7% van het bulkoppervlak). Dit toont een hogere mate van gevoeligheid in vergelijking met OptoEXP, die bijna 100% verlichting vereist12. Het vermogen om effectief genexpressie te induceren met licht bij hoge celdichtheden opent nieuwe mogelijkheden voor dynamische controle van fermentaties. Dit omvat operationele fermentaties in meer dan twee temporele fasen, zoals driefasige fermentaties, waarin groei-, inductie- en productiefasen worden vastgesteld met unieke lichtschema's om de chemische productie te optimaliseren (figuur 2B)12.

figure-introduction-1
Figuur 1: Optogenetische circuits voor dynamische controle van S. cerevisiae. De OptoEXP-, OptoINVRT- en OptoAMP-circuits zijn gebaseerd op het lichtgevoelige VP16-EL222-systeem. (A) In het OptoEXP-circuit veroorzaakt blootstelling aan blauw licht een conformatieverandering en dimerisatie van VP16-EL222, die een DNA-bindend domein blootlegt en transcriptie van PC120 mogelijk maakt. De figuur is aangepast van Zhao et al.7. (B) OptoINVRT-circuits maken gebruik van de GAL (afgebeelde) of Q-regulons om expressie in het donker te induceren. In GAL-gebaseerde circuits worden VP16-EL222 en GAL4 constitutief uitgedrukt, terwijl PC120-aandrijvingen de expressie van de GAL80-onderdrukker (in Q-gebaseerde circuits worden GAL4 en GAL80 vervangen door respectievelijk QF2 en QS, en een synthetische QUAS-bevattende promotor wordt gebruikt in plaats van een GAL-promotor). Bij licht voorkomt Gal80p activering van het interessante gen van PGAL1. In het donker wordt GAL80 niet tot expressie gebracht en snel gedegradeerd door het samen te smelten tot een constitutief degron-domein (klein bruin domein), wat activering van PGAL1 door Gal4p mogelijk maakt. De figuur is aangepast van Zhao et al.5. (C) OptoAMP-circuits gebruiken ook VP16-EL222 om de GAL (afgebeeld) of Q-regulons te regelen. In deze circuits wordt de GAL80-repressor (of QS) constitutief uitgedrukt en versmolten tot een fotogevoelig degron (klein blauw domein) voor strakke repressie in het donker. PC120 en een overgevoelige VP16-EL222 mutante controle expressie van GAL4 (of QF2) met licht, dat PGAL1 (of een QUAS-bevattende promotor) sterk activeert in het licht. GAL-afgeleide circuits kunnen gebruik maken van gemanipuleerde vormen van PGAL1, zoals PGAL1-M of PGAL1-S, die een verhoogde activiteit hebben, evenals wild-type promotors gecontroleerd door de GAL regulon (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7). De figuur is aangepast van Zhao et al.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-introduction-2
Figuur 2: Twee- en driefasige fermentaties door de tijd heen. (A) Tweefasige fermentaties met omgekeerde circuits bestaan uit een lichtgedreven groeifase en een donkere productiefase. In de groeifase hoopt biomassa zich op naarmate de productieroute onderdrukt blijft. Bij het bereiken van de gewenste OD600 worden cellen naar het donker verplaatst om zich metabolisch aan te passen voordat ze opnieuw worden besteed aan verse media voor de productiefase. (B) In een driefasig proces worden de groei-, incubatie- en productiefasen gedefinieerd door unieke lichtschema's, die kunnen bestaan uit een donkere groeiperiode, gepulseerde incubatie en volledig verlichte productiefase. Figuur gemaakt met Biorender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Optogenetische circuits zijn ook ontwikkeld voor dynamische controle van chemische en eiwitproductie in E. coli. OptoLAC-circuits regelen de bacteriële LacI-repressor met behulp van het lichtgevoelige pDawn-circuit, dat is gebaseerd op het YF1 / FixJ-tweecomponentensysteem6 (figuur 3). Net als OptoINVRT5 zijn OptoLAC-circuits ontworpen om genexpressie in het licht te onderdrukken en in het donker te induceren. Expressieniveaus met behulp van OptoLAC-circuits kunnen overeenkomen met of hoger zijn dan die bereikt met standaard isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inductie, waardoor de sterkte van chemische inductie behouden blijft en tegelijkertijd verbeterde tonijnbaarheid en omkeerbaarheid wordt geboden6. Daarom maken OptoLAC-circuits effectieve optogenetische controle mogelijk voor metabole engineering in E. coli.

