De novo Identificatie van actief vertaalde open leesframes met ribosoomprofileringsgegevens

Samenvatting

Het vertalen van ribosomen decodeert drie nucleotiden per codon in peptiden. Hun beweging langs mRNA, vastgelegd door ribosoomprofilering, produceert de voetafdrukken die karakteristieke triplet periodiciteit vertonen. Dit protocol beschrijft hoe RiboCode te gebruiken om deze prominente functie te ontcijferen uit ribosoomprofileringsgegevens om actief vertaalde open leesframes op het niveau van het hele transcriptoom te identificeren.

Samenvatting

Identificatie van open leesframes (ORF's), met name die welke coderen voor kleine peptiden en actief worden vertaald onder specifieke fysiologische contexten, is van cruciaal belang voor uitgebreide annotaties van contextafhankelijke translatomen. Ribosoomprofilering, een techniek voor het detecteren van de bindingslocaties en dichtheden van het vertalen van ribosomen op RNA, biedt een manier om snel te ontdekken waar translatie plaatsvindt op genoombrede schaal. Het is echter geen triviale taak in de bio-informatica om de vertalende ORF's voor ribosoomprofilering efficiënt en uitgebreid te identificeren. Hier beschreven is een eenvoudig te gebruiken pakket, genaamd RiboCode, ontworpen om te zoeken naar actief vertalende ORF's van elke grootte van vervormde en dubbelzinnige signalen in ribosoomprofileringsgegevens. Dit artikel neemt onze eerder gepubliceerde dataset als voorbeeld en biedt stapsgewijze instructies voor de gehele RiboCode-pijplijn, van het voorbewerken van de onbewerkte gegevens tot de interpretatie van de uiteindelijke uitvoerresultaatbestanden. Bovendien worden voor het evalueren van de omrekeningssnelheden van de geannoteerde ORF's ook procedures voor visualisatie en kwantificering van ribosoomdichtheden op elke ORF in detail beschreven. Samenvattend is dit artikel een nuttige en tijdige instructie voor de onderzoeksgebieden met betrekking tot vertaling, kleine ORF's en peptiden.

Inleiding

Onlangs heeft een groeiend aantal studies een wijdverspreide productie van peptiden onthuld die zijn vertaald uit ORF's van coderende genen en de eerder geannoteerde genen als niet-coderend, zoals lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) 1,2,3,4,5,6,7,8. Deze vertaalde ORF's worden gereguleerd of geïnduceerd door cellen om te reageren op omgevingsveranderingen, stress en celdifferentiatie1,8,9,10,11,12,13. Van de vertaalproducten van sommige ORF's is aangetoond dat ze een belangrijke regulerende rol spelen in diverse biologische processen in ontwikkeling en fysiologie. Chng et ^al.14 ontdekten bijvoorbeeld een peptidehormoon genaamd Elabela (Ela, ook bekend als Apela / Ende / Toddler), dat van cruciaal belang is voor de cardiovasculaire ontwikkeling. Pauli et al. suggereerden dat Ela ook werkt als een mitogeen dat de celmigratie in het vroege visembryo ^bevordert15. Magny et al. rapporteerden twee micropeptiden van minder dan 30 aminozuren die het calciumtransport reguleren en de regelmatige spiercontractie in het Drosophila-hart ^{beïnvloeden10}.

Het blijft onduidelijk hoeveel van dergelijke peptiden door het genoom worden gecodeerd en of ze biologisch relevant zijn. Daarom is systematische identificatie van deze potentieel coderende ORF's zeer wenselijk. Het direct bepalen van de producten van deze ORF's (d.w.z. eiwit of peptide) met behulp van traditionele benaderingen zoals evolutionaire ^{conservering16,17} en massaspectrometrie18,19 is echter een uitdaging omdat de detectie-efficiëntie van beide benaderingen afhankelijk is van de lengte, abundantie en aminozuursamenstelling van de geproduceerde eiwitten of peptiden. De komst van ribosoomprofilering, een techniek voor het identificeren van de ribosoombezetting op mRNA's met nucleotideresolutie, heeft een precieze manier geboden om het ^{coderingspotentieel} van verschillende transcripten3,20,21 te evalueren, ongeacht hun lengte en samenstelling. Een belangrijk en vaak gebruikt kenmerk voor het identificeren van actief vertalende ORF's met behulp van ribosoomprofilering is de drie-nucleotide (3-nt) periodiciteit van de voetafdrukken van het ribosoom op mRNA van het startcodon tot het stopcodon. Ribosoomprofileringsgegevens hebben echter vaak verschillende problemen, waaronder lage en schaarse sequencing-reads langs ORF's, hoge sequencingruis en ribosomale RNA (rRNA) -verontreinigingen. De vervormde en dubbelzinnige signalen die door dergelijke gegevens worden gegenereerd, verzwakken dus de 3-nt periodiciteitspatronen van de voetafdrukken van ribosomen op mRNA, wat uiteindelijk de identificatie van de met hoge betrouwbaarheid vertaalde ORF's moeilijk maakt.

