Methodenartikel

Primaire menselijke neusepitheelcellen: biobanking in de context van precisiegeneeskunde

DOI:

10.3791/63409

⸱

22 april 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Necker Enfants Malades, 2Université de Paris, 3Centre de Référence Maladies Rares Mucoviscidose et Maladies apparentées, Assistance Publique Hôpitaux de Paris

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we de isolatie, versterking en differentiatie van primaire menselijke nasale epitheelcellen (HNE) op het lucht-vloeistofinterface en een biobankingprotocol dat het mogelijk maakt om met succes versterkte HNE te bevriezen en vervolgens te ontdooien. Het protocol analyseert elektrofysiologische eigenschappen van gedifferentieerde HNE-cellen en CFTR-gerelateerde chloridesecretiecorrectie bij verschillende modulatorbehandelingen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke nasale epitheelcellen (HNE) zijn gemakkelijk te verzamelen door eenvoudig, niet-invasief neusborstelen. Patiënt-afgeleide primaire HNE-cellen kunnen worden versterkt en gedifferentieerd tot een pseudo-gestratificeerd epitheel in lucht-vloeistof interfaceomstandigheden om cyclisch AMP-gemedieerd chloride (Cl-) transport te kwantificeren als een index van cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) functie. Als kritieke stappen zoals de kwaliteit van nasaal borstelen en celdichtheid bij cryopreservatie efficiënt worden uitgevoerd, kunnen HNE-cellen met succes worden gebiobankeerd. Bovendien tonen kortsluitstroomstudies aan dat vries-ontdooien de elektrofysiologische eigenschappen en respons van HNE-cellen op CFTR-modulatoren niet significant wijzigt. In de kweekomstandigheden die in deze studie worden gebruikt, wanneer minder dan 2 x 106 cellen per cryoviaal worden ingevroren, is het faalpercentage zeer hoog. We raden aan om minimaal 3 x 106 cellen per cryoviaal in te vriezen. We tonen aan dat dubbele therapieën die een CFTR-corrector combineren met een CFTR-potentiator een vergelijkbare correctie-werkzaamheid hebben voor CFTR-activiteit in F508del-homozygote HNE-cellen. Drievoudige therapie VX-445 + VX-661 + VX-770 verhoogde significant de correctie van CFTR-activiteit in vergelijking met duale therapie VX-809 + VX-770. De meting van CFTR-activiteit in HNE-cellen is een veelbelovende preklinische biomarker die nuttig is om CFTR-modulatortherapie te begeleiden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cystic Fibrosis (CF) is een autosomaal recessieve aandoening als gevolg van mutaties in het Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gen dat leidt tot de afwezigheid of disfunctie van het CFTR-eiwit, een anionkanaal gelegen aan het apicale oppervlak van epithelia 1,2. Recente ontwikkelingen in CFTR-therapie hebben de prognose van de ziekte verbeterd en de laatste goedgekeurde geneesmiddelen die CFTR-correctoren en CFTR-potentiators combineren, hebben geleid tot grote verbeteringen in de longfunctie en kwaliteit van leven voor CF-patiënten met de meest voorkomende mutatie p.Phe508del-mutatie (F508del)3,4. Ondanks deze veelbelovende therapeutische vooruitgang komt ongeveer 10% van de CF-patiënten niet in aanmerking omdat ze mutaties dragen die niet te redden zijn door deze CFTR-modulatoren. Voor deze patiënten is het nodig om andere geneesmiddelen of medicijncombinaties te testen om de meest efficiënte combinatie voor specifieke mutaties te vinden, wat het belang van gepersonaliseerde therapieën benadrukt.