figure-introduction-3
Figuur 3: OptoLAC-circuits voor dynamische controle van E. coli. De OptoLAC-circuits passen het pDawn-systeem en het lac operon aan om activering in het donker en onderdrukking in het licht te bereiken. In het donker fosforyleert YF1 FixJ, dat vervolgens de PFixK2-promotor activeert om de cI-repressor tot expressie te brengen. De cI-repressor voorkomt expressie van de lacI-repressor van de PR-promotor , waardoor transcriptie van het betreffende gen van een lacO-bevattende promotor mogelijk is. Omgekeerd vermindert blauw licht de netto kinaseactiviteit van YF1, waardoor FixJ-fosforylering en dus cI-expressie wordt omgedraaid, wat de expressie van lacI onderdrukt en expressie van de lacO-bevattende promotor voorkomt. Het cijfer is aangepast van Lalwani et al.6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

We beschrijven hier de basisprotocollen voor lichtgecontroleerde fermentaties van S. cerevisiae en E. coli voor chemische of eiwitproductie. Voor zowel gist als bacteriën richten we ons eerst op fermentaties met een lichtgedreven groeifase en een door duisternis geïnduceerde productiefase mogelijk gemaakt door OptoINVRT- en OptoLAC-circuits. Vervolgens beschrijven we een protocol voor een driefasige (groei, inductie, productie) lichtgestuurde fermentatie mogelijk gemaakt door OptoAMP-circuits. Verder beschrijven we hoe we optogenetisch gecontroleerde fermentaties kunnen opschalen van microplaten naar bioreactoren op laboratoriumschaal. Met dit protocol willen we een complete en gemakkelijk reproduceerbare gids bieden voor het uitvoeren van lichtgestuurde fermentaties voor chemische of eiwitproductie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Lichtgestuurde chemische productie met behulp van het S. cerevisiae OptoINVRT7-circuit

  1. Spanningsconstructie
    1. Verkrijg een stam met his3 auxotrofie, omdat deze marker nodig is voor de meeste bestaande OptoINVRT-plasmiden5. Als u op zoek bent naar optogenetische regulatie van een gen dat inheems is in S. cerevisiae, construeer dan een stam waarin elke endogene kopie van het gen wordt verwijderd.
    2. Lineariseer het plasmide dat het OptoINVRT7-circuit bevat, zoals EZ-L4395, en integreer het in de his3-locus van de auxotrofe stam met behulp van standaard lithium-acetaattransformatiemethoden15. Als u het EZ-L439-plasmide gebruikt, dat de componenten bevat om PGAL1 in het licht te onderdrukken en in het donker te activeren, lineariseer dan op de PmeI-beperkingsplaats.
    3. Centrifugeer na de transformatie de cellen gedurende 1 minuut bij 150 x g en resuspend in 200 μL vers histidine-dropout synthetisch volledig medium (SC-His).
    4. Leg het volledige celvolume op SC-His agarplaten en incubeer bij 30 °C gedurende 2-3 dagen totdat er kolonies verschijnen.
    5. Bereid competente cellen van deze stam met behulp van standaard lithiumacetaattransformatieprotocollen en transformeer ze met een plasmide dat het gen (de genen) bevat dat optogenetisch moet worden gecontroleerd stroomafwaarts van de PGAL1-M- of PGAL1-S-promotor5.
      OPMERKING: Het gebruik van een plasmide dat integreert op δ-sites (YARCdelta5) en selecteert met Zeocin zorgt voor stabiele multicopy-integratie7,16,17,18.
    6. Centrifugeer na de transformatie de cultuur gedurende 1 minuut bij 150 x g en resuspend voorzichtig in 200 μL vers SC-dropout medium.
      OPMERKING: De PGAL1-M-promotor is een synthetische versie van de PGAL1-promotor met de Mig1p-onderdrukkingssites verwijderd, terwijl PGAL1-S een technische versie is van PGAL1-M, die extra Gal4p-activatorbindingsplaatsen heeft. De reguliere PGAL1-promotor kan worden gebruikt om de expressie te besturen; de expressiesterkte zal echter lager zijn dan van deze gemanipuleerde promotors.
    7. Plaat het volledige celvolume op een gistextract pepton dextrose (YPD) agarplaat bij integratie in δ-sites, of een SC-dropout plaat bij transformatie met een plasmide met een selectiemarker. Incubeer bij 30 °C gedurende 16 uur onder constant blauw licht om het optogenetisch gecontroleerde gen onderdrukt te houden.
      OPMERKING: Voor sommige stammen kunnen kolonies sneller groeien wanneer ze worden geïncubeerd in blauwlichtpulsen (bijv. 1 s aan / 79 s uit, 5 s aan / 75 s uit, 10 s aan / 70 s uit, enz.) in plaats van in constante verlichting, die indien nodig experimenteel voor elke soort moet worden bepaald.
    8. Gebruik een lichtbron van 465 nm en plaats een LED-paneel ~ 40 cm boven de plaat, zodat de lichtintensiteit ~ 80-110 μmol / m2 / s is. Meet de intensiteit met behulp van een kwantummeter (zie Tabel met materialen).
    9. Maak bij integratie in δ-sites een replica van de plaat op YPD-platen met een reeks Zeocin-concentraties tussen 400 μg / ml en 1.200 μg / ml om te selecteren voor een verscheidenheid aan integratiekopienummers5,7,12,16,17,18. Incubeer de replicaplaten bij 30 °C onder constant of gepulseerd blauw licht gedurende 2-3 dagen totdat de kolonies verschijnen.