Een pakket met de naam "RiboCode" paste een aangepaste Wilcoxon-signed-rank test en P-value integratiestrategie aan om te onderzoeken of de ORF significant meer in-frame ribosoom-beschermde fragmenten (RPF's) heeft dan off-frame ^RPFs22. Het bleek zeer efficiënt, gevoelig en nauwkeurig te zijn voor de novo annotatie van het translatoom in gesimuleerde en echte ribosoomprofileringsgegevens. Hier beschrijven we hoe we deze tool kunnen gebruiken om de potentiële vertalende ORF's te detecteren uit de ruwe ribosoomprofileringsequencingsets die door de vorige studie zijn ^{gegenereerd23}. Deze datasets werden gebruikt om de functie van EIF3-subeenheid "E" (EIF3E) in vertaling te onderzoeken door de ribosoombezettingsprofielen van MCF-10A-cellen getransfecteerd met controle (si-Ctrl) en EIF3E (si-eIF3e) kleine interfererende RNA's (siRNA's) te vergelijken. Door RiboCode toe te passen op deze voorbeelddatasets, ontdekten we 5.633 nieuwe ORF's die mogelijk coderen voor kleine peptiden of eiwitten. Deze ORF's werden gecategoriseerd in verschillende typen op basis van hun locaties ten opzichte van de coderende regio's, waaronder upstream ORF's (uORF's), downstream ORF's (dORFs), overlappende ORF's, ORF's van nieuwe eiwitcoderende genen (nieuwe PCG's) en ORF's van nieuwe niet-proteïnecoderende genen (nieuwe niet-PCPG's). De RPF-leesdichtheden op uORF's waren significant verhoogd in EIF3E-deficiënte cellen in vergelijking met controlecellen, wat ten minste gedeeltelijk kan worden veroorzaakt door de verrijking van actief translaterende ribosomen. De gelokaliseerde ribosoomaccumulatie in het gebied van het ^25e tot ^75e codon van EIF3E-deficiënte cellen duidde op een blokkering van translatie-elongatie in het vroege stadium. Dit protocol laat ook zien hoe de RPF-dichtheid van het gewenste gebied kan worden gevisualiseerd voor het onderzoeken van de 3-nt periodiciteitspatronen van ribosoomvoetafdrukken op geïdentificeerde ORF's. Deze analyses tonen de krachtige rol van RiboCode bij het identificeren van vertalende ORF's en het bestuderen van de regulatie van vertaling.

Protocol

1. Omgevingsinstellingen en RiboCode-installatie

1. Open een Linux-terminalvenster en maak een conda-omgeving:
   conda create -n RiboCode python=3.8
2. Schakel over naar de gecreëerde omgeving en installeer RiboCode en afhankelijkheden:
   conda activeer RiboCode
   conda install -c bioconda ribocode ribominer sra-tools fastx_toolkit cutadapt bowtie star samtools

