Methodenartikel

Microfluïdische Acoustophorese voor flowthrough scheiding van gramnegatieve bacteriën met behulp van Aptamer Affinity Beads

DOI:

10.3791/63300

⸱

17 oktober 2022

 ,  ,  , 
1Department of Digital Anti-Aging Health Care, Inje University, 2Micro device Lab Co., Ltd, 3Biohealth Products Research Center (BPRC), Inje University, 4Department of Biomedical Engineering, Inje University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft de fabricage en werking van microfluïdische acoustophoretische chips met behulp van de microfluïdische acoustophoresis-techniek en aptamer-gemodificeerde microbeads die kunnen worden gebruikt voor snelle, efficiënte isolatie van Gram-negatieve bacteriën uit een medium.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft de fabricage en werking van microfluïdische acoustophoretische chips met behulp van een microfluïdische acoustophoresis-techniek en aptamer-gemodificeerde microbeads die kunnen worden gebruikt voor de snelle, efficiënte isolatie van Gram-negatieve bacteriën uit een medium. Deze methode verbetert de scheidingsefficiëntie met behulp van een mix van lange, vierkante microkanalen. In dit systeem worden het monster en de buffer via een stroomregelaar in de inlaatpoort geïnjecteerd. Voor kraalcentrering en monsterscheiding wordt wisselstroom toegepast op de piëzo-elektrische transducer via een functiegenerator met een eindversterker om akoestische stralingskracht in het microkanaal te genereren. Er is een gespleten kanaal bij zowel de inlaat als de uitlaat, waardoor gelijktijdige scheiding, zuivering en concentratie mogelijk is. Het apparaat heeft een herstelpercentage van >98% en een zuiverheid van 97,8% tot een dosisconcentratie van 10x. Deze studie heeft een herstelsnelheid en zuiverheid aangetoond die hoger is dan de bestaande methoden voor het scheiden van bacteriën, wat suggereert dat het apparaat bacteriën efficiënt kan scheiden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microfluïdische platforms worden ontwikkeld om bacteriën te isoleren uit medische en omgevingsmonsters, naast methoden op basis van diëlektrische overdracht, magnetoforese, kraalextractie, filtering, centrifugale microfluïdica en traagheidseffecten, en oppervlakteakoestische golven 1,2. De detectie van pathogene bacteriën wordt voortgezet met behulp van polymerasekettingreactie (PCR), maar het is meestal bewerkelijk, complex en tijdrovend 3,4. Microfluïdische acoustophoresesystemen zijn een alternatief om dit aan te pakken door middel van een redelijke doorvoer en contactloze celisolatie 5,6,7. Acoustophoresis is een technologie die kralen scheidt of concentreert met behulp van het fenomeen van materiële beweging door middel van een geluidsgolf. Wanneer geluidsgolven het microkanaal binnenkomen, worden ze gesorteerd op basis van de grootte, dichtheid, enz., van de kralen, en cellen kunnen worden gescheiden volgens de biochemische en elektrische eigenschappen van het suspensiemedium 7,8. Dienovereenkomstig zijn veel acoustophoretische studies actief uitgevoerd 9,10,11, en onlangs zijn 3D numerieke simulaties van acoustophoretische beweging geïnduceerd door grensgestuurde akoestische streaming in staande akoestische golfmicrofluïdica geïntroduceerd12.

Studies op verschillende gebieden onderzoeken hoe antilichamen kunnen worden vervangen 2,3. Aptamer is een doelmateriaal met een hoge selectiviteit en specificiteit, en er worden veel studies uitgevoerd 2,9,10,13. Aptameren hebben voordelen van klein formaat, uitstekende biologische stabiliteit, lage kosten en hoge reproduceerbaarheid in vergelijking met antilichamen en worden bestudeerd in diagnostische en therapeutische toepassingen 2,3,14.