Menselijke nasale epitheelcellen (HNE) zijn gemakkelijk te verzamelen door eenvoudige, niet-invasieve neusborsteling en maken kwantificering van cyclisch AMP-gemedieerd chloride (Cl−) transport als een index van CFTR-functie mogelijk. HNE-cellen leveren een nauwkeurig model van de menselijke luchtwegen, maar hun levensduur is beperkt in cultuur. Dankzij de optimalisatie van kweektechnieken kunnen patiënt-afgeleide primaire HNE-cellen voorwaardelijk worden geherprogrammeerd met Rho-geassocieerde kinaseremmer (ROCKi), versterkt en gedifferentieerd tot een pseudo-gestratificeerd epitheel in lucht-vloeistof interface (ALI) omstandigheden op microporeuze filters 5,6. Er bestaan tal van kweekprotocollen voor HNE-cultuur (in de handel verkrijgbaar, serumvrij, "zelfgemaakt", co-kweek met feedercellen, enz.), en de keuze van media en kweekomstandigheden is beschreven om de groei, celpopulatiedifferentiatie en epitheliale functie te beïnvloeden 7,8. Het protocol presenteert hier een vereenvoudigde, feedervrije ROCKi-amplificatiemethode die het mogelijk maakt om met succes een groot aantal HNE-cellen te verkrijgen die vervolgens worden gedifferentieerd bij ALI voor CFTR-functietests.

We hebben aangetoond dat in gedifferentieerde HNE-cellen een behandeling van 48 uur met CFTR-modulatoren voldoende is om elektrofysiologische correctie van CFTR-afhankelijke Cl-stroom te induceren en dat de in vitro waargenomen correctie gecorreleerd kan zijn met de klinische verbetering van de patiënt9. HNE-cellen vormen daarom een geschikt model, niet alleen voor fundamenteel CF-onderzoek, maar ook voor preklinische studies met patiëntspecifieke CFTR-modulatortests. In deze context van gepersonaliseerde therapie was het doel van het protocol om te valideren dat gecryopreserveerde HNE-cellen van CF-patiënten, gekweekt in onze omstandigheden, een geschikt model waren voor CFTR-correctiestudies, en vergelijkbare resultaten konden worden verwacht bij het vergelijken van CFTR-afhankelijk Cl-transport van verse en bevroren ontdooide cellen. De studie beoordeelde ook de werkzaamheid van verschillende CFTR-modulatoren bij het gebruik van dubbele en drievoudige therapieën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen en voorschriften beschreven door de Verklaring van Helsinki en de Huriet-Serusclat wet op de ethiek van het menselijk onderzoek.

1. Bereiding van kolven en verschillende media

  1. Bereid versterking, luchtvloeistof en vriesmedium zoals beschreven in tabel 1.
  2. Bereid een stockoplossing van menselijk collageen IV door 50 mg collageen op te lossen in 100 ml 0,2% ijsazijn. Meng gedurende ten minste 1 uur op een magneetroerder en filtreer de oplossing. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden in een glazen fles, beschermd tegen licht.
  3. Bereid een werkoplossing van collageen IV door de stamoplossing 1:5 te verdunnen in dubbel gedestilleerd water. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden.
  4. Verdek plastic celkweekkolven of transwellfilters met de collageenwerkoplossing. Verdeel 100 μL voor 0,33 cm2 transwellfilters, 500 μL voor25 cm 2 kolven en 1 ml voor 75 cm2 kolven gelijkmatig over het hele groeioppervlak van de kolf.
    OPMERKING: Dit kan worden bereikt door de kolf voorzichtig van links naar rechts te kantelen. Als alternatief, om het coaten van de kolven te vergemakkelijken, kan een verhoogd volume worden gebruikt en wanneer het hele oppervlak gelijkmatig is bedekt, wordt collageenoplossing aangezogen om alleen het aangegeven volume achter te laten. De aangezogen collageenoplossing kan vervolgens onmiddellijk worden gebruikt om de volgende kolf te coaten (d.w.z. voor drie kolven van 75 cm2 , 3 ml collageenoplossing gelijkmatig verdelen in de eerste kolf, 2 ml opzuigen, die vervolgens worden gebruikt voor de volgende kolf, enzovoort).
  5. Laat de celkweekkolven minimaal 2 uur of een nacht in de couveuse liggen. Zuig het collageen grondig op en laat de kolven minimaal 20 minuten of een nacht drogen in de couveuse of onder de motorkap.
  6. Was met 10 ml Mg2+- en Ca2+-vrije DPBS, laat drogen in de couveuse en bewaar in aluminiumfolie ter bescherming tegen licht. Bewaar de kolven maximaal 6 maanden bij kamertemperatuur (RT).