2. Voorbereiding van de gegevens

1. Krijg genoomreferentiebestanden.
   1. Ga voor de referentiereeks naar de Ensemble-website op https://www.ensembl.org/index.html, klik op het hoofdmenu Downloaden en op ftp-download aan de linkerkant. Klik in de gepresenteerde tabel op FASTA in de kolom DNA (FASTA) en de rij waar Species is Human. Kopieer op de geopende pagina de link van Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz en download en pak het uit in de terminal:
      WGET -c \
      http://ftp.ensembl.org/pub/release-104/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
      gzip -d Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
   2. Voor referentieannotatie klikt u met de rechtermuisknop op GTF in de kolom Genensets op de laatst geopende webpagina. Kopieer de link van Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf.gz en download het met behulp van:
      WGET -c \
      http://ftp.ensembl.org/pub/release-104/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.104.gtf.gz
      gzip -d Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf.gz
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het GTF-bestand van de Ensemble-website te halen, omdat het genoomannotaties bevat die zijn georganiseerd in een hiërarchie op drie niveaus, d.w.z. elk gen bevat transcripten die exonen en optionele vertalingen bevatten (bijv. Coderingssequenties [CDS], vertaalstartsite, vertaaleindsite). Wanneer de annotaties van een gen of transcript ontbreken, bijvoorbeeld een GTF-bestand dat is verkregen van UCSC of NCBI, gebruikt u GTFupdate om een bijgewerkte GTF te genereren met volledige bovenliggende-kindhiërarchie-annotaties: GTFupdate original.gtf > updated.gtf. Gebruik voor het annotatiebestand in de GFF-indeling de AGAT ^toolkit24 of een ander hulpmiddel om te converteren naar de .gtf-indeling.
2. Krijg rRNA-sequenties.
   1. Open UCSC Genome Browser op https://genome.ucsc.edu en klik op Extra | Tabelbrowser in de vervolgkeuzelijst.
   2. Geef op de geopende pagina Zoogdier voor clade, Mens voor genoom, Alle tabellen voor groep, rmask voor tabel en genoom voor regio op. Klik voor filter op Maken om naar een nieuwe pagina te gaan en repClass in te stellen zoals overeenkomt met rRNA.
   3. Klik op Verzenden en stel vervolgens het uitvoerformaat in op volgorde en uitvoerbestandsnaam als hg38_rRNA.fa. Klik ten slotte op Uitvoer ophalen | Krijg sequentie om de rRNA-sequentie op te halen.
3. Download ribosoomprofileringsdatasets van Sequence Read Archive (SRA).
   1. Download de replicatvoorbeelden van de si-eIF3e-behandelingsgroep en hernoem ze:
      fastq-dump SRR9047190 SRR9047191 SRR9047192
      mv SRR9047190.fastq si-eIF3e-1.fastq
      mv SRR9047191.fastq si-eIF3e-2.fastq
      mv SRR9047192.fastq si-eIF3e-3.fastq
   2. Download de replicatievoorbeelden van de controlegroep en wijzig de naam ervan:
      fastq-dump SRR9047193 SRR9047194 SRR9047195
      MV SRR9047193.fastq si-Ctrl-1.fastq
      mv SRR9047194.fastq si-Ctrl-2.fastq
      mv SRR9047195.fastq si-Ctrl-3.fastq
      OPMERKING: De SRA-toetredings-ID's voor deze voorbeeldgegevenssets zijn verkregen van de Gene Expression Omnibus (GEO) ^website25 door te zoeken naar GSE131074.

3. Trim adapters en verwijder rRNA-verontreiniging

1. (Optioneel) Verwijder adapters uit de sequencinggegevens. Sla deze stap over als de adapterreeksen al zijn bijgesneden, zoals in dit geval. Gebruik anders cutadapt om de adapters uit leesbewerkingen bij te snijden.
   voor i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
   doen
   cutadapt -m 15 --match-read-jocards -a CTGTAGGCACCATCAAT \
   -o ${i}_trimmed.fastq ${i}.fastq
   klaar
   OPMERKING: De adaptervolgorde na -a parameter is afhankelijk van de voorbereiding van de cDNA-bibliotheek. Leestijden korter dan 15 (gegeven door -m) worden weggegooid omdat de ribosoom-beschermde fragmenten meestal langer zijn dan deze grootte.
2. Verwijder rRNA-besmetting met behulp van de volgende stappen:
   1. Index rRNA referentiesequenties:
      bowtie-build -f hg38_rRNA.fa hg38_rRNA
   2. Lijn de reads uit op rRNA-referentie om de reads afkomstig van rRNA uit te sluiten:
      voor i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
      doen
      bowtie -n 0 -y -a --norc --best --strata -S -p 4 -l 15 \
      --un=./${i}_noncontam.fastq hg38_rRNA -q ${i}.fastq ${i}.aln
      klaar
      -p geeft het aantal threads aan voor het parallel uitvoeren van de taken. Gezien de relatief kleine omvang van de RPF-reads moeten andere argumenten (bijv. -n, -y, -a, -norc, --best, --strata en -l) worden gespecificeerd om te garanderen dat de gerapporteerde uitlijningen het beste zijn. Raadpleeg voor meer informatie de ^{Bowtie-website26}.

