Methodenartikel

Kwantitatieve fractioneringstechniek voor microtubuli om stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrije tubuline in muizenweefsels te scheiden

3.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63358

⸱

17 november 2023

 , 
1Department of Neuropathology, Faculty of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 2Center for Research in Neurodegenerative Diseases, Doshisha University, 3Laboratory of Physiology and Anatomy, School of Pharmacy, Nihon University

In dit artikel

Samenvatting

Microtubuli, die tubulinepolymeren zijn, spelen een cruciale rol als onderdeel van het cytoskelet in eukaryote cellen en staan bekend om hun dynamische instabiliteit. Deze studie ontwikkelde een methode voor het fractioneren van microtubuli om ze te scheiden in stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrije tubuline om de stabiliteit van microtubuli in verschillende muizenweefsels te evalueren.

Samenvatting

Microtubuli, samengesteld uit α/β-tubulinedimeren, zijn een cruciaal onderdeel van het cytoskelet in eukaryote cellen. Deze buisachtige polymeren vertonen dynamische instabiliteit als tubuline-heterodimeersubeenheden repetitieve polymerisatie en depolymerisatie ondergaan. Nauwkeurige controle van de stabiliteit en dynamiek van microtubuli, bereikt door posttranslationele modificaties van tubuline en microtubuli-geassocieerde eiwitten, is essentieel voor verschillende cellulaire functies. Disfuncties in microtubuli zijn sterk betrokken bij de pathogenese, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen. Lopend onderzoek richt zich op microtubuli-gerichte therapeutische middelen die de stabiliteit moduleren en mogelijke behandelingsopties bieden voor deze ziekten en kankers. Daarom is het begrijpen van de dynamische toestand van microtubuli cruciaal voor het beoordelen van ziekteprogressie en therapeutische effecten.

Traditioneel wordt de dynamiek van microtubuli in vitro of in gekweekte cellen beoordeeld door middel van ruwe fractionering of immunoassay, met behulp van antilichamen die gericht zijn op posttranslationele modificaties van tubuline. Het nauwkeurig analyseren van de tubulinestatus in weefsels met behulp van dergelijke procedures brengt echter uitdagingen met zich mee. In deze studie ontwikkelden we een eenvoudige en innovatieve fractioneringsmethode voor microtubuli om stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrije tubuline in muizenweefsels te scheiden.

De procedure omvatte het homogeniseren van ontlede muizenweefsels in een microtubuli-stabiliserende buffer met een volumeverhouding van 19:1. De homogenaten werden vervolgens gefractioneerd door middel van een ultracentrifugatieproces in twee stappen na de eerste langzame centrifugatie (2.400 × g) om vuil te verwijderen. De eerste ultracentrifugatiestap (100.000 × g) precipiteerde stabiele microtubuli, terwijl het resulterende supernatans werd onderworpen aan een tweede ultracentrifugatiestap (500.000 × g) om labiele microtubuli en oplosbare tubulinedimeren te fractioneren. Deze methode bepaalde de verhoudingen van tubuline die stabiele of labiele microtubuli in de muizenhersenen vormen. Bovendien werden duidelijke weefselvariaties in de stabiliteit van microtubuli waargenomen die correleerden met de proliferatieve capaciteit van samenstellende cellen. Deze bevindingen benadrukken het aanzienlijke potentieel van deze nieuwe methode voor het analyseren van de stabiliteit van microtubuli in fysiologische en pathologische omstandigheden.

Inleiding

Microtubuli (MT's) zijn langwerpige buisvormige structuren die bestaan uit protofilamenten die bestaan uit α/β-tubuline heterodimeersubeenheden. Ze spelen een essentiële rol in verschillende cellulaire processen, zoals celdeling, beweeglijkheid, vormbehoud en intracellulair transport, waardoor ze integrale componenten zijn van het eukaryote cytoskelet1. Het min-uiteinde van MT's, waar de α-tubuline-subeenheid wordt blootgesteld, is relatief stabiel, terwijl het plus-uiteinde, waar de β-tubuline-subeenheid wordt blootgesteld, dynamische depolymerisatie en polymerisatie ondergaat2. Deze continue cyclus van tubulinedimeeradditie en dissociatie aan het plus-uiteinde, aangeduid als dynamische instabiliteit, resulteert in een repetitief proces van redding en catastrofe3. MT's vertonen focale domeinen met gelokaliseerde variaties in dynamische instabiliteit, waaronder stabiele en labiele domeinen4.

