Methodenartikel

Een robuuste methode voor de grootschalige productie van sferoïden voor screening- en analysetoepassingen met een hoog gehalte

DOI:

10.3791/63436

⸱

28 december 2021

 ,  , 
1Cell Screening Laboratory, UCD School of Biology and Environmental Science, University College Dublin

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een methode voor de productie van drie verschillende soorten sferoïden op een manier die ze geschikt maakt voor grootschalige screening en analyse met een hoog gehalte. Daarnaast worden voorbeelden gepresenteerd die laten zien hoe ze kunnen worden geanalyseerd op sferoïde en individuele celniveaus.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

High-content screening (HCS) en high-content analysis (HCA) zijn technologieën die onderzoekers de mogelijkheid bieden om grootschalige kwantitatieve fenotypische metingen uit cellen te extraheren. Deze aanpak is krachtig gebleken voor het verdiepen van ons begrip van een breed scala aan zowel fundamentele als toegepaste gebeurtenissen in de celbiologie. Tot op heden zijn de meeste toepassingen voor deze technologie gebaseerd op het gebruik van cellen die in monolagen zijn gekweekt, hoewel men zich steeds meer realiseert dat dergelijke modellen veel van de interacties en processen die in weefsels plaatsvinden niet samenvatten. Als zodanig is er een opkomst in de ontwikkeling en het gebruik van 3-dimensionale (3D) celassemblages, zoals sferoïden en organoïden. Hoewel deze 3D-modellen bijzonder krachtig zijn in de context van kankerbiologie en medicijnafgiftestudies, vormen hun productie en analyse op een reproduceerbare manier die geschikt is voor HCS en HCA een aantal uitdagingen. Het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft een methode voor het genereren van meercellige tumorsferoïden (MCTS) en toont aan dat het kan worden toegepast op drie verschillende cellijnen op een manier die compatibel is met HCS en HCA. De methode vergemakkelijkt de productie van enkele honderden sferoïden per put, wat het specifieke voordeel biedt dat bij gebruik in een screeningsregime gegevens kunnen worden verkregen uit enkele honderden structuren per put, allemaal op dezelfde manier behandeld. Er worden ook voorbeelden gegeven, die gedetailleerd beschrijven hoe de sferoïden moeten worden verwerkt voor fluorescentiebeeldvorming met hoge resolutie en hoe HCA kwantitatieve kenmerken kan extraheren op zowel het sferoïdeniveau als uit individuele cellen in elke sferoïde. Dit protocol kan gemakkelijk worden toegepast om een breed scala aan belangrijke vragen in de celbiologie te beantwoorden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traditioneel worden celgebaseerde assays uitgevoerd in monolagen die groeien op een vast substraat, dat effectief kan worden beschouwd als een tweedimensionale (2D) omgeving. Het wordt echter steeds meer erkend dat 2D-celkweekmodellen in sommige contexten fysiologische relevantie missen en veel van de complexe interacties die tussen cellen optreden niet kunnen repliceren1. Driedimensionale (3D) celkweekmethoden worden snel populair onder onderzoekers en 3D-celmodellen tonen een hoog potentieel om de fysiologische omstandigheden die cellen in de weefselomgeving tegenkomen beter na te bootsen2. Er zijn verschillende soorten 3D-celassemblages die zijn gebruikt, maar de twee meest voorkomende typen zijn sferoïden en organoïden. Sferoïden kunnen uit veel verschillende cellijnen worden gekweekt en ze kunnen verschillende vormen en maten aannemen, afhankelijk van het gebruikte celtype en hun assemblagemethode3. Bovendien kunnen sferoïden ook worden aangeduid als meercellige tumorsferoïden (MCTS) wanneer ze worden gekweekt uit kankercellijnen, en deze modellen hebben een bijzonder gebruik gevonden voor preklinische in vitro medicijnafgifte en toxiciteitsstudies4,5. Organoïden daarentegen zijn bedoeld om de weefsels en organen in ons lichaam beter na te bootsen en kunnen complexere morfologische arrangementen aannemen. De productie van organoïden omvat het gebruik van volwassen stamcellen of pluripotente stamcellen, die kunnen worden geherprogrammeerd in de juiste cellen om op het weefsel of orgaan van belang te lijken. Ze worden voornamelijk gebruikt om de ontwikkeling van organen te onderzoeken en om ziekten en gastheer-pathogeen interacties te modelleren6.