  2. Voorlopige screening voor de beste kolonies
    1. Selecteer acht kolonies uit elke plaat en gebruik ze om 1 ml SC-His medium aangevuld met 2% glucose in individuele putten van een 24-putjes te enten. Groei in 24-putplaten onder de cellen 's nachts (16-20 uur) bij 30 °C met 200 tpm (19 mm orbitale diameter) schuddend onder constante blauwe lichtverlichting.
    2. Verdun de volgende ochtend elke cultuur in 1 ml van een vers SC-His medium met 2% glucose tot OD600 waarden variërend van 0,01-0,3 en groei in 24-well platen onder constant of gepulseerd licht bij 30 °C met 200 rpm schudden totdat ze celdichtheden tussen 2 en 9 OD600-waarden bereiken (figuur 4A). De hoeveelheid tijd die nodig is voor deze groeifase is afhankelijk van de belasting.
    3. Incubeer de platen in het donker gedurende 4 uur bij 30 °C met 200 rpm schudden door het lichtpaneel uit te schakelen en de platen in aluminiumfolie te wikkelen.
      OPMERKING: Deze stap stelt de cellen in staat om metabolisch over te gaan naar de productiefase voordat ze opnieuw worden onderbroken in de productiemedia.
    4. Om de productiefase te starten, centrifugeert u de culturen in de 24-well plaat bij 234 x g gedurende 5 minuten en resuspendeert u de cellen in 1 ml vers SC-dropout medium met 2% glucose. Sluit de platen af om verdamping van het gewenste product te voorkomen met behulp van steriele microplaatafdichtingstape.
    5. Fermenteer de verzegelde platen in het donker gedurende 48 uur bij 30 °C met schudden bij 200 rpm. Zorg ervoor dat de platen in aluminiumfolie zijn gewikkeld om blootstelling aan licht te voorkomen.
      OPMERKING: Het wikkelen van de platen in folie beperkt de beschikbaarheid van zuurstof of gas bij fermentaties niet; de steriele afdichtingstape beperkt echter wel de gasoverdracht. Kleine gaatjes kunnen in de tape worden gestoken om zuurstof in te brengen, indien nodig.
  3. Oogsten en analyseren
    1. Om de fermentaties te oogsten, centrifugeert u de platen gedurende 5 minuten bij 234 x g en brengt u 800 μL van het supernatant over in microcentrifugebuizen van 1,5 ml.
    2. Afhankelijk van de chemische stof van belang, analyseer met behulp van high-performance vloeistofchromatografie (HPLC), gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) of een andere analytische methode met behulp van de monstervoorbereidingstechniek die het meest geschikt is voor het gebruikte instrument.

2. Lichtgestuurde eiwitproductie met behulp van het E. coli OptoLAC-systeem

  1. Spanningsconstructie
    1. Co-transformatie elektrocompetent BL21 DE3 ΔlacI ΔlacI-DE3 met een plasmide dat het OptoLAC1B- of OptoLAC2B-circuit bevat6 en een plasmide dat het recombinante eiwit van belang van de PT7-promotor uitdrukt19.
    2. Herstel na transformatie de cellen gedurende 1 uur in 1 ml superoptimale bouillon met katabole onderdrukking (SOC; 2% trypton, 0,5% gistextract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucose) bij 37 °C met rotatie of schudden.
      OPMERKING: Het plasmide dat het eiwit van belang bevat, moet compatibel zijn met het OptoLAC-plasmide (d.w.z. verschillende weerstandsmarkers en oorsprong van replicatie) en mag geen kopie van lacI bevatten.
    3. Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 4845 x g en concentreer de pellet in 200 μL lysogenesebouillon (LB) media. Plaats de volledige geconcentreerde cellen op een LB-agarplaat met geschikte antibiotica en groei 's nachts bij 37 °C onder constant blauw licht om de eiwitexpressie onderdrukt te houden.
  2. Eerste screening om expressie te verifiëren
    1. Neem drie enkele kolonies en gebruik ze om 1 ml LB-media te enten met geschikte antibiotica in individuele putten van een 24-putplaat. Groei 's nachts (16-20 uur) bij 37 °C met 200 tpm schudden onder constante verlichting met blauw licht (figuur 4A).
    2. Gebruik de volgende dag 1,5 μL cultuur om OD600 te meten in een spectrofotometer met een microvolumemeting. Verdun culturen tot 1 ml verse LB in 24-well platen tot OD600-waarden variërend van 0,01-0,1.
    3. Kweek de culturen bij 37 °C met 200 rpm schudden onder blauw licht gedurende 2-3 uur. Voer vanaf het tweede uur elke 15 minuten OD600-metingen uit om ervoor te zorgen dat de culturen het OD600-bereik van 0,1-1,5 niet overschrijden.
    4. Zodra de culturen op de gewenste OD600 zijn, schakelt u het lichtpaneel uit en wikkelt u de plaat in aluminiumfolie om de productiefase te starten. Bewaar de plaat in het donker gedurende 8 uur (37 °C), 20 uur (30 °C) of 48 uur (18 °C), met 200 tpm schudden.