Nauwkeurige controle van de dynamische instabiliteit van MT's is cruciaal voor tal van cellulaire functies, met name in neuronen die worden gekenmerkt door ingewikkelde morfologieën. Het aanpassingsvermogen en de duurzaamheid van MT's spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling en het goed functioneren van zenuwcellen 5,6,7. De dynamische instabiliteit van MT's blijkt geassocieerd te zijn met verschillende posttranslationele modificaties (PTM's) van tubuline, zoals acetylering, fosforylering, palmitoylering, detyrosinatie, delta 2, polyglutamine-oxidatie en polyglycylering. Bovendien dient de binding van microtubuli-geassocieerde eiwitten (MAP's) als een regulerend mechanisme8. PTM's, met uitzondering van acetylering, komen voornamelijk voor in het tubuline-carboxy-terminale gebied dat zich aan de buitenkant van MT's bevindt. Deze modificaties creëren verschillende oppervlaktecondities op MT's, beïnvloeden hun interactie met MAP's en bepalen uiteindelijk de stabiliteit van MT's9. De aanwezigheid van een carboxy-terminaal tyrosineresidu in α-tubuline is een indicatie van dynamische MT's, die snel worden vervangen door de vrije tubulinepool. Omgekeerd duiden detyrosinatie van het carboxy-eindpunt en acetylering van Lys40 op stabiele MT's met verminderde dynamische instabiliteit 9,10.

De PTM's van tubuline zijn uitgebreid gebruikt in experimenten om de dynamiek en stabiliteit van MT's 5,7,11,12,13,14,15 te beoordelen. In celkweekstudies kunnen tubulines bijvoorbeeld worden gescheiden in twee pools: de vrije tubulinepool en de MT-pool. Dit wordt bereikt door vrije tubuline vrij te geven door celpermeabilisatie voordat de resterende MT's 15,16,17,18,19 worden gefixeerd. Biochemische methoden omvatten het gebruik van chemische MT-stabilisatoren die MT's beschermen tegen catastrofe, waardoor de scheiding van MT's en vrije tubuline mogelijk wordt door middel van centrifugatie20,21,22. Deze procedures maken echter geen onderscheid tussen stabiele en minder stabiele (labiele) MT's, waardoor het onmogelijk wordt om MT's of oplosbare tubuline in weefsels zoals de hersenen te kwantificeren. Bijgevolg is het evalueren van MT-stabiliteit in organismen onder fysiologische en pathologische omstandigheden een uitdaging gebleken. Om deze experimentele beperking aan te pakken, hebben we een nieuwe techniek ontwikkeld voor het nauwkeurig scheiden van MT's en vrije tubuline in muizenweefsel23.

Deze unieke MT-fractioneringsmethode omvat weefselhomogenisatie onder omstandigheden die de tubulinestatus in weefsels behouden en centrifugatie in twee stappen om stabiele MT's, labiele MT's en vrije tubuline te scheiden. Deze eenvoudige procedure kan worden toegepast op brede studies, waaronder fundamenteel onderzoek naar MT's en MAP's in levende organismen, fysiologische en pathologische analyses van gezondheid en ziekten die verband houden met MT-stabiliteit, en het ontwikkelen van geneesmiddelen en andere therapieën die gericht zijn op MT's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. MT-fractioneringsmethode

OPMERKING: Alle experimenten die in deze studie zijn uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Doshisha University. C57BL/6J muizen van beide geslachten, 3-4 maanden oud, werden hier gebruikt. In dit protocol werden ontlede weefsels, bijvoorbeeld hersenen, lever of thymus, onmiddellijk gehomogeniseerd in ijskoude microtubuli-stabiliserende buffer (MSB), die Taxol (MT-stabilisator) bevatte in een concentratie die niet alleen depolymerisatie maar ook repolymerisatie van MT verhinderde. Het homogenaat werd in drie fracties gescheiden door middel van een ultracentrifugatieproces in twee stappen (figuur 1). Alle stappen in dit protocol werden zonder onderbreking voltooid in een omgeving met koele temperaturen, en de weefsels en fracties werden niet ingevroren totdat ze waren opgelost in natriumdodecylsulfaat (SDS)-monsterbuffer.