Hier beschrijft dit artikel een microfluïdisch acoustophoresis-technologieprotocol dat kan worden gebruikt voor de snelle, efficiënte scheiding van Gram-negatieve (GN) bacteriën uit een medium met behulp van aptamer-gemodificeerde microbeads. Dit systeem genereert een tweedimensionale (2D) akoestische staande golf door middel van enkele piëzo-elektrische activering door tegelijkertijd twee orthogonale resonanties in een lang rechthoekig microkanaal te stimuleren om aptamer-bevestigde microbeads uit te lijnen en te focussen op de knoop en anti-knooppuntpunten voor scheidingsefficiëntie 2,11,15,16 . Er is een gespleten kanaal bij zowel de inlaat als de uitlaat, waardoor gelijktijdige scheiding, zuivering en concentratie mogelijk is.

Dit protocol kan nuttig zijn op het gebied van vroege diagnose van bacteriële infectieziekten, evenals een snelle, selectieve en gevoelige reactie op pathogene bacteriële infecties door middel van real-time watermonitoring.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Microfluïdisch acoustophoresis chip ontwerp

OPMERKING: Figuur 1 toont een schema van de scheiding en verzameling van doelmicrobeads uit microkanalen door acoustophorese. De microfluïdische acoustophoresis chip is ontworpen met een CAD programma.

  1. Ontwerp een microfluïdische acoustophoresis-chip die een mengsel van aptamer-gemodificeerde kralen en streptavidin-gecoate polystyreen (PS) kralen die overeenkomen met de grootte van bacteriën gebruikt om de scheidingsprestaties van het apparaat te bestuderen.
  2. Ontwerp een microfluïdische acoustophoresechip die PS-kralen verzamelt bij de doeluitlaat en de rest via de uitlaat weggooit na het injecteren van een PS-monstermengsel in de monsterinlaat (zie figuur 2 en tabel 1).
    OPMERKING: Voor dit doel is de acoustofluidische chip ontworpen bestaande uit twee inlaten voor het injecteren van monsters en buffer, een hoofdkanaal met een aangesloten piëzo-elektrische transducer (PZT) om de microbeads centraal uit te lijnen, en twee uitgangen waardoor monsters worden verzameld en afval wordt geloosd (figuur 3A)
  3. Ontwerp een microfluïdische acoustophoresischip waarin microbeads, buffer, bacteriën en aptameren door het hoofdkanaal gaan, waarbij de microbeads centraal worden uitgelijnd via in-chip acoustophorese geïnduceerd door de PZT (figuur 3B, C)

2. Microfluïdische acoustophoresis chip fabricage

OPMERKING: Monteer vier lagen in de volgende volgorde: een borosilicaatglas-siliciumlaag, een siliciumlaag, een borosilicaatglaslaag en een PZT-laag, zoals weergegeven in figuur 3A,B.

  1. Bereid borosilicaatglas (de bovenste laag) met gaten met een diameter van 2 mm door zandstraal17 aan de in- en uitlaat voor het aansluiten van polyetheretherketon (PEEK) buizen. Het borosilicaatglas meet 20 × 80 × 0,5 mm3.
  2. Bereid een 200 μm dikke siliciumkanaallaag met een microkanaal met een dwarsdoorsnede van 0,2 × 0,2 mm2 gevormd met behulp van een fotoresist en een siliciumpatroon verkregen via diepe reactieve ionenets (RIE)18. Boor gaten met een diameter van 1 mm voor de monster- en bufferinlaatkanalen en de opvang- en afvaluitlaatkanalen tijdens het etsen van reactieve ionen.
    OPMERKING: Hier gebruikt ionenetsen het RIE-proces om microkanalen te vormen. Een fotoresist werd aangebracht in de vorm van een kanaal op een siliciumwafer voor de siliciumkanaallaag. De PR-gecoate siliciumwafer werd geëtst met plasma gegenereerd door het aanbrengen van 13,56 Mhz op fluor18.
  3. Bereid een chip met de lagen boven en onder de siliciumlaag (20 × 80 × 0,5 mm3) bereid in stap 2.2 (20 × 80 × 0,5 mm3) gebonden aan het borosilicaatglas in stap 2.1 en een derde borosilicaatglaslaag met anodisatie bij 1.000 V en 400 °C19.
  4. Bevestig een PZT (20 × 40 mm2) aan de borosilicaatglaslaag langs het microfluïdische kanaal met behulp van een cyanoacrylaatlijm (10 μL of minder).
    OPMERKING: Breng de lijm aan als een zeer dunne laag in het kanaal met behulp van een wattenstaafje om eventuele veranderingen in hoogte te minimaliseren. Figuur 3C is een foto van het apparaat.