    5. Meet en noteer de uiteindelijke OD600-waarde van elke cultuur.
  3. Oogsten en analyseren
    1. Breng 800 μL van elke cultuur over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 17.000 x g.
    2. Resuspend de celkorrel in 200 μL resuspensiebuffer (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM).
      OPMERKING: De concentratie van NaCl kan worden aangepast op basis van het recombinante eiwit dat wordt geanalyseerd.
    3. Voeg 50 μL 6x natriumdodecylodeylsulfaat (SDS) monsterbuffer toe (Tris 375 mM, pH 6,8, SDS 9%, glycerol 50%, broomfenolblauw 0,03%, DTT 9%). Incubeer bij 100 °C gedurende 10 min met schudden bij 700 rpm in een thermomixer.
    4. Laad ~3-20 μL van de kweek in een 12% SDS-PAGE gel. Gebruik de uiteindelijke OD600-meting als richtlijn om voor elk monster ongeveer dezelfde hoeveelheid eiwit te laden (overeenkomend met 10 μL van het monster, overeenkomend met een uiteindelijke OD600-waarde van 1). Gebruik een voeding om elektroforese uit te voeren op 100 V totdat de gel volledig is opgelost.
    5. Kleur de gel met Coomassie briljantblauwe G-250-oplossing door 30-40 s in een magnetron te verwarmen en vervolgens gedurende ten minste 15 minuten op een platformrotator te broeden.
    6. Spoel tweemaal met gedeïoniseerd water en houd minstens 30 minuten (of 's nachts) vast op een platformrotator, waarbij u twee reinigingsdoekjes toevoegt die in een knoop zijn gebonden om de vlek te helpen absorberen. Kook de gel gedurende 15 minuten in voldoende water in de magnetron om het ontsmettingsproces te versnellen.

3. Driefasige fermentatie met behulp van het S. cerevisiae OptoAMP-systeem

  1. Spanningsconstructie
    1. Verkrijg een stam met een his3 auxotrofische marker, omdat deze marker nodig is om de bestaande OptoAMP-plasmiden5 te gebruiken. Als u op zoek bent naar optogenetische regulatie van een gen dat inheems is in S. cerevisiae, construeer dan een stam waarin de endogene kopie van dit gen wordt verwijderd.
    2. Lineariseer een plasmide dat het OptoAMP4-circuit bevat, zoals EZ-L58012, en integreer het in de his3-locus van de auxotrofe stam met behulp van standaard lithium-acetaattransformatiemethoden15. Als u EZ-L580 gebruikt, lineariseert u het plasmide op de PmeI-restrictieplaats.
    3. Centrifugeer na de transformatie de cellen gedurende 1 minuut bij 150 x g en resuspend in 200 μL vers SC-His-medium.
    4. Plaats het volledige celvolume op selectieve media (SC-His-agar) en incubeer bij 30 °C gedurende 2-3 dagen totdat er kolonies verschijnen.
    5. Bereid competente cellen van deze stam en transformeer ze met een plasmide dat het gen of de genen bevat die optogeenwaarts stroomafwaarts van de PGAL1-S-promotor12 moeten worden gecontroleerd.
      OPMERKING: Het gebruik van een plasmide dat integreert op δ locaties en selecteert met Zeocin zorgt voor stabiele multicopy integratie en selectie.
    6. Centrifugeer na de transformatie de cultuur gedurende 1 minuut bij 150 x g en breng voorzichtig opnieuw op in 200 μL vers SC-dropout medium.
      OPMERKING: De PGAL1-S promotor is een synthetische versie van de PGAL1 promotor waarin de Mig1p repressie sites worden verwijderd en extra Gal4p activator binding sites worden toegevoegd. De reguliere PGAL1 promotor kan worden gebruikt; de expressiesterkte zal echter lager zijn dan deze gemanipuleerde promotor.
    7. Leg het volledige celvolume op een YPD- of SC-dropout agarplaat en incubeer bij 30 °C gedurende 16 uur in het donker (gewikkeld in aluminiumfolie). Incuberen in het donker houdt het optogenetisch gecontroleerde gen onderdrukt, waardoor de cellen hun metabolische bronnen kunnen richten op celgroei in plaats van chemische productie.
    8. Bij integratie in δ-sites, replicaplaat op YPD-platen met een reeks Zeocin-concentraties om te selecteren voor een verscheidenheid aan integratiekopienummers. Incubeer de platen bij 30 °C in het donker (gewikkeld in aluminiumfolie) gedurende 2-3 dagen totdat er kolonies verschijnen.
  2. Voorlopige screening voor de beste kolonies
    1. Selecteer acht kolonies uit elke plaat en gebruik ze om 1 ml SC-His medium met 2% glucose te enten in individuele putten van een 24-putplaat. Laat de cellen 's nachts (16-20 uur) groeien in het donker bij 30 °C met 200 rpm schudden.