2. Nasaal borstelen

OPMERKING: Zorg ervoor dat nasaal poetsen wordt uitgevoerd terwijl de deelnemer geen acute infectie heeft. Als CF-patiënten een longinfectie vertonen, raadpleeg dan het antibiogram van de patiënt en voeg extra antibiotica toe aan het amplificatiemedium. Menselijke nasale epitheelcellen werden verzameld door nasale borsteling van F508del/F508del-patiënten zoals eerder beschreven9.

  1. Vraag de patiënt om zijn neus te snuiten en vervolgens het slijmvlies van beide neusgaten topisch te anesthetiseren met katoenen mazen gedrenkt in xylocaïne 5% met nafazoline-oplossing.
  2. Borstel voorzichtig de mediale wand en het inferieure turbinaat van beide neusgaten met behulp van een cytologieborstel. Week de borstel in een buis van 15 ml met 2 ml in de handel verkrijgbaar spoelmedium; schud voorzichtig om cellen los te maken. Herhaal het poetsen in het tweede neusgat.
  3. Voeg de volgende antibiotica toe aan het spoelmedium: Penicilline (100 E/ml), Streptomycine (100 μg/ml), Tazocilline (10 μg/ml), Amfotericine B (2,5 μg/ml) en Colimycine (16 μg/ml).
    OPMERKING: Neusborstels kunnen bij RT worden verzonden naar speciale laboratoria voor uitbreiding en kweek en kunnen tot 72 uur na het poetsen worden gezaaid.

3. Isolatie van HNE

OPMERKING: HNE werden geïsoleerd uit de cytologieborstel, gewassen met Mg2+- en Ca2+-vrije DPBS, gedissocieerd met 0,25% Trypsine en gezaaid op een 25 cm2 plastic kolf zoals eerder beschreven10.

  1. Maak cellen los van de cytologieborstel door de borstel herhaaldelijk door een pipetkegel van 1000 μL te laten gaan en te spoelen met 2 ml Mg2+- en Ca2+-vrije DPBS. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
  2. Resuspend de pellet in 0,25% Trypsine gedurende 8-12 minuten om cellen te dissociëren. Stop de enzymatische reactie door 5 ml van het versterkingsmedium toe te voegen.
  3. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Resuspend de pellet in 8 ml van het versterkingsmedium en zaad op een 25 cm2 collageen-gecoate kolf. Groei bij 37 °C en 5% CO2. Dit komt overeen met passage 0.
  4. Vervang de volgende dag het medium door 5 ml vers versterkingsmedium en controleer de cellen dagelijks op hechting, morfologie (cellen moeten een samenhangend geplaveid uiterlijk hebben) en aantal.
    OPMERKING: De initiële zaaidichtheid varieert afhankelijk van de kwaliteit van de neusborsteling en het aandeel epitheelcellen. Vers geïsoleerde HNE-cellen bereiken meestal 80% -90% confluentie binnen 3-10 dagen. Een langzamere groeisnelheid wijst op onvoldoende epitheelcellen in het monster en moet worden weggegooid.

4. Versterking en passaging van menselijke neusepitheelcellen

  1. Kweek menselijke neusepitheelcellen in het versterkingsmedium bij 37 °C en 5% CO2 op met collageen beklede kolven tot 80%-90% confluentie, waarbij het medium om de 48-72 uur wordt vervangen. Gebruik voor25 cm 2 kolven 5 ml versterkingsmedium en 10 ml voor 75 cm2 kolven.
  2. Wanneer cellen 80% -90% confluentie bereiken, wast u de cellen met 10 ml Mg2 + - en Ca2 + -vrije DPBS, aspiraat en gooit u weg.
  3. Voeg 1 ml 0,25% trypsine toe voor een kolf van25 cm 2 (of 2 ml trypsine voor een kolf van 75 cm2 ) en breng terug naar de incubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 8-12 minuten.
  4. Tik stevig op de kolf, met de palm van de hand, om de cellen los te maken.
  5. Voeg 10 ml van het versterkingsmedium toe om de enzymatische reactie te stoppen. Spoel de kolf krachtig af en gebruik de pipet van 10 ml om het versterkingsmedium op te zuigen en over het kolfoppervlak te drijven om cellen te spoelen en los te maken.
  6. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
  7. Resuspend de pellet in 5-10 ml van het versterkingsmedium.
  8. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
    OPMERKING: Cellen kunnen op dit punt worden bevroren (zie stappen 5.1-5.3). Als verdere versterking nodig is, zaai dan opnieuw in met collageen beklede kolven (een kolf van25 cm 2 kan worden uitgebreid tot drie kolven van 75 cm2 , een grotere verdunning wordt niet aanbevolen).