  1. Bereiding van MSB en microbuisjes
    1. Meng voor de bereiding van MSB de volgende reagentia: 0,1 M 2-(N-morfolino)ethaansulfonzuur (MES), pH 6,8 (geneutraliseerd door KOH), 10% glycerol, 0,1 mM DTT, 1 mM MgSO 4, 1 mM EGTA, 0,5% Triton X-100, fosfataseremmers (1 mM NaF, 1 mM β-glycerofosfaat, 1 mM Na3VO 4, 0,5 μM okadaïnezuur), 1x proteaseremmercocktail, en proteaseremmers (0,1 mM PMSF, 0,1 mM DIFP, 1 μg/ml pepstatine, 1 μg/ml antipijn, 10 μg/ml aprotinine, 10 μg/ml leupeptine, 50 μg/ml TLCK) (zie materiaaltabel) en duiden aan als MSB(-).
    2. Voeg vlak voor weefseldissectie 10 μM Taxol en 2 mM GTP (zie Materiaaltabel) toe aan MSB(-). Deze buffer wordt aangeduid als MSB(+). Bereid de buffer voor op de dag van gebruik en bewaar deze op ijs.
    3. Bereid de microbuisjes voor op bemonstering. Lege microbuis van 2,0 ml voor homogene opslag; lege microbuis van 1.5 ml voor supernatant1 (S1)-lysaat, precipitate2 (P2)-monster en precipitate3 (P3)-monsteropslag; 1,5 ml microbuisje met 1 ml ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor de opslag van ontleed weefsel; Microbuisje van 1,5 ml met 200 μl 2x SDS-monsterbuffer (0,16 M Tris pH 6,8; 20% glycerol; 2% 2-mercaptoethanol; 4% SDS) voor opslag van S1-monsters en supernatant3 (S3)-monsters; en centrifugatiemicrobuis voor TLA55- en TLA120.2-centrifugerotoren (zie materiaaltabel). Label alle buisjes en leg ze op ijs.
  2. Homogenisatie van muizenweefsel
    1. Bereid een gekoelde tafel voor weefseldissectie voor. Vul eerst een doos met gemalen ijs en plaats twee petrischaaltjes op ijs, één met de binnenkant naar boven en de andere met de buitenkant. Vul ijskoude PBS in één schaal voor voorbijgaande wassing en opslag van ontlede weefsels. Leg filtreerpapier bevochtigd met PBS op een andere schaal die is omgedraaid.
    2. Om een muis op te offeren, voert u cervicale dislocatie uit onder diepe anesthesie met een gemengd anestheticum van butorfanol, midazolam en medetomidine. Ontleed vervolgens onmiddellijk de weefsels, bijvoorbeeld hersenen, lever of thymus, en was ze met ijskoude PBS in een petrischaal.
      OPMERKING: Elk type zacht weefsel kan met deze methode worden geanalyseerd. De grootte van het weefsel wordt echter beperkt door het aanbevolen volumebereik van de gebruikte homogenisator. Als bijvoorbeeld een volume van 2 ml homogenisator wordt gebruikt, wordt 50-100 mg weefsel aanbevolen.
    3. Na het wegen van de 1,5 ml microbuisjes gevuld met PBS voor ontlede weefselopslag, knipt u weefsels uit en bewaart u ze in de microbuisjes, en weegt u elke microbuis opnieuw. Het natte gewicht van elk weefsel kan worden berekend door het gewicht van de buis voor en na het toevoegen van het weefsel af te trekken.
    4. Homogeniseer het weefsel onmiddellijk in ijskoude MSB(+) met een gekoelde homogenisator (zie Materiaaltabel). Het volume van MSB(+) was 19 keer (μL) het natte gewicht van het weefsel (mg). Voer homogenisatie uit met 20 slagen totdat de weefselstukjes verdwijnen.
      OPMERKING: Bijvoorbeeld, 1.900 μL MSB(+) wordt gebruikt voor 100 mg weefsel. Aangezien het volume MSB(+) dat moet worden toegevoegd, moet worden aangepast voor elk nat gewicht van de geanalyseerde weefselstukken, is het noodzakelijk om elk weefselstuk nauwkeurig te wegen.
  3. Centrifugeren van de muizenweefselhomogenaten
    1. Verplaats het hele homogenaat naar een microbuisje van 2 ml met een pasteurpipet en centrifugeer bij 2.400 × g gedurende 3 minuten bij 2 °C om het vuil via neerslag te verwijderen.
    2. Breng het hele supernatans (S1-fractie) over in een nieuwe microbuis van 1,5 ml en vortex. Vervolgens aliquot 200 μL S1-fractie in een centrifugatiemicrobuis en centrifugeer bij 100.000 × g met behulp van een TLA-55-rotor gedurende 20 minuten bij 2 °C om de relatief grote molecuulgewichteiwitten als neerslag (P2-fractie) te verkrijgen.