    2. Verdun de volgende ochtend elke cultuur in 1 ml vers SC-His medium met 2% glucose tot 0,1 OD600 en groei in het donker bij 30 °C met 200 rpm schudden tot ze een OD600 van 3 bereiken. Wikkel de platen in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. De hoeveelheid tijd die nodig is voor deze groeifase is afhankelijk van de belasting.
    3. Om de inductiefase te starten, incubeert u de platen onder gepulseerd licht (bijvoorbeeld 5 s aan / 95 s uit) gedurende 12 uur bij 30 °C met 200 tpm schudden. Gebruik een lichtbron van 465 nm en plaats een LED-paneel boven de plaat zodat de lichtintensiteit ~ 80-110 μmol / m2 / s is voor optimale resultaten (figuur 4A).
      OPMERKING: De optimale lichtpulsduur voor deze incubatie varieert op basis van de chemische stof die wordt geproduceerd. Het wordt aanbevolen om een reeks lichtschema's te screenen van 0,1% (bijv. 1 s op 999 s uit) tot 100% (volledig licht).
    4. Om de productiefase te starten, centrifugeert u de culturen gedurende 5 minuten bij 234 x g en resuspendeert u in vers SC-His-medium met 2% glucose. Sluit de platen af om verdamping van het gewenste product te voorkomen met steriele microplaatafdichtingstape.
    5. Fermenteer de verzegelde platen in licht gedurende 48 uur bij 30 °C met schudden bij 200 tpm. Optimaliseer het lichtschema tijdens deze stap, omdat sommige chemicaliën profiteren van een gepulseerde productiefase in plaats van volledig licht.
  3. Oogsten en analyseren
    1. Oogst de fermentaties door de platen gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 234 x g en 800 μL van het supernatant over te brengen in microcentrifugebuizen van 1,5 ml.
    2. Afhankelijk van de chemische stof van belang, analyseer met behulp van HPLC, GC-MS of een andere analysemethode met behulp van de monstervoorbereidingstechniek die het meest geschikt is voor het gebruikte instrument.

4. Chemische (mevalonaat) productie uit E. coli in een lichtgestuurde bioreactor

  1. Initiële inenting en bioreactoropstelling
    1. Ent een kolonie van een E. coli-stam die is ontworpen met lichtgecontroleerde chemische productie in 5 ml M9 minimale zouten (3,37 mM Na2HPO4, 2,2 mM KH2PO4, 0,855 mM NaCl, 0,935 mM NH4Cl) aangevuld met 0,2% w / v casaminozuren, 5% w / v glucose en sporenmetaalmengsel20 (0,0084 g / L EDTA, 0,0025 g/L CoCl2, 0,015 g/L MnCl2, 0,0015 g/L CuCl2, 0,003 g/L H3BO3, 0,0025 g/L Na2MoO4, 0,008 g/L ZnCl2, 0,06 g/L Fe (III) citraat, 0,0045 g/L thiamine, 1,3 g/L MgSO4) in een conische buis van 50 ml.
    2. Kweek de cultuur 's nachts bij 30 °C met 200 rpm schudden onder blauw licht verlichting.
    3. Stel de kopplaat van het bioreactorvat in en zorg ervoor dat de volgende poorten zijn geïnstalleerd: insert voor thermische sonde; opgeloste zuurstof (DO) sonde; gas sparger - aansluiten op de luchtbron via een 0,2 μm filter; waaier; gascondensor - aansluiten op een filter van 0,2 μm; koelleiding (x2); voedingslijnen (x2) - één voor mediatoevoeging, één voor pH-regeling; bemonsteringsleiding - zorg ervoor dat deze de bodem van het vat bereikt; lege poort; pH-sonde - kalibreer de sonde met normen van pH = 4 en pH = 7 voorafgaand aan de installatie, autoclaaf met de rest van het vat of steriliseer met 95% ethanol en aseptisch inbrengen voordat u het instelt.
    4. Vul het vat met 1 L gefilterd water en bevestig de kopplaat en draai vast, zorg ervoor dat de O-ring goed past en afdicht.
    5. Bedek eventuele openingen in de reactor met aluminiumfolie.
    6. Bereid drie stroken slangen voor: één voor het verwijderen van het water, één voor het inbrengen van het voer en één voor pH-controle. Bedek de uiteinden met aluminiumfolie en wikkel alle slangen in aluminiumfolie.
      OPMERKING: NH4OH, dat wordt gebruikt voor pH-aanpassing, stroomt niet soepel in siliconenbuizen, wat kan leiden tot onnauwkeurige stroomsnelheden en overbebasificatie van de cultuur. Om dit probleem te voorkomen, gebruikt u biocompatibele pompbuizen (BPT) voor de NH4OH-voeding.
    7. Autoclaaf de bioreactor en slangen, met behulp van een vloeistofcyclus van 30 minuten.
    8. Verwijder de materialen uit de autoclaaf. Eenmaal koel genoeg om te hanteren, sluit u de waaier, pH- en DO-sondes, luchtbron, condensorinlaat en -uitlaat en koelinlaat en -uitlaat aan op het controlestation.