Er is een reeks verschillende methoden die worden gebruikt om 3D-celassemblages te genereren. Steigergebaseerde methoden bieden een substraat of ondersteuning waaraan cellen zich kunnen hechten of erin kunnen groeien. Deze steigers kunnen verschillende vormen hebben en kunnen gemaakt worden van verschillende materialen. De meest voorkomende zijn extracellulaire matrix (ECM) componenten en hydrogels, en ze zijn ontworpen om te lijken op de natuurlijke extracellulaire omgeving van cellen en daardoor fysiologische interacties te vergemakkelijken4,7. ECM-keldermateriaal is geëxtraheerd uit engelbreth-Holm-Swarm muizensarcoomtumor en heeft aangetoond dat het een rijk mengsel van ECM-componenten bevat, waaronder laminine, type IV collageen en perlecan8. Ondanks de voordelige samenstelling zijn er echter twee belangrijke uitdagingen met betrekking tot het gebruik ervan, namelijk de batch-to-batch variabiliteit en dat het twee verschillende aggregaattoestanden heeft onder en boven 10 °C8,9. Hydrogels hebben daarentegen het voordeel dat ze flexibel zijn met betrekking tot hun componenten en stijfheid, en ze kunnen worden aangepast aan de specifieke gewenste 3D-celassemblage7,10. Scaffold-gebaseerde methoden zijn essentieel voor organoïde groei, maar worden ook veel gebruikt voor sferoïden. Steigervrije methoden, die werken door te voorkomen dat cellen zich hechten aan het oppervlak waarop ze groeien, zijn meestal alleen compatibel met sferoïde assemblage. Voorbeelden hiervan zijn ultra-low attachment (ULA) platen, met een platte bodem of U-bodem, die aggregatie van de cellen tot sferoïden mogelijk maken, of het gebruik van continue agitatie van de cellen in spinner/ rotatiekolven10.

Het gebruik van 3D-celassemblages om een breed scala aan biologische gebeurtenissen te bestuderen, wint snel aan populariteit; het is echter van essentieel belang dat de voor hun cultuur gekozen methode geschikt en verenigbaar is met de plannen voor hun downstream-analyse. Het gebruik van ULA-platen genereert bijvoorbeeld sferoïden met een hoge consistentie; deze methode is echter beperkt tot de productie van een enkele sferoïde per put, waardoor de doorvoer wordt beperkt. Bijzondere aandacht is nodig wanneer fluorescentiebeeldvorming van de 3D-structuur wordt gepland. Het substraat of de plaat waarop de assemblage wordt gekweekt, moet optisch compatibel zijn en er moet voor worden gezorgd dat de effecten van lichtverstrooiing veroorzaakt door eventuele steigers die mogelijk zijn gebruikt, worden geminimaliseerd11. Dit specifieke probleem wordt acuter naarmate het numerieke diafragma van de microscoop objectieflenzen toeneemt.