      OPMERKING: Het volume van het monster dat aan de ultracentrifugatiestappen wordt onderworpen, is van invloed op de centrifugatiestraal en de precipitatie-efficiëntie van de moleculen. Houd het monstervolume na deze stap op 200 μl of minder om onnauwkeurige fractionering te voorkomen.
    3. Centrifugeer verder alle resulterende supernatans (S2-fractie) bij 500.000 × g met behulp van een TLA-120.2-rotor gedurende 60 minuten bij 2 °C om de onoplosbare eiwitcomplexen in het neerslag (P3-fractie) te scheiden van oplosbare eiwitten in het supernatans (S3-fractie).
    4. Voeg 400 μL 1x SDS-monsterbuffer (0,08 M Tris pH 6,8; 10% glycerol; 1% 2-mercaptoethanol; 2% SDS) toe aan de P2- en P3-fractiebuisjes en laat het kort soniceren om het neerslag op te lossen. Breng deze fractiemonsters over in een lege microbuis van 1,5 ml.
    5. Los de totale S3-fractie op in 200 μL 2x SDS-monsterbuffer.
    6. Meng de resterende S1-fracties met een gelijk volume van 2x SDS-monsterbuffer voor gebruik als standaardcurve voor Western blotting.
    7. Kook al deze monsters op 100 °C gedurende 3 min. Nadat de monsters zijn afgekoeld tot kamertemperatuur, bewaart u de monsters bij -20 °C.
  4. Kwantificering van eiwitten in elke fractie
    1. Kwantificeer eiwitten in de P2-, P3- en S3-fracties door middel van Western blotting. Gebruik eerst 10% SDS-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) om eiwitten te scheiden van correct verdunde P2-, P3- en S3-fracties, en serieel verdund S1-monster van elk individu als een standaardcurve. Elektroblot de monsters vervolgens op polyvinylideenfluoridemembranen (zie Materiaaltabel).
      OPMERKING: De verdunningsverhouding van elke fractie hangt af van de concentratie van een objectief eiwit en de reactiviteit van het antilichaam. (bijv. α-tubuline, TUBB3, β-tub en getyrosineerde tubuline in hersenweefsel: S3 = 1/400, P3 = 1/2.000, P2 = 1/2.000, S1 = 1/50,000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; geacetyleerde tubuline in hersenweefsel: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8.000, S1 = 1/100.000, 1/40.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/4.000; α-tubuline in lever: S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; α-tubuline in thymus: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000 verdunning van weefselconcentratie).
    2. Blokkeer het membraan met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing (50 mM Tris-HCl pH 7,6; 152 mM NaCl) met 0,1% Tween 20 (TBS-T) gedurende meer dan 30 minuten.
    3. Dompel het membraan gedurende meer dan 2 uur onder in TBS-T-bevattend primair antilichaam (zie Materiaaltabel). Was daarna het membraan met TBS-T gedurende 3 minuten (3 keer).
    4. Label het primaire antilichaam met behulp van HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (zie materiaaltabel) in TBS-T gedurende meer dan 1 uur. Was daarna het membraan met TBS-T gedurende 3 minuten (3 keer).
    5. Ontwikkel de membranen met Enhanced Chemiluminescence reagens. Analyseer vervolgens de banden van belang met een lichtgevende beeldanalysator (zie Tabel met materialen).
    6. Kwantificeer de intensiteiten van de eiwitband met behulp van beeldanalysesoftware (zie Tabel met materialen) en creëer een standaardcurve door de verdunningseenheden van de verdunde S1-monsters die worden gebruikt voor de standaardcurve langs de X-as en de bandintensiteiten langs de Y-as uit te zetten.
    7. Lees de eiwitconcentratie (eenheid) af die overeenkomt met de verdunde fractiemonsters. Vermenigvuldig de afgelezen concentratie met de monsterverdunningsfactor om een eiwiteenheid in elke fractie te verkrijgen. Deel de gemeten eenheid van elke fractie door de totale eiwiteenheid (P2 + P3 + S3) om een percentage te verkrijgen.