    9. Plaats de thermische sonde en bedek het vat met een verwarmingsmantel. Bevestig de jas aan de bovenkant van het vat om te voorkomen dat de cultuur wordt geblokkeerd door blootstelling aan licht.
    10. Sluit een van de steriele buizen aan op de bemonsteringsleiding en zet deze vast via de bemonsteringspomp. Plaats het andere uiteinde zo dat het in een lege container stroomt die ten minste 1 L kan bevatten.
    11. Sluit een andere steriele buis aan op een van de voedingsleidingen en zet deze vast via een van de voedingspompen. Sluit het andere uiteinde van de buis aan op een fles M9-media. Voer de media in de reactor.
    12. Sluit een andere steriele buis aan op een van de voedingsleidingen en zet deze vast via een van de voedingspompen. Sluit het andere uiteinde van de buis aan op de fles met 28%-30% NH4OH.
      LET OP: NH4OH is corrosief. Werk in een zuurkast tijdens het overbrengen naar een voerfles en zorg ervoor dat de voerfles in secundaire insluiting wordt geplaatst.
    13. Plaats drie lichtpanelen in een driehoekige formatie op ~ 20 cm afstand van de reactor en controleer of de lichtintensiteiten op het oppervlak van het vat ~ 80-110 μmol / m2 / s van elke kant bereiken (figuur 4B).
    14. Schakel de volgende dag het bioreactorsysteem en de koelmachine in. Stel het instelpunt van de reactortemperatuur in op 37 °C, het pH-instelpunt op 7,0 en het roeren op 200 tpm. Het verwarmingsmantel moet worden ingeschakeld.
    15. Kalibreer de DO-sonde door eerst te wachten tot de temperatuur en DO-metingen constant worden (dit is het 100% instelpunt). Koppel vervolgens de sonde los van het systeem (dit is het instelpunt van 0%). Herhaal dit totdat de DO-meting stabiliseert op 100% wanneer de sonde is aangesloten en stel vervolgens het DO-instelpunt in op 20%.
  2. Lichtgestuurde chemische productie
    1. Ent de bioreactor tot een initiële OD600 van 0,001-0,1. Schakel de lichtpanelen in om de groei te initiëren.
    2. Begin na 3 uur met het nemen van monsters van de bemonsteringsleiding om OD600-metingen uit te voeren om te voorkomen dat de optimale celdichtheid van inductie (ρs) overgroeit. Zodra de optimale ρs is bereikt (de optimale waarde voor mevalonaatproductie is 0,17), schakelt u de lichtpanelen uit, bedekt u de reactor met aluminiumfolie en wikkelt u de opstelling in zwart doek om de donkere productiefase te starten.
    3. Voeg 50 μL antischuim toe, 8 uur na het overschakelen naar de duisternis. Schroef de lege poort los en pipetteer het antischuim rechtstreeks in de reactor.
    4. Gebruik de bemonsteringspoort om periodiek monsters te nemen voor HPLC- of GC-analyse.
  3. Demontage en analyse
    1. Nadat het experiment is voltooid, schakelt u het systeem uit. Schroef de DO- en pH-sondes voorzichtig los en was ze met water en zeep. Schroef de kopplaat los en was deze met water en zeep met een borstel.
    2. Breng de cultuur over in een lege container en voeg bleekmiddel toe tot een eindconcentratie van 10% v/v. Plaats in een zuurkast en gooi na 30 min weg.
    3. Was het reactorvat met water en zeep met een borstel.
    4. Bereid de monsters voor op analyse op basis van het product van belang. Meng voor de productie van mevalonaat 560 μL cultuur met 140 μL van 0,5 M HCl en vortex op hoge snelheid gedurende 1 min. Hierdoor wordt mevalonaat omgezet in (±)-mevalonolacton.
      LET OP: HCl is een gevaar voor de gezondheid. Behandel met de juiste PBM's en zorg ervoor dat monsterbuizen goed worden afgedekt voordat ze vortexen.
    5. Centrifugeer bij 17.000 x g gedurende 45 minuten bij 4 °C. Breng 250 μL van het supernatant over naar een HPLC injectieflacon.