4. Stem de clean reads af op het genoom

1. Maak een genoomindex.
   mkdir STAR_hg38_genome
   STAR --runThreadN 8 --runMode genomeGenerate --genomeDir ./STAR_hg38_genome --genomeFastaFiles Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa --sjdbGTFfile Homo_sapiens. GrCh38.104.gtf
2. Lijn de schone reads (geen rRNA-contaminatie) uit op de gemaakte referentie.
   voor i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
   doen
   STAR --runThreadN 8 --outFilterType Normal --outWigType wiggle --outWigStrand Stranded --outWigNorm RPM --outFilterMismatchNmax 1 --outFilterMultimapNmax 1 --genomeDir STAR_hg38_genome --readFilesIn ${i}_noncontam.fastq --outFileNamePrefix ${i}. --outSAMtype BAM SortedByCoordinate --quantMode TranscriptomeSAM GeneCounts --outSAMattributes All
   klaar
   OPMERKING: Een ongetemd nucleotide wordt vaak toegevoegd aan het 5'-uiteinde van elk gelezen door de reverse ^{transcriptase27}, die efficiënt wordt afgesneden door STAR omdat het standaard soft-clipping uitvoert. De parameters voor STAR worden beschreven in STAR ^manual28.
3. Uitlijningsbestanden sorteren en indexeren.
   voor i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
   doen
   samtools sorteren -T ${i}. Uitgelijnd.toTranscriptome.out.sorted \
   -o ${i}. Uitgelijnd.toTranscriptome.out.sorted.bam \
   ${i}. Uitgelijnd.opTranscriptome.out.bam
   samtools index ${i}. Uitgelijnd.opTranscriptome.out.sorted.bam
   samtools index ${i}. Uitgelijnd.gesorteerdByCoord.out.bam
   klaar

5. Grootteselectie van RPF's en identificatie van hun P-sites

1. Bereid de transcriptannotaties voor.
   prepare_transcripts -g Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf \
   -f Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa -o RiboCode_annot
   OPMERKING: Deze opdracht verzamelt de vereiste informatie van mRNA-transcripten uit het GTF-bestand en extraheert de sequenties voor alle mRNA-transcripten uit het FASTA-bestand (elk transcript wordt samengesteld door de exonen samen te voegen volgens de structuren die zijn gedefinieerd in het GTF-bestand).
2. Selecteer RPF's van specifieke lengtes en identificeer hun P-site posities.
   voor i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
   doen
   metaplots -a RiboCode_annot -r ${i}. Aligned.toTranscriptome.out.bam \
   -o ${i} -f0_percent 0,35 -pv1 0,001 -pv2 0,001
   klaar
   OPMERKING: Met deze opdracht worden de geaggregeerde profielen van het 5'-uiteinde van de uitgelijnde afleespunten van elke lengte rond geannoteerde translatiestart(of stop)codons weergegeven. De leeslengte-afhankelijke P-site kan handmatig worden bepaald door de verdelingsdiagrammen (bijv. figuur 1B) van offsetafstanden tussen 5'-uiteinden van de major reads en het startcodon te onderzoeken. RiboCode genereert ook een configuratiebestand voor elk monster, waarin de P-siteposities van reads met significante 3-nt periodiciteitspatronen automatisch worden bepaald. De parameters -f0_percent, -pv1 en -pv2 definiëren de verhoudingsdrempel en p-waardeafsnijdingen voor het selecteren van de RPF-waarden die in het leesframe zijn verrijkt. In dit voorbeeld worden de nucleotiden +12, +13 en +13 van het 5'-uiteinde van de 29-, 30- en 31-waarden handmatig gedefinieerd in elk configuratiebestand.
3. Bewerk de configuratiebestanden voor elk voorbeeld en voeg ze samen
   OPMERKING: Om een consensusset van unieke ORF's te genereren en te zorgen voor voldoende dekking van leesbewerkingen om latere analyses uit te voeren, worden de geselecteerde leesbewerkingen van alle monsters in de vorige stap samengevoegd. De leesbewerkingen van specifieke lengtes die zijn gedefinieerd in merged_config.txt bestand (aanvullend bestand 1) en hun P-site-informatie worden gebruikt voor het evalueren van het vertaalpotentieel van ORF's in de volgende stap.