5. Cryopreservatie van primaire nasale epitheelcellen

OPMERKING: Kweek HNE-cellen tot passage 1 vóór biobanking om voldoende cellen te verkrijgen om de celgroei te vergemakkelijken wanneer ze worden ontdooid. Biobanking is echter mogelijk bij initiële passage 0 of passage 2. De volgende cryopreservatiestappen zijn aangepast aan alle passages.

  1. Centrifugeer na het tellen van de cellen bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C en gooi het supernatant weg
  2. Resuspend de pellet in het verrijkte vriesmedium (tabel 1) om 3 x 106-5 x 106 cellen per ml en per cryoviaal te verkrijgen.
  3. Vries de cellen langzaam in door de temperatuur te verlagen tot ~1 °C per minuut in een geschikte cryo-vriescontainer bij -80 °C. Verplaats het geconserveerde monster de volgende dag naar een stikstofopslagcontainer voor langdurige opslag (de huidige studie is beperkt tot 17 maanden opslag).

6. Ontdooien van bevroren versterkte HNE-cellen

  1. Warm het waterbad op tot 37 °C. Bereid het versterkingsmedium zoals beschreven in tabel 1 en verwarm het medium tot 37 °C.
  2. Verwijder cryovialen uit de stikstofopslagtank en plaats ze snel in het waterbad, zorg ervoor dat de hele injectieflacon niet in het water wordt ondergedompeld. Verwijder de cryovialen uit het waterbad wanneer er nog maar een klein bevroren druppeltje overblijft. Veeg de injectieflacon af met 70% alcohol, veeg droog en plaats deze onder de motorkap.
  3. Breng met een pipet van 1 ml de ontdooide cellen over in een lege buis van 15 ml.
  4. Voeg op een druppelsgewijze manier 1 ml warm versterkingsmedium toe. Voeg na 1 minuut nog eens 1 ml versterkingsmedium toe en wacht nog een minuut.
  5. Voeg 10 ml van het versterkingsmedium toe en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 500 x g.
  6. Aspirateer en gooi het supernatant weg. Resuspend de celkorrel in een volume versterkingsmedium dat nodig is om een celdichtheid van ten minste 1 x 106 cellen/ml te bereiken.
  7. Zaai de cellen op een met collageen beklede kolf die het versterkingsmedium bevat.
    1. Als het cryoviaal meer dan 4 x 106 cellen bevat, zaai dan in een kolf van 75 cm2 , in 10 ml van het versterkingsmedium
    2. Indien cryoviaal minder dan 4 x 106 cellen bevat, zaadcellen op een kolf van25 cm 2 , in 5 ml van het versterkingsmedium
  8. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 en observeer visueel de celexpansie in de komende 2-3 dagen.
  9. Voer vervolgens celversterking uit zoals beschreven in sectie 4.
    OPMERKING: Als er in stap 4.7 weinig cellen zijn geoogst. (d.w.z. als het bevriest bij passage 0 vóór uitzetting), stap 6.5. en 6.6. kan worden weggelaten en cellen kunnen rechtstreeks op een 25 cm2 collageen-gecoate kolf worden gezaaid zonder centrifugeren. Het medium moet dan de volgende dag worden vervangen om dimethylsulfoxide (DMSO) te verwijderen.

7. Differentiatie van menselijke neusepitheelcellen op het lucht-vloeistof grensvlak

OPMERKING: HNE werden gedifferentieerd op de lucht-vloeistof interface zoals eerder beschreven10.