3. Bacteriestammen en -cultuur

OPMERKING: Raadpleeg tabel 2 om GN- en Gram-positieve (GP) bacteriën te selecteren en te incuberen voor experimenten. Voor de kweekmethode raadpleegt u stap 3.1-3.4. Alle bacteriën moeten onder aerobe omstandigheden worden geïncubeerd totdat een absorptie van 0,4 bij 600 nm (OD600) is verkregen.

  1. Voor GN-bacteriën zoals Escherichia coli DH5α, Escherichia coli KCTC2571, Sphingomonas insulae en Pseudomonas pictorum en GP-bacteriën zoals Staphylococcus epidermidis en Staphylococcus pasteuri, incuberen in Luria-Bertani medium bij 37 °C en 220 tpm gedurende 16 uur.
  2. Voor Enterobacter (GN) en Bacillus megaterium (GP; KCTC 1021), incuberen in voedingsbodemmedium bij 37 °C en 220 tpm gedurende 16 uur.
  3. Voor Enterococcus thailandicus (GP), incubeer in de Man, Rogosa en Sharpe (MRS) medium bij 37 °C en 220 rpm gedurende 16 h.
  4. Voor Listeria grayi (GP), incubeer in het hersenhartinfuusmedium bij 37 °C en 220 tpm gedurende 16 uur.
  5. Centrifugeer (9056 x g) de gekweekte bacteriën gedurende 1 min bij kamertemperatuur (RT) en was vervolgens tweemaal met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer.
  6. Bereid de geselecteerde GN- en GP-bacteriën voor op analyse door resuspendatie in PBS-buffer.

4. Microbeads en immobilisatie van aptamer op microbeads

  1. Resuspendeer het met streptavidin gecoate microbeads (10 μm) mengsel (tabel met materialen) voor gebruik (meng via vortexing gedurende 20 s).
  2. Bereid aptamer door gedurende 3 minuten bij 95 °C te denatureren en vervolgens gedurende 2 minuten opnieuw op 0 °C te vouwen.
  3. Breng 250 μL van het geresuspendeerde streptavidin-gecoate microbeads mengsel over naar een buis van 1,5 ml en was met Tris-HCl buffer (50 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 5 mM KCL, 100 mM NaCl) op RT. Voeg vervolgens 100 μL gebiotinyleerd DNA-aptamer toe aan de buis.
  4. Incubeer het mengsel op RT gedurende 30 minuten tijdens het draaien (25 rpm).
  5. Was de tube na centrifugatie (9056 x g) tweemaal met 200 μL Tris-HCl buffer op RT.
  6. Voeg 10 μL BSA (100 mg/ml) toe aan de gewassen monsterbuis en incubeer gedurende 30 minuten bij RT met rotatie (25 rpm).
  7. Was ten slotte de aptamer-gemodificeerde microbeads tweemaal door centrifugatie (9056 x g) in Tris-HCl-buffer bij RT.