2. Evaluatie van de eigenschappen van tubuline in elke fractie

OPMERKING: Deze biochemische methode levert drie groepen tubulinecomplexen op die worden gedefinieerd door sedimentatie-eigenschappen. Hier werd de status van tubulinecomplexen verkregen in deze fracties geïdentificeerd op basis van de grootte van het complex en tubuline-PTM's. Voltooi alle stappen in dit protocol zonder onderbreking in een omgeving met koele temperaturen, maar vries de fractiemonsters niet in totdat ze zijn opgelost in de SDS-monsterbuffer.

  1. Filterval test
    1. Filtreer de S2- en S3-fracties (elk 500 μL) met behulp van een 300 kDa ultrafiltratie-spinkolom (zie Materiaaltabel). Voer een centrifugatie van 14.000 × g uit bij 2 °C totdat het hele supernatans is gefilterd, geëlueerde eiwitten in ontvangerbuizen zijn verzameld en ingesloten eiwitten op het filter van reservoirbuizen achterblijven.
    2. Vertaal de hele filtraten (ongeveer 500 μL) in ontvangerbuisjes in nieuwe 1,5 ml microbuisjes en los ze op in 500 μL 2x SDS-monsterbuffer.
    3. Los de residuen op het filter van reservoirbuisjes op in 1.000 μL 1x SDS-monsterbuffer door te pipetteren en de monsters over te brengen naar een nieuw microbuisje van 1,5 ml.
    4. Kook de monsters gedurende 3 minuten op 100 °C. Nadat de monsters zijn afgekoeld tot kamertemperatuur, bewaart u de monsters bij -20 °C.
    5. Analyseer de hoeveelheden tubuline door Western blotting met DM1A (anti-α-tubuline-antilichaam, zie Tabel met materialen).
  2. Grootte-uitsluitingschromatografie
    1. Bereid de dragerbuffer (0,1 M MES, pH 6,8; 10% glycerol; 1 mM MgSO4; 1 mM EGTA; 0,1 mM DTT) aangevuld met een concentratie van 1/10 protease en fosfataseremmers zoals beschreven in stap 1.1.1. Filter vervolgens de oplossing en bewaar deze in een koude omgeving.
    2. Bereid een gelfiltratiechromatografiekolom voor die is uitgerust met een preparatief vloeistofchromatografiesysteem in een chromatografiekamer (zie materiaaltabel) bij 4 °C.
    3. Voordat u monsters op de kolom injecteert, moet u 180 ml van de dragerbuffer laten stromen om de kolom te wassen. Het debiet is 1 ml/min gedurende 3 uur.
    4. Injecteer in de handel verkrijgbare gezuiverde varkenstubuline (zie materiaaltabel) als controle of de S3-fractie uit muizenhersenen (elk 500 μl) in de kolom.
    5. Elute met een debiet van 1,0 ml/min met dragerbuffer. Verzamel de fracties van 1,5 ml gedurende 120 minuten. Bewaak geëlueerde eiwitten door absorptie bij 280 nm. Houd de maximale druk onder 0.3 MPa.
    6. Na het vortexen van de verzamelde fracties, meng 50 μL ervan met 50 μL 2x SDS-monsterbuffer in een microbuisje van 1,5 ml. Kook alle monsters gedurende 3 minuten op 100 °C. Nadat de monsters zijn afgekoeld tot kamertemperatuur, bewaart u de monsters bij -20 °C.
    7. Analyseer de hoeveelheden tubuline door Western blotting met DM1A, anti-α-tubuline-antilichaam en KMX-1, anti-β-tubuline-antilichaam (zie Materiaaltabel).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Kwantificering van tubuline in de P2-, P3- en S3-fracties uit muizenhersenen door de MT-fractioneringsmethode
Tubuline in muizenweefsel werd gescheiden in de P2-, P3- en S3-fracties door de MT-fractioneringsmethode en gekwantificeerd door Western blotting (Figuur 1A). Het neerslag van MT's dat gedurende 20 minuten in de P2-fractie bleef door ultracentrifugatie bij 100.000 × g was goed voor 34,86% ± 1,68% van de totale tubuline in een muizenbrein. Het supernatans ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De belangrijkste taak bij het onderzoeken van de status van tubuline in weefsel van levende organismen is het voorkomen van accidentele MT-polymerisatie of depolymerisatie tijdens de bereiding. De stabiliteit van MT's in monsters wordt beïnvloed door factoren zoals de concentratie van Taxol in MSB, de verhouding tussen de hoeveelheid weefsel en de buffer en de temperatuur tijdens het proces van weefselverwijdering tot homogenisatie en centrifugatie. Daarom werden de omstandigheden in elke stap van het protocol geoptimali...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door JST: de oprichting van universitaire beurzen voor de oprichting van innovatie op het gebied van wetenschapstechnologie (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid voor JSPS Fellows (A.HT.; 23KJ2078), een Grant-in-Aid for Scientific Research (B) JSPS KAKENHI (22H02946 voor TM), een Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden getiteld "Brain Protein Aging and Dementia Control" van MEXT (TM; 26117004), en door Uehara Research Fellowship van de Uehara Memorial Foundation (TM; 202020027). De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige financiële belangen zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 ML TUBE CASE OF 500Beckman Coulter357448
1A2Sigma-AldrichT90281:5.000 verdunning
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)Nacalai Tesque02442-44
300 kDa ultrafiltration spin columnAprosciencePT-1013
6-11B1Sigma-AldrichT74511:5.000 verdunning
ÄKTAprime plusCytiva11001313
anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch115-035-1461:5.000 verdunning
antipainPeptide Institute Inc.4062
aprotininNacalai Tesque03346-84
Chemi-Lumi One LNacalai Tesque07880-54
Corning bottle-top vacuum filter systemCorning4307580,22µm 33,2cm² Nitrocellulose membraan
DIFPSigma-Aldrich55-91-4 
DIGITAL HOMOGENIZER HK-1AS ONE1-2050-11
DM1ASigma-AldrichT90261:5.000 verdunning
DTTNacalai Tesque14128-46
EGTANacalai Tesque37346-05
FluoroTrans W 3,3 Meter RollPall CorporationBSP0161
glycerolNacalai Tesque17018-25
GTPNacalai Tesque17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE KitmanTOMYKITMAN-24
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg columnCytiva28-9893-35
Image Gauge Software FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation292-69903
KMX-1MilliporeMAB34081:5.000 verdunning
LAS-4000 luminescente beeldanalysatorFUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptinPeptide Institute Inc.43449-62
MgSO4Nacalai Tesque21003-75
Na3VO4Nacalai Tesque32013-92
NaFNacalai Tesque31420-82
okadaic acidLC LaboratoriesO-2220 
OPTIMA MAX-XPBeckman Coulter393315
pepstatinNacalai Tesque26436-52
PMSFNacalai Tesque27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2Beckman Coulter343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free)Roche11873580001
Gezuiverd tubulin CytoskeletonT240
QSONICA Q55QSonicaQ55
TaxolLC LaboratoriesP-9600
TLA-120.2 rotorBeckman Coulter357656
TLA-55 rotorBeckman Coulter366725
TLCKNacalai Tesque34219-94
Triton X-100Nacalai Tesque12967-45
β-glycerofosfaatSigma-AldrichG9422