  1. Zaai de cellen met een dichtheid van 330.000 cellen/filter op 0,33 cm2 collageen-gecoate poreuze filters en vul aan met 300 μL van het versterkingsmedium aan de apicale kant en 900 μL van het lucht-vloeibare medium aan de basolaterale kant.
  2. Na 3 dagen aspiraleer het apicale medium en kweek de cellen op de lucht-vloeistof interface gedurende 3-4 weken in het lucht-vloeistof medium om een gedifferentieerd epitheel tot stand te brengen. Vervang het basale medium elke 48-72 uur.

8. CFTR-modulatoren

  1. Bereid lucht-vloeibaar medium voor dat CFTR-modulatoren bevat. Gebruik VX-445, VX-661 en VX-809 bij een eindconcentratie van 3 μM en VX-770 bij 100 nM. Gebruik corrector ABBV-2222 bij 1 μM eindconcentratie en potentiator ABBV-974 bij 10 μM. Gebruik 100% DMSO om alle CFTR-modulatoren op te lossen.
  2. Bereid lucht-vloeibaar medium met dezelfde hoeveelheid 100% DMSO als in correctormedium.
  3. Voeg het medium dat geneesmiddelen of DMSO bevat toe aan de basolaterale kant van gepolariseerde HNE-cellen die zijn gekweekt op een lucht-vloeistofinterface en incubeer gedurende 24 uur in 5% CO2 bij 37 °C.
  4. Na 24 uur het medium aanzuigen en weggooien en vervangen door een vers medium dat is bereid zoals in de stappen 8.1 tot en met 8.2, en verder gedurende een periode van 24 uur incuberen in 5 % CO2 bij 37 °C.

9. Ussing kamerstudies

  1. Meet kortsluitstroommetingen (Isc) onder spanningsklemomstandigheden zoals eerder beschreven9.
    OPMERKING: Transepitheliale elektrische weerstand (TEER) van culturen werd gemeten met een eetstokvoltmeter en alleen culturen die ten minste 200 Ω·cm2 bereikten, werden in aanmerking genomen voor de volgende experimenten. Filters van gepolariseerde HNE-cellen werden gemonteerd in Ussing-kamers en kortsluitstroommetingen (Isc) werden gemeten onder spanningsklemomstandigheden.

10. Immunocytochemie

  1. Voer immunodetectie uit zoals eerder beschreven9.
    OPMERKING: CFTR-immunodetectie werd uitgevoerd met behulp van het anti-CFTR C-terminale (24-1) monoklonale antilichaam gedurende de nacht bij een verdunning van 1/100. Zona-occludens-1 (ZO-1) (1/500 verdunning), alfa-tubuline (1/300 verdunning), Muc 5AC (1/250 verdunning) en cytokeratine 8 (1/250 verdunning) kleuring werden gedaan op extra filters. Na het wassen met PBS-Triton-X100 0,1%, werden secundaire antilichamen van geiten geconjugeerd aan Alexa 488 of 594 gedurende 30 minuten toegevoegd in 10% geitenserum (1/1000 verdunning). Na een laatste wasbeurt werden filters van de steun gesneden en gemonteerd met Vectashield-montagemedium met DAPI. Een confocale microscoop (63x/1.4 olie differentieel interferentie contrast λ blauwe PL APO objectief) werd gebruikt om beelden vast te leggen, die werden geanalyseerd met de ImageJ software.