5. Acoustophorese setup en werking

  1. Sluit PEEK-buizen aan op de twee inlaten voor het injecteren van twee monsters en buffer en de twee uitgangen voor het verzamelen en lozen van afval (figuur 4).
  2. Vul het microfluïdische acoustophoresiskanaal handmatig met bubbelvrij gedemineraliseerd water met behulp van een spuit van 10 ml.
  3. Bereid een precisiedrukregelaar voor met twee of meer uitgangskanalen om de vloeistofstroom te regelen. Vul vervolgens de injectieflacons half met monster en buffer met respectievelijk twee gaten in hun doppen en maak verbinding met de chipinlaat.
    OPMERKING: Een precisiedrukregelaar met twee of meer uitgangskanalen kan worden vervangen door meerdere precisiedrukregelaars. Bij de bufferinlaat wordt een buffer geïnjecteerd die een laminaire stroming kan genereren die voorkomt dat het monster tijdens de monsterinjectie naar het midden beweegt, via een stroomregelaar.
  4. Injecteer na het voorbereiden van het apparaat het monster en de buffer door een druk van 2 kPa op de monsterinlaat en 4 kPa op de bufferinlaat uit te oefenen met behulp van de precisiedrukregelingsinrichting.
    OPMERKING: Op dit moment, voor een soepele laminaire stroming, moet de injectiedruk van de buffer hoger zijn dan de injectiedruk van het monster. De stroom wordt geregeld door een stroomregelaar die is bevestigd aan de aspirator die is aangesloten op het inlaatkanaal.
  5. Focus op een kraal om deze naar het midden van het microfluïdische kanaal te verplaatsen met behulp van de PZT terwijl u door de microscoop controleert.
    OPMERKING: Hoe groter de kraal, hoe groter het effect op de golfvorm, dus het is gemakkelijker om uit te lijnen met het knooppuntpunt. Functiegenerator met versterker past vermogen toe op PZT om sinusgolf in het microkanaal te genereren. Omdat de bovenste en onderste delen van het microkanaal van glas zijn gemaakt, wordt de gegenereerde sinusgolf gereflecteerd en ontstaat eenknooppuntpunt 7.
  6. Genereer een resonantiefrequentie van 3,66 MHz met behulp van een eenkanaals functiegenerator en versterk een typisch signaal met 16 dB (ongeveer negenvoudig) met behulp van een eindversterker (figuur 4).
    OPMERKING: De resonantiefrequentie van de actuator moet overeenkomen met de grootte van het kanaal; omdat het kanaal vierkant is, werkt de PZT op een nauwkeurige frequentie om een enkel knooppunt te creëren.
  7. Observeer de scheidings- en verrijkingsprocessen op de acoustofluidische chip met een fluorescentiemicroscoop en een hogesnelheidscamera met 1.200 fps.
  8. Kwantificeer en analyseer de aan- of afwezigheid van GN-bacteriën en GP-bacteriën door de beelden te controleren die zijn gemaakt met de fluorescentiemicroscoopcamera van de bacteriegebonden kralen en bacteriën die door de verzamel- en afvaluitlaatmonsters worden geloosd.
    OPMERKING: Microbeads met buffer, bacteriën en aptameren passeren het hoofdkanaal en de microbeads worden centraal uitgelijnd via in-chip acoustophorese geïnduceerd door de PZT. Ten slotte worden microbeads die GN-bacteriën hebben gebonden verzameld in de verzameloutlet en worden de niet-verzamelde bacteriën afgevoerd via de afvaluitlaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 5 toont het beeld van de kraalstroom als functie van de PZT-spanning (UIT, 0,1 V, 0,5 V, 5 V). In het geval van de acoustophoretische chip die in deze studie werd geïntroduceerd, werd bevestigd dat naarmate de spanning van de PZT toenam, de centrale concentratie van de 10 μm grote kralen toenam. De meeste kralen van 10 μm waren geconcentreerd in het midden bij 5 V van de PZT-spanning. Door dit resultaat werd een resonantiefrequentie van 3,66 MHz gegenereerd in een eenkanaals functiege...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We ontwikkelden een sonische levitatie microfluïdisch apparaat voor het vangen en overbrengen van GN-bacteriën uit kweekmonsters met hoge snelheid op basis van een continu lopende methode op basis van hun grootte en type, en aptamer-gemodificeerde microbeads. Het lange, vierkante microkanaal maakt een eenvoudiger ontwerp en een grotere kostenefficiëntie voor 2D-acoustophorese mogelijk dan eerder gemeld 20,21,22,23,24,25,26....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (Ministerie van Wetenschap en ICT). (Nee. NRF-2021R1A2C1011380)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 µm polystyreen microbeadsBang LaboratoriesPS04001Celgrootte kralen
10 µm Streptavidin-gecoate microbeadsBang LaboratoriesCP01007Aptameer affiniteit kralen
4-inch Silicium Wafer/SU-8 mal4science29-03573-01Chip componenten
AptameerIntegrated DNA TechnologiesGN3-6'RNA voor bacteriën conjugatie
Borosilicaat glasSchottBOROFLOAT 33Chip componenten
CentrifugeDaihanCF-10Wasing deeltjes
Cyanoacrylaatlijm3MAD100PZT aan microchip bevestigen
Escherichia coli DH5αKCTCKCTC2571Doelbacteriën
Functionele generatorGW InstekAFG-2225Frequentie genereren
HogesnelheidscameraPhotronFASTCAM MiniObservatie van scheiding
Heet plaatjeAs oneHI-1000Verwarmingsplaat voor het uitharden van vloeibare PDMS
KOVAX-SPRUIT 10 mL SpuitKoreavaccine22G-10MLVul de microfluïdische acoustoforese kanaal met bellen-vrije gedemineraliseerde water.
Vloeibaar polydimetylsiloxaan, PDMSDow Corning Inc.Sylgard 184Chip componenten
LB Broth MillerBD Difco244620Celcultuur (Luria-Bertani medium)
MicroscoopOlympus Corp.IX-81Observatie van scheiding
PBS bufferCapricorn scientificPBS-1AWasing bacteriën
PEEK BuizenSaint-Gobain Ppl Corp.AAD04103Injecteren of verzamelen deeltjes
Piezo-elektrische transducerFuji CeramicsC-213Genereer specifieke golf in kanaal
VersterkerAmplifier Research75A250AFrequentie versterken
Drukregelaar/μfluconAMEDAMED-μfluconControle van luchtdruk/flow controller
Tris-HCl bufferinvitrogen15567027Wasing deeltjes
Buis rotatorSeouLin BioscienceSLRM-3Modificeren aptameer en kraal