Referenties

  1. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  2. Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).
  3. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  4. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
  5. Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue. Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).
  6. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the neuronal microtubule cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  7. Leo, L., et al. Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules. Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).
  8. Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  9. Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207(2017).
  10. Baas, P. W., Black, M. M. Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability. Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).
  11. Cartelli, D., et al. Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective. Scientific Reports. 3, 1837(2013).
  12. Zhang, B., et al. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).
  13. Zhang, F., et al. Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease. Translational Neurodegeneration. 4, 9(2015).
  14. Miyasaka, T., et al. Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes. Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).
  15. Fujiwara, H., et al. Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).
  16. Vielkind, U., Swierenga, S. H. A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell. Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).
  17. Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).
  18. Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules. Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).
  19. Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons. Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).
  20. Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).
  21. Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons. Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).
  22. Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation. FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).
  23. Hagita, A., et al. Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability. Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).
  24. Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources. Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).
  25. Vallee, R. B. A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs). Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).
  26. Bartolo, M. E., Carter, J. V. Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach. Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).
  27. Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration. Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).
  28. Fourel, G., Boscheron, C. Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function. FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).
  29. Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia. The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).
  30. Yoshida, H., Ihara, Y. Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau. Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).
  31. Cash, A. D., et al. Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation. The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).
  32. Hempen, B., Brion, J. P. Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).
  33. Miyasaka, T., et al. Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy. Frontiers in Neuroscience. 12, 415(2018).
  34. Boiarska, Z., Passarella, D. Microtubule-targeting agents and neurodegeneration. Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ultracentrifugatietechniektubuline modificatiesWestern blottingmicrotubulusstabiliteitcytoskeletdynamiek

Gerelateerde artikelen