11. Statistische analyse

  1. Voer statistische analyses uit met behulp van de juiste software.
    OPMERKING: Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van S.A.S-software. Omdat er meerdere HNE-filters per patiënt en per aandoening werden verkregen, werden kwantitatieve parameters uitgedrukt als mediane waarden (± SEM) per patiënt. Vergelijkingen (gemiddelde ± SD) werden uitgevoerd met behulp van Wilcoxon matched pairs signed rank test of unpaired t-test.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verse HNE-cellen gekweekt op de lucht-vloeistof interface vertonen typische kenmerken van het gepolariseerde en gedifferentieerde respiratoire epitheel zoals beoordeeld door immunostaining (figuur 1). HNE-cellen differentiëren opnieuw in een heterogene laag epitheelcellen (positieve keratine 8 immunostaining) die de in vivo situatie nabootsen van een pseudo-gestratificeerd respiratoir epitheel bestaande uit trilhaarcellen (positieve alfa-tubulinekleuring) en niet-trilhaarproducerend...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van patiënt-afgeleide nasale epitheelcellen als surrogaten voor menselijke bronchiale epitheelcellen (HBE) om CFTR-activiteit te meten in de context van gepersonaliseerde geneeskunde is voorgesteld als HNE de eigenschappen van cellen in cultuur reproduceren 9,11. Het sterke voordeel van HNE ten opzichte van HBE-celculturen is dat ze gemakkelijk en niet-invasief kunnen worden bemonsterd. Kortsluitstroommetingen in HNE-celculturen maken beoordeling moge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs melden geen tegenstrijdige financiële belangen met betrekking tot deze publicatie of wetenschappelijke videoproductie.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken alle patiënten en hun families hartelijk voor hun deelname aan het onderzoek. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Franse vereniging Vaincre la Mucoviscidose; Franse vereniging ABCF 2 en Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ABBV-2222SelleckchemS8535
ABBV-974SelleckchemS8698
Advanced DMEM/F-12Life Technologies12634010
Alexa 488 geiten secundair antilichaamInvitrogenA11001
Alexa 594 geiten secundair antilichaamInvitrogenA11012
Amphotericin BLife Technologies15290026
Anti-alpha-tubulin antilichaamAbcamab80779
Anti-CFTR monoklonaal antilichaam (24-1)R&D SystemsMAB25031
Anti-cytokeratine 8 antilichaamProgen61038
Anti-Muc5AC antilichaamSanta Cruz Biotechsc-20118
Anti-ZO-1 antilichaamSanta Cruz Biotechsc-10804
Ciprofloxacinverstrekt door Necker Hospital Pharmacy
ColimycineSanofiverstrekt door Necker Hospital Pharmacy
Collageen type IVSigma-Aldrich MerckC-7521
cytologie borstelLaboratory GYNEAS02.104
DMSOSigma-Aldrich MerckD2650
EGFLife TechnologiesPHG0311
EpinefrineSigma-Aldrich MerckE4375
F12-voedingsmengselLife Technologies11765054
FBSLife Technologies10270106
FerticultFertipro NVFLUSH020
Kolven 25Thermo Scientific156.367
Kolven 75Thermo Scientific156.499
Glaziale azijnzuurVWR20104.298
HEPESSigma-Aldrich MerckH3375
HydrocortisonSigma-Aldrich MerckSLCJ0893
InsulinSigma-Aldrich MerckI0516
Mg2+ en Ca2+-vrij DPBSLife Technologies14190094
Penicilline/StreptomycineLife Technologies15140130
TazocillineMylanverstrekt door Necker Hospital Pharmacy
Transwell FiltersSigma-Aldrich MerckCLS3470-48EA
Triton-X100Sigma-Aldrich MerckT8787
Trypsine 0,25%Life Technologies25200056
Vectashield montage medium met DAPIVector LaboratoriesH-1200
VX-445SelleckchemS8851
VX-661SelleckchemS7059
VX-770SelleckchemS1144
VX-809SelleckchemS1565
Xylocaine nafazolin 5%Aspen Franceverstrekt door Necker Hospital Pharmacy
Y-27632SelleckchemS1049
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201(2012).
  2. Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
  3. Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
  4. Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
  5. Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
  6. Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
  7. Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137(2020).
  8. Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
  9. Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375(2017).
  10. Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
  11. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385(2018).
  12. Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
  13. de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
  14. Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
  15. McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
  16. Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
  17. Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550(2016).
  18. Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215(2017).
  19. Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646(2013).
  20. Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
  21. Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492(2018).
  22. Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
  23. Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
  24. Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
  25. Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
  26. Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983(2020).
  27. Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
  28. Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774(2021).
  29. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
  30. Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, Clifton, N.J. 39-54 (2011).
  31. Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Primaire HNE cellenneusborstelenlucht vloeistofinterfaceCFTR activiteitbehandeling van cystische fibrosecryopreservatie van cellenkortsluitstroomCFTR modulatorengepersonaliseerde geneeskunde

Gerelateerde artikelen