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, M., et al. Acoustofluidic separation of cells and particles. Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).
  2. Lee, S. W., et al. Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis. Micromachines. 10 (11), 770(2019).
  3. Hirvonen, J. J., et al. One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).
  4. Swaminathan, B., Feng, P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).
  5. Ding, X., et al. On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).
  6. Karthick, S., et al. Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis. Lab on a Chip. 18 (24), 2802(2018).
  7. Lenshof, A., et al. Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
  8. Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
  9. Klussmann, S. The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , John Wiley & Sons. Hoboken, New Jersey. (2006).
  10. Ellington, A., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  11. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  12. Namnabat, M. S., et al. 3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics. Scientific Reports. 11 (1), 11326(2021).
  13. Nimjee, S. M., et al. Aptamer as therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).
  14. Zhang, Y., et al. Recent advances in aptamer discovery and application. Molecules. 24 (5), 941(2019).
  15. Park, J. W., et al. Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  16. Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
  17. Van Toan, N., et al. An investigation of processes for glass micromachining. Micromachines. 7 (3), 51(2016).
  18. Jansen, H., et al. A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14(1996).
  19. Hanneborg, A., et al. Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139(1991).
  20. Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).
  21. Wang, S., et al. Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood. International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).
  22. Ai, Y., et al. Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves. Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).
  23. Ohlsson, P., et al. Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  24. Park, S., et al. Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).
  25. Kim, U., Soh, H. T. Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter. Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).
  26. Cai, G., et al. A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains. Micromachines. 9 (12), 624(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bacteriescheidingmicroflu dische chipakoestische stralingskrachtstreptavidine gecoate kraaltjesfluorescentiemicroscopiedrukregelaardetectie van bacteri le biomarkers

Gerelateerde artikelen