Misschien wel een van de belangrijkste redenen om ervoor te kiezen om met een 3D-celmodel te werken, is om volumetrische beeldvormingsgegevens te extraheren over niet alleen de hele assemblage, maar ook over de individuele cellen erin. McTS-modellen, in het bijzonder, beginnen zeer krachtig te blijken voor het verdiepen van ons begrip van hoe therapeutica van buitenaf naar centrale cellen gaan (zoals ze nodig zouden hebben in een tumor)12, en dus is het verkrijgen van kennis van individuele cellen op verschillende lagen essentieel. De beeldvormingstechnologie die kwantitatieve informatie uit individuele cellen haalt, wordt high-content analysis (HCA) genoemd en is een krachtige aanpak in de context van screening13. Tot op heden is HCA bijna uitsluitend toegepast op monolaagculturen, maar er is een toenemend besef dat deze benadering de kracht heeft om te worden toegepast op 3D-culturen, waardoor een breed scala aan cellulaire functies en processen kan worden bestudeerd14. Het zou het duidelijke voordeel hebben dat grote aantallen 3D-assemblages kunnen worden geanalyseerd, waardoor mogelijk gegevens op celniveau van elke structuur kunnen worden geleverd. Uitdagingen in verband met beeldvorming van potentieel dikke celassemblages, evenals de grote gegenereerde datasets, moeten echter worden overwonnen.

In dit artikel wordt een robuuste steigergebaseerde methode gepresenteerd voor de grootschalige productie van MCTS in een 96-well formaat. De methode vergemakkelijkt de productie van enkele honderden 3D-celassemblages in elke put. Voorbeelden worden getoond voor drie verschillende celtypen, die solide tumormodellen van de lever, longen en dikke darm vertegenwoordigen. De sferoïden die zich vormen kunnen van verschillende grootte zijn, en dus wordt HCA gebruikt om structuren van een bepaalde grootte en / of morfologie te selecteren. Deze functie biedt het extra voordeel dat alle waargenomen fenotypen kunnen worden vergeleken tussen sferoïden van verschillende grootte, maar allemaal op dezelfde manier in dezelfde put worden behandeld. Deze aanpak is compatibel met beeldvorming met hoge resolutie en levert zowel kwantitatieve gegevens op celniveau als op subcellulair niveau van dezelfde cellulaire assemblages. Deze methode van sferoïde productie heeft het bijkomende voordeel ten opzichte van methoden die een enkele sferoïde per put genereren, dat de grote aantallen sferoïden die in elke put worden geproduceerd, mogelijk voldoende biomassa leveren voor andere stroomafwaartse analyses, zoals transcriptoom- en proteoomprofilering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celkweek

  1. Media voorbereiden
    1. Bereid specifieke celkweekmedia voor, afhankelijk van het type cellijn. Zorg ervoor dat alle media voor celonderhoud 10% Foetaal Runderserum (FBS) bevatten.
      OPMERKING: Verschillende cellijnen gebruiken verschillende media. HT-29 coloncarcinoomcellen (ATCC HTB-38) worden gekweekt in McCoys 5A + 10% FBS. HepG2 hepatocellulaire carcinoomcellen (ATCC HB-8065) worden gekweekt in Minimum Essential Medium + 1% L-glutamine + 10% FBS. H358 bronchoalveolaire carcinoomcellen (ATCC CRL-5807) worden gekweekt in RPMI 1640 medium + 1% L-glutamine + 10% FBS. Alle media die L-glutamine en FBS bevatten, worden complete media genoemd. Bij het plateren van cellen om als sferoïden te groeien, is een fenolroodvrij medium met 10% FBS vereist om kleuring van het ECM-keldermateriaal te voorkomen, wat op zijn beurt artefacten kan veroorzaken tijdens het beeldvormingsproces.
  2. Subcultuur cellen
    1. Wanneer cellen voor ongeveer 80% samenvloeien, was dan kort met 2 ml trypsine-EDTA (0,25% (w/v) trypsine/0,53 mM EDTA). Zuig de trypsine-EDTA op, voeg 3 ml verse trypsine-EDTA toe en incubeer gedurende 3-5 min bij 37 °C.
    2. Wanneer cellen zijn losgemaakt van de celkweekschaal, voeg dan 7 ml vers volledig medium toe.
    3. Pipetteer 1 ml celsuspensie in een nieuwe celkweekschaal van 10 cm en voeg 9 ml vers volledig medium toe om een verdunning van de cellen van 1:10 te geven.
    4. Kweek de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
    5. Subcultureer de cellen om de 3-5 dagen, afhankelijk van de cellijn.