    6. Voor mevalonaat, analyseer monsters met behulp van een organische zuren ionenuitwisseling kolom. Kwantificeer de productie met behulp van een brekingsindexdetector (RID), waarbij piekgebieden worden vergeleken met een standaard van (±)-mevalonolacton.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Optogenetische regulatie van microbieel metabolisme is met succes geïmplementeerd om een verscheidenheid aan producten te produceren, waaronder biobrandstoffen, bulkchemicaliën, eiwitten en natuurlijke producten5,6,7,12,13. De meeste van deze processen zijn ontworpen voor celgroei in het licht (wanneer lage celdichtheid minimale uitdagingen oplevert met lichtp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dynamische controle wordt al lang toegepast om de opbrengsten voor metabole engineering en recombinante eiwitproductie te verbeteren4. Verschuivingen in enzymatische expressie worden meestal geïmplementeerd met behulp van chemische inductoren zoals IPTG21, galactose22 en tetracycline23, maar zijn ook gemedieerd met behulp van procesomstandigheden zoals temperatuur en pH. Optogenetische controle van genexpressie elimineert de n...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben verschillende patenten aangevraagd voor de optogenetische circuits en methoden die in dit artikel worden beschreven.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door het Amerikaanse ministerie van Energie, Office of Science, Office of Biological and Environmental Research Award Number DE-SC0019363, de NSF CAREER Award CBET-1751840, The Pew Charitable Trusts en de Camille Dreyfus Teacher-Scholar Award.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Lichtgestuurde chemische productie met behulp van S. cerevisiae
24-wells kweekplaatUSA ScientificCC7672-7524
Agar poederThermo Fisher Scientific303991049
AluminiumfolieReynoldsB004NG90YO
BioSpectrometer met μcuvetEppendorf6135000923
Blauwe LED-paneelHQRP884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 PlasmideN/AN/AZie Verwijzing 1
GlucoseThermo Fisher Scientific501879892 (G8270-5KG)
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002403
MicrocentrifugebuisjesUSA Scientific1615-5510
Orbitale schudkeurYamato Scientific AmericaSOU-300
PetrischaalCelltreat229656
PmeINew England BiolabsR0560L
QuantummeterApogee InstrumentsMQ-510
Replica-plateerapparaatThomas ScientificF37848-0000
Replica-plateerpadsSunrise Science Products3005-012
SC-His poederSunrise Science Products1303-030
SC Complete poederSunrise Science Products1459-100
Steriele sluitfolieExcel ScientificSTR-SEAL-PLT
YPD agar platenVWR100217-054
ZeocinThermo Fisher ScientificR25005
Lichtgestuurde eiwitproductie met behulp van E. coli
6X SDS Sample BufferCepham Life Sciences10502
12% Acrylamide eiwitgelsThermo Fisher ScientificNP0341BOX
24-wells kweekplaatUSA ScientificCC7672-7524
AluminiumfolieReynoldsB004NG90YO
BioSpectrometer met μcuvetEppendorf6135000923
Blauwe LED-paneelHQRP884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250Thermo Fisher Scientific20279
ElektroforesecelBio-Rad1658004
Elektroforese voedingBio-Rad1645050
LB-bouillon (Miller)Fisher ScientificBP97235
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002403
MicrocentrifugebuisjesUSA Scientific1615-5510
NaClThomas ScientificSX0425-1
OptoLAC plasmidenN/AN/AZie Verwijzing 2
Orbitale schudkeurYamato Scientific AmericaSOU-300
PetrischaalCelltreat229656
QuantummeterApogee InstrumentsMQ-510
SOC-mediumThermo Fisher Scientific15544034
ThermomixerEppendorf5382000015
Tris baseFisher ScientificBP1521
Driefase fermentatie met behulp van S. cerevisiae
Dezelfde materialen als "Lichtgestuurde chemische productie met behulp van S. cerevisiae" protocol plus het volgende:
EZ-L580 OptoAMP4 PlasmideN/AN/AZie Verwijzing 10
Chemische productie in een lichtgestuurde bioreactor
AluminiumfolieReynoldsB004NG90YO
AntifoamSigma-AldrichA8311
Bioreactor met besturingsstationEppendorfB120110001
BioSpectrometer met μcuvetEppendorf6135000923
BleekVWR Scientific89501-620 (CS)
Blauwe LED-paneelHQRP884667106091218
BPT-slangFisher Scientific14-170-15
GlucoseThermo Fisher Scientific501879892 (G8270-5KG)
Zoutzuur (HCl)Fisher Scientific7647-01-0
M9 Minimale zoutenThermo Fisher ScientificA1374401
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002403
MicrocentrifugebuisjesUSA Scientific1615-5510
NH4OH-oplossingSigma-AldrichI0503-1VL
Orbitale schudkeurYamato Scientific AmericaSOU-300
QuantummeterApogee InstrumentsMQ-510
SC Complete poederSunrise Science Products1459-100

Referenties

  1. Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. The rise and shine of yeast optogenetics. Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).
  2. Pouzet, S., et al. The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151(2020).
  3. Venayak, N., Anesiadis, N., Cluett, W. R., Mahadevan, R. Engineering metabolism through dynamic control. Current Opinion in Biotechnology. 34, 142-152 (2015).
  4. Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Avalos, J. L. Current and future modalities of dynamic control in metabolic engineering. Current Opinion in Biotechnology. 52, 56-65 (2018).
  5. Zhao, E. M., et al. Design and characterization of rapid optogenetic circuits for dynamic control in yeast metabolic engineering. ACS Synthetic Biology. 9 (12), 3254-3266 (2020).
  6. Lalwani, M. A., et al. Optogenetic control of the lac operon for bacterial chemical and protein production. Nature Chemical Biology. 17 (1), 71-79 (2021).
  7. Zhao, E. M., et al. Optogenetic regulation of engineered cellular metabolism for microbial chemical production. Nature. 555 (7698), 683-687 (2018).