6. De novo annotate vertalen van ORF's

1. Voer RiboCode uit.
   RiboCode -a RiboCode_annot -c merged_config.txt -l ja -g \
   -o RiboCode_ORFs_result -s ATG -m 5 -A CTG,GTG,TTG
   Waarbij de belangrijke parameters van deze opdracht als volgt zijn:
   -c, configuratiebestand met het pad van invoerbestanden en de informatie van geselecteerde reads en hun P-sites.
   -l, voor transcripties met meerdere startcodons stroomopwaarts van de stopcodons, of de langste ORF's (het gebied van het meest distale startcodon tot stopcodon) worden gebruikt voor het evalueren van hun vertaalpotentieel. Indien ingesteld op nee, worden de startcodons automatisch bepaald.
   -s, het canonieke startcodon(en) dat wordt gebruikt voor ORFs-identificatie.
   -A, (optioneel) de niet-canonische startcodons (bijv. CTG, GTG en TTG voor de mens) die worden gebruikt voor ORF-identificatie, die kunnen verschillen in mitochondriën of kern van andere ^soorten29.
   -m, de minimale lengte (d.w.z. aminozuren) van ORF's.
   -o, het voorvoegsel van de uitvoerbestandsnaam met de details van voorspelde ORF's (aanvullend bestand 2).
   -g en -b, voer de voorspelde ORF's uit naar respectievelijk gtf - of bedformaat .

7. (Facultatieve) ORF-kwantificering en statistieken

1. Tel RPF leest in elke ORF.
   voor i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
   doen
   ORFcount -g RiboCode_ORFs_result_collapsed.gtf \
   -r ${i}. Uitgelijnd.gesorteerdByCoord.out.bam -f 15 -l 5 -m 25 -M 35 \
   -o ${i}_ORF.counts -s ja -c intersection-strict
   klaar
   OPMERKING: Om de potentiële accumulatie van ribosomen rond het begin en het einde van ORF's uit te sluiten, wordt het aantal waarden toegewezen in de eerste 15 (gespecificeerd door -f) en de laatste 5 codons (specifiek door -l) niet meegeteld. Optioneel zijn de lengtes van getelde RPF's beperkt tot het bereik van 25 tot 35 nt (gangbare grootten van RPF's).
2. Bereken basisstatistieken van de gedetecteerde ORF's met RiboCode:
   Rscript RiboCode_utils. R
   OPMERKING: RiboCode_utils. R (Supplemental File 3) biedt een reeks statistieken voor de RiboCode-uitvoer, bijvoorbeeld het tellen van het aantal geïdentificeerde ORF's, het bekijken van de verdeling van ORF-lengtes en het berekenen van de genormaliseerde RPF-dichtheden (d.w.z. RPKM, leest per kilobase per miljoen in kaart gebrachte reads).

8. (Optionele) Visualisatie van de voorspelde ORF's

1. Verkrijg de relatieve posities van de start- en stopcodons voor de gewenste ORF (bijv. ENSG00000100902_35292349_35292552_67) op het transcript van RiboCode_ORFs_result_collapsed.txt (aanvullend bestand 3). Plot vervolgens de dichtheid van RPF-waarden in de ORF:
   plot_orf_density -a RiboCode_annot -c merged_config.txt -t ENST00000622405 \
   -s 33 -e 236 --start-codon ATG -o ENSG00000100902_35292349_35292552_67
   Waarbij -s en -e de start- en stoppositie van de translatie van het plotten van ORF specificeren. --start-codon definieert het startcodon van de ORF, dat in de figuurtitel zal verschijnen. -o definieert het voorvoegsel van de naam van het uitvoerbestand.

9. (Optionele) Metagene analyse met RiboMiner

OPMERKING: Voer de metagene analyse uit om de invloed van EIF3E knockdown op de translatie van geïdentificeerde geannoteerde ORF's te beoordelen, volgens de onderstaande stappen:

1. Genereer transcriptannotaties voor RiboMiner, dat het langste transcript voor elk gen extraheert op basis van het annotatiebestand dat door RiboCode wordt gegenereerd (stap 5.1).
   UitgangTranscriptInfo -c RiboCode_annot/transcripts_cds.txt \
   -g Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf -f RiboCode_annot/transcripts_sequence.fa \
   -o longest.transcripts.info.txt -O all.transcripts.info.txt
2. Bereid het configuratiebestand voor RiboMiner voor. Kopieer het configuratiebestand dat is gegenereerd door de opdracht metaplots van RiboCode (stap 5.4) en hernoem het naar 'RiboMiner_config.txt'. Wijzig het vervolgens volgens het formaat dat wordt weergegeven in Aanvullend bestand 4.
3. Metagene analyses met RiboMiner
   1. Gebruik MetageneAnalysis om een geaggregeerd en gemiddeld profiel van de dichtheden van RPF's over transcripties te genereren.
      MetageneAnalysis -f RiboMiner_config.txt -c longest.transcripts.info.txt \
      -o MA_normed -U codon -M RPKM -u 100 -d 400 -l 100 -n 10 -m 1 -e 5 --norm ja \
      -y 100 --type UTR
      Waar belangrijke parameters zijn: --type, het analyseren van CDS - of UTR-regio's ; --norm, of de leesdichtheid is genormaliseerd; -y, het aantal codons dat voor elk transcript is gebruikt; -U, plot RPF-dichtheid op codonniveau of nt-niveau ; -u en -d, definieer het bereik van de analysegebieden ten opzichte van startcodon of stopcodon; -l, de minimale lengte (d.w.z. het aantal codons) van CDS; -M, de modus voor het filteren van transcripten, telt of RPKM; -n minimumtellingen of RPKM in CDS voor analyse. -m minimumtellingen of RPKM van CDS in het genormaliseerde gebied; -e, het aantal codons dat is uitgesloten van het genormaliseerde gebied.
   2. Genereer een set pdf-bestanden voor het vergelijken van de ribosoombezettingen op mRNA in controlecellen en eIF3-deficiënte cellen.
      PlotMetageneAnalyse -i MA_normed_dataframe.txt -o MA_normed \
      -g si-Ctrl,si-eIF3e -r si-Ctrl-1,si-Ctrl-2,si-Ctrl-3__si-eIF3e-1,si-eIF3e-2,si-eIF3e-3 -u 100 -d 400 --mode mean
      OPMERKING: PlotMetageneAnalysis genereert de set pdf-bestanden. Details over het gebruik van MetageneAnalysis en PlotMetageneAnalysis zijn beschikbaar op RiboMiner ^website30.

Resultaten

De voorbeelddatasets voor ribosoomprofilering werden in de GEO-database gedeponeerd onder het toetredingsnummer GSE131074. Alle bestanden en codes die in dit protocol worden gebruikt, zijn beschikbaar in aanvullende bestanden 1-4. Door RiboCode toe te passen op een reeks gepubliceerde ribosoomprofileringsdatasets23, identificeerden we de nieuwe ORF's die actief werden vertaald in MCF-10A-cellen die werden behandeld met controle- en EIF3E siRNA's.

Discussie

Ribosoomprofilering biedt een ongekende kans om de werking van de ribosomen in cellen op genoomschaal te bestuderen. Het nauwkeurig ontcijferen van de informatie die door de ribosoomprofileringsgegevens wordt gedragen, kan inzicht geven in welke regio's van genen of transcripten actief worden vertaald. Dit stapsgewijze protocol biedt richtlijnen voor het gebruik van RiboCode om ribosoomprofileringsgegevens in detail te analyseren, inclusief pakketinstallatie, gegevensvoorbereiding, uitvoering van opdrachten, resultaatuit...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Een computer/server die Linux draait	Alle	-	-
Anaconda of Miniconda	Anaconda	-	Anaconda: https://www.anaconda.com; Miniconda:https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
R	R Foundation	-	https://www.r-project.org/
Rstudio	Rstudio	-	https://www.rstudio.com/