2. Generatie van sferoïden

  1. Coat 96-well platen met ECM keldermateriaal
    1. Ontdooi ECM keldermateriaal op ijs een nacht.
    2. Verdun ECM-keldermateriaal in koud fenolroodvrij serumvrij medium met voorgekoelde uiteinden die op -20 °C worden gehouden.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van ECM-keldermateriaal is afhankelijk van de gebruikte cellijn. Gebruik voor HT-29- en H358-cellen 4 mg ML-1 ECM-keldermateriaal . Gebruik voor HepG2-cellen 4 mg·ml-1 ecm-keldermateriaal met verminderde groeifactor.
    3. Pipetteer 15 μL van het ECM-keldermateriaal/mediumoplossing in een 96-well imaging plate.
      OPMERKING: Voor grootschalige sferoïde productie kan deze stap worden uitgevoerd met zowel een 8-kanaals pipet als een 96-kanaals pipetteerkop, zolang de uiteinden en het reservoir met het ECM-keldermateriaal worden gekoeld.
    4. Centrifugeer de plaat gedurende 20 minuten bij 91 x g bij 4 °C.
    5. Incubeer de plaat niet langer dan 30 minuten bij 37 °C.
  2. Subcultuur en telcellen
    1. Incubateer tijdens de plaatincubatieperiode de cellen met trypsine-EDTA en resuspend ze in een volledig medium dat 10% FBS bevat.
    2. Pipetteer 10 μL van de celsuspensie in een hemocytometertelkamer. Tel het aantal cellen in 4 kwadranten van de kamer.
    3. Bereken het aantal cellen in de celsuspensie door het gemiddelde aantal cellen binnen de 4 kwadranten te bepalen.
      OPMERKING: Cellen kunnen ook worden geteld met behulp van geautomatiseerde celtelapparaten.
    4. Centrifugeer de cellen bij 135 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    5. Zodra de cellen zijn gepelletiseerd, zuigt u het supernatant op en resuspendeert u de cellen in een fenolroodvrij volledig medium om een concentratie van 1 x 106 cellen per ml te verkrijgen.
  3. Zaadcellen in ecm-keldermateriaal gecoate platen
    1. Verdun de cellen in een fenolroodvrij volledig medium.
      OPMERKING: De dichtheid van de gezaaide cellen is afhankelijk van de gebruikte cellijn. Voor HT-29- en HepG2-cellen worden 3 x 104 cellen per put gezaaid; voor H358-cellen worden 4 x 104 cellen per put gezaaid.
    2. Zaai de cellen in een totaal volume van 35 μL per put. Zorg ervoor dat je ze druppelsgewijs toevoegt in een cirkelvormige beweging.
      OPMERKING: Voor grootschalige sferoïde productie kan deze stap worden uitgevoerd met een 8-kanaals pipet, zolang de pipetterende cirkelvormige beweging kan worden bereikt.
    3. Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
    4. Bereid een oplossing van ECM-keldermateriaal in fenolroodvrij volledig medium, wat resulteert in een uiteindelijke concentratie van 2% ECM-keldermateriaal in de put. Om dit te bereiken, voegt u 1,2 μL ECM-keldermateriaal toe aan 23,8 μL fenolroodvrij volledig medium per put, wat resulteert in een eindvolume van 60 μL per put.
    5. Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
    6. Vervang de volgende dag het medium door 100 μL vers fenol roodvrij volledig medium.
    7. Vervang het medium om de twee dagen door 100 μL vers fenol roodvrij volledig medium.

3. Immunofluorescentiekleuring van sferoïden

OPMERKING: Dit protocol is aangepast van Nürnberg et al., 202015. Deze aanpassingen zijn voornamelijk gebaseerd op het feit dat de in dit protocol beschreven sferoïden kleiner zijn dan die welke in het werk van Nürnberg et al. worden gebruikt15 en als zodanig kortere incubatietijden mogelijk maken. Zo worden de blokkeringstijden teruggebracht van 2 uur naar 1 uur. Omdat het protocol is ontworpen voor de productie van sferoïden met hoge doorvoer, worden bovendien alle verwerkingsstappen uitgevoerd in de put waarin de sferoïden worden gekweekt, wat betekent dat overdracht van individuele sferoïden in buizen niet vereist is.