  8. Baumschlager, A., Khammash, M. Synthetic biological approaches for optogenetics and tools for transcriptional light-control in bacteria. Advanced Biology. 5 (5), 2000256(2021).
  9. Dvorak, P., et al. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3) carrying a synthetic metabolic pathway. Microbial Cell Factories. 14, 201(2015).
  10. Hartline, C. J., Schmitz, A. C., Han, Y., Zhang, F. Dynamic control in metabolic engineering: Theories, tools, and applications. Metabolic Engineering. 63, 126-140 (2021).
  11. Ni, C., Dinh, C. V., Prather, K. L. J. Dynamic control of metabolism. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 12, 519-560 (2021).
  12. Zhao, E. M., et al. Optogenetic amplification circuits for light-induced metabolic control. ACS Synthetic Biology. 10 (5), 1143-1154 (2021).
  13. Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Wegner, S. A., Avalos, J. L. The Neurospora crassa Inducible Q System Enables Simultaneous Optogenetic Amplification and Inversion in Saccharomyces cerevisiae for Bidirectional Control of Gene Expression. ACS Synthetic Biology. 10 (8), 2060-2075 (2021).
  14. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  16. Marx, H., Mecklenbräuker, A., Gasser, B., Sauer, M., Mattanovich, D. Directed gene copy number amplification in Pichia pastoris by vector integration into the ribosomal DNA locus. FEMS Yeast Research. 9 (8), 1260-1270 (2009).
  17. Nordén, K., et al. Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporins in Pichia pastoris. BMC Biotechnology. 11, 47(2011).
  18. Zhao, E. M., et al. Light-based control of metabolic flux through assembly of synthetic organelles. Nature Chemical Biology. 15 (6), 589-597 (2019).
  19. Dowee, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
  20. Zhou, K., Edgar, S., Stephanopoulos, G. Engineering microbes to synthesize plant isoprenoids. Methods in Enzymology. 575, 225-245 (2016).
  21. Arfman, N., Worrell, V., Ingram, L. O. Use of the tac promoter and lacI(q) for the controlled expression of Zymomonas mobilis fermentative genes in Escherichia coli and Zymomonas mobilis. Journal of Bacteriology. 174 (22), 7370-7378 (1992).
  22. Steen, E. J., et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol. Microbial Cell Factories. 7 (1), 1-8 (2008).
  23. Tan, S. Z., Manchester, S., Prather, K. L. J. Controlling central carbon metabolism for improved pathway yields in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 5 (2), 116-124 (2015).
  24. Jayaraman, P., et al. Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6994(2016).
  25. Fernandez-Rodriguez, J., Moser, F., Song, M., Voigt, C. A. Engineering RGB color vision into Escherichia coli. Nature Chemical Biology. 13 (7), 706-708 (2017).
  26. Ding, Q., et al. Light-powered Escherichia coli cell division for chemical production. Nature Communications. 11 (1), 1-14 (2020).
  27. Senoo, S., Tandar, S. T., Kitamura, S., Toya, Y., Shimizu, H. Light-inducible flux control of triosephosphate isomerase on glycolysis in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 116 (12), 3292-3300 (2019).
  28. Ramakrishnan, P., Tabor, J. J. Repurposing synechocystis PCC6803 UirS-UirR as a UV-violet/green photoreversible transcriptional regulatory tool in E. Coli. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 733-740 (2016).
  29. Tabor, J. J., Levskaya, A., Voigt, C. A. Multichromatic control of gene expression in escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 405 (2), 315-324 (2011).
  30. Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (120), e54894(2017).
  31. Grødem, E. O. S., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
  32. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, (2016).
  33. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  34. Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLoS Biology. 18 (7), (2020).
  35. Carrasco-López, C., García-Echauri, S. A., Kichuk, T., Avalos, J. L. Optogenetics and biosensors set the stage for metabolic cybergenetics. Current Opinion in Biotechnology. 65, 296-309 (2020).
  36. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7 (1), 1-11 (2016).
  37. Melendez, J., et al. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology: Quantitative Biosciences From Nano to Macro. 6 (3), 366-372 (2014).
  38. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  39. Castillo-Hair, S. M., Baerman, E. A., Fujita, M., Igoshin, O. A., Tabor, J. J. Optogenetic control of Bacillus subtilis gene expression. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  40. Xia, A., et al. Optogenetic modification of pseudomonas aeruginosa enables controllable twitching motility and host infection. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 531-541 (2021).
  41. Pu, L., Yang, S., Xia, A., Jin, F. Optogenetics manipulation enables prevention of biofilm formation of engineered pseudomonas aeruginosa on surfaces. ACS Synthetic Biology. 7 (1), 200-208 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lichtgestuurde fermentatieoptogenetische regulatiemicrobi le celcellenrecombinante eiwitproductieEscherichia coliSaccharomyces cerevisiaedynamische genexpressiebioreactorexperimentengepulseerde lichtinductiechemische productie

Gerelateerde artikelen