  1. Bereid alle oplossingen en buffers voor die nodig zijn voor het bevestigen en beitsen
    1. Bereid Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door 1 PBS-tablet per 200 ml water toe te voegen. Autoclaaf de PBS.
    2. Bereid paraformaldehyde (PFA) volgens de stappen 3.1.3-3.1.4.
    3. Gebruik een verwarmde roerder om 400 ml PBS te verwarmen tot 60-70 °C in een zuurkast. Voeg al roerend 15 g PFA toe. Zodra de PFA is opgelost, voegt u 50 μL 1 M CaCl2 en 50 μL 1 M MgCl2 toe.
    4. Voeg 100 ml PBS toe om een eindvolume van 500 ml te maken. Gebruik NaOH om de PFA in evenwicht te brengen tot pH 7,4. Filtreer de PFA door steriele vacuümfilters (poriegrootte 0,22 μm), aliquot, en bewaar bij -20 °C.
    5. Bereid een 1 M glycine stock oplossing door 3,75 g glycine toe te voegen aan 50 ml PBS. Bewaren bij 4 °C.
    6. Bereid 5 ml permeabilisatiebuffer door 100 μl Triton X-100, 1 ml dimethylsulfoxide (DMSO) en 1,5 ml 1 m glycine toe te voegen aan 2,4 ml PBS. Bewaren bij 4 °C gedurende niet langer dan 2 weken.
    7. Bereid 5 ml blokkerende buffer door 100 μl Triton X-100, 0,5 ml DMSO en 0,05 g runderserumalbumine (BSA) toe te voegen aan 4,9 ml PBS. Vul de blokkeerbuffer in buizen van 1,5 ml en bewaar bij -20 °C.
    8. Bereid 5 ml antilichaamincubatiebuffer door 10 μl polysorbaat 20, 0,05 g BSA en 250 μl DMSO toe te voegen aan 4,74 ml PBS. Gebruik de incubatiebuffer van het antilichaam in buizen van 1,5 ml en bewaar deze bij -20 °C.
      OPMERKING: In het hier beschreven protocol worden sferoïden alleen geassembleerd in de binnenste 60 putten van een 96-putplaat, hoewel ze in alle 96 putten van de plaat kunnen worden bereid. De reden voor het alleen voorbereiden van sferoïden in de binnenste 60 putten is dat sommige objectieve lenzen met een hoog numeriek diafragma niet in staat zijn om fysiek in staat te zijn om de hele put van de buitenste putten in beeld te brengen vanwege de 'rok' op sommige plaattypen. De bovenstaande volumes zijn voldoende voor de voorbereiding van 60 putten met sferoïden.
  2. Fixeren en permeabiliseren van de sferoïden
    1. Verwijder het medium voorzichtig uit de sferoïden en zorg ervoor dat de ECM-keldermateriaallaag niet wordt verstoord.
    2. Was de sferoïden tweemaal met telkens 70 μL PBS gedurende 3 minuten.
    3. Bevestig de sferoïden met 70 μL van 3% PFA gedurende 1 uur bij 37 °C.
    4. Was de sferoïden tweemaal met telkens 70 μL PBS gedurende 3 minuten.
    5. Blus met 70 μL 0,5 M glycine-oplossing gedurende 30 min bij 37 °C.
    6. Permeabiliseer de sferoïden met behulp van 70 μL van de permeabilisatiebuffer gedurende 30 minuten bij RT.
    7. Was de sferoïden tweemaal met telkens 70 μL PBS gedurende 3 minuten.
    8. Incubeer de sferoïden in 70 μL blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij 37 °C.
      OPMERKING: Zodra de sferoïden zijn gefixeerd, kunnen alle volgende verwerkingsstappen worden uitgevoerd met behulp van een 8-kanaals pipet of een pipetteerkop met 96 putten, indien beschikbaar. Dit verhoogt de snelheid van sferoïde voorbereiding voorafgaand aan beeldvorming.
  3. Immunostain sferoïden met primaire en secundaire antilichamen
    1. Verdun het primaire antilichaam tot een geschikte verdunning in de incubatiebuffer van het antilichaam en voeg 70 μL toe aan elke put. Incubateer de sferoïden met het primaire antilichaam 's nachts.
      OPMERKING: De verdunning is afhankelijk van het specifieke antilichaam dat wordt gebruikt. In het hier getoonde voorbeeld worden lysosomen immunosmeer gekleurd met anti-LAMP1-antilichamen bij muizen met een verdunning van 1:500.
    2. Was de volgende dag de sferoïden 5 keer met 70 μL PBS gedurende 3 minuten per keer.
    3. Verdun het secundaire antilichaam bij een verdunning van 1:500, fluorescerend geconjugeerd falloïdine bij 1:500 en Hoechst 33342 (uit een 1 mg ml-1-voorraad ) om 1:5000 in de incubatiebuffer van het antilichaam en voeg 70 μL toe aan elke put. Incubeer 's nachts.
      OPMERKING: De verdunning van het antilichaam is afhankelijk van het specifieke antilichaam dat wordt gebruikt. Sterk geconvecteerde secundaire antilichamen die een hoge fotostabiliteit en hoge helderheid vertonen, worden aanbevolen.
    4. Was de volgende dag de sferoïden 5 keer met 70 μL PBS gedurende 3 minuten per keer.
      OPMERKING: Platen kunnen tot twee weken bij RT worden bewaard voordat ze worden afgebeeld, zolang de sferoïden bedekt blijven met PBS.

4. Beeldacquisitie en analyse van sferoïden

  1. Beeldverwerving
    1. Plaats de 96-putplaat met sferoïden in een confocale screeningsmicroscoop met hoog gehalte.
    2. Selecteer de juiste lasers om de gebruikte fluoroforen te prikkelen.
    3. Verkrijg de kanalen sequentieel om cross-talk te voorkomen.
    4. Stel je de sferoïden voor met behulp van de juiste doelstellingen.
      OPMERKING: Het gebruik van onderdompelingsdoelstellingen in water wordt aanbevolen indien beschikbaar. Een 20x/1.0 NA-objectief kan bijvoorbeeld een hele put in ~77 gezichtsvelden weergeven. Een 63x/1.15 NA objectief kan een hele put in ongeveer 826 beeldhoeken weergeven.
    5. Afbeelding ~ 30-40 plakjes, afhankelijk van de diepte van de sferoïde, waarbij elke plak wordt genomen met een interval van 1,5 μm van de vorige.
  2. Beeldanalyse
    1. Voor morfologische analyse van sferoïden volgt u stappen 4.2.2-4.2.6.
    2. Segmenteer de sferoïden op basis van de fluorescerend geconjugeerde falloïdinkleuring.
    3. Segmenteer de kernen op basis van de Hoechst 33342-kleuring.
    4. Segmenteer het cytoplasma van elke cel door de resterende Hoechst 33342-kleuring die aanwezig is in het celcytoplasma.
    5. Bereken verschillende morfologische eigenschappen van de sferoïden, waaronder volume, oppervlakte, sfericiteit en het aantal kernen per sferoïde.
      OPMERKING: Deze informatie wordt geëxtraheerd met behulp van verschillende algoritmen die zijn ingebouwd in de beeldanalysesoftware van keuze.
    6. Verwerk beelden verder om sferoïden kleiner dan 75.000 μm3 en groter dan 900.000 μm3 te verwijderen.
      OPMERKING: Deze waarden zijn suggesties om de verwijdering mogelijk te maken van zeer kleine celassemblages en grote assemblages die kunnen zijn ontstaan als gevolg van de fusie van meerdere sferoïden. Sferoïden kunnen in deze stap ook worden onderverdeeld in verschillende grootteklassen.
    7. Volg stappen 4.2.8-4.2.12 om afzonderlijke cellen in sferoïden te analyseren.
    8. Segmenteer de sferoïden op basis van de fluorescerend geconjugeerde falloïdinkleuring.
    9. Segmenteer de kernen op basis van de Hoechst 33342-kleuring.
    10. Segmenteer het cytoplasma van elke cel door de resterende Hoechst 33342-kleuring die aanwezig is in het celcytoplasma.
    11. Segmenteer de lysosomen op basis van de secundaire antilichaamkleuring.
    12. Bereken verschillende morfologische eigenschappen van de cellen binnen elke sferoïde, inclusief het aantal lysosomen per cel, celvolume en celoppervlak.
      OPMERKING: Deze informatie wordt geëxtraheerd met behulp van verschillende algoritmen die zijn ingebouwd in de beeldanalysesoftware van keuze.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol wordt een robuuste methode beschreven om 3D-celkweekassemblages in de vorm van sferoïden te produceren, waarbij verschillende celtypen worden gebruikt om verschillende tumorweefsels weer te geven. Deze methode maakt het mogelijk om honderden sferoïden per put te genereren, waardoor celgebaseerde assays op een hooggehalte kunnen worden uitgevoerd (figuur 1). Deze benadering is eerder gebruikt om de opname van nanodeeltjes in HT-29-sferoïden16 en door na...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven aanpak beschrijft een platform voor het genereren van enkele honderden sferoïden per put op een manier die geschikt is voor HCS en HCA. In vergelijking met andere populaire methoden, zoals het gebruik van platbodem- en ULA-platen met ronde bodem, die de vorming van slechts één sferoïde per put mogelijk maken18,19, biedt deze methode de mogelijkheid om informatie met hoge resolutie te extraheren uit grote aantallen sferoïden in een screeningsfor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen verbonden zijn aan dit werk.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen de steun van een infrastructuuronderzoekssubsidie van Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) aan JCS. Het werk in het UCD Cell Screening Laboratory wordt ondersteund door het UCD College of Science. ASC wordt gefinancierd door een Irish Research Council (IRC) Government of Ireland Postgraduate Scholarship (GOIPG / 2019 / 68). De auteurs bedanken ook alle leden van het lab voor hun input en nuttige discussies. Het kunstwerk in figuur 1 is gegenereerd in BioRender.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol redGibco25300054
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA6003
Calcium chlorideFisher Scientific10050070
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lidPerkin Elmer6055302Deze platen zijn omgedoopt tot Phenoplates
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2650
Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivatedGibco10500064
GlycineFisher ScientificBP381-1
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11029
L-Glutamine solution, 200 mMGibco25030024
Hoechst 33342Sigma Aldrich14533
Magnesium chlorideFisher Scientific10647032
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mLCorning356237Deze Matrigel-formulering is ook te vinden met hetzelfde catalogusnummer bij BD Biosciences
Matrigel Growth Factor Reduced MatrigelBD Biosciences356231Deze Matrigel-formulering is ook te vinden met hetzelfde catalogusnummer bij Corning
McCoy's 5A mediumGibco26600023
McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol redHyclone10358633
Minimum Essential Medium (MEM)Gibco21090022
Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol redGibco51200046
Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate)Developmental Studies Hybridoma BankH4A3-a
Neubauer counting chamberHirschmann8100203
Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mmThermoFisher Scientific150350
Opera Phenix HCS System and Harmony HCA softwarePerkin ElmerHCSHH14000000
Paraformaldehyde (PFA)Sigma AldrichP6148
Phalloidin Alexa Fluor 568InvitrogenA12380
Phosphate Buffered Saline (PBS) tabletsSigma AldrichP4417
Polysorbate 20Sigma AldrichP5927
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementGibco61870010
RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol redGibco11835063
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Stericup sterile vacuum filter unitsMilliporeSCGVU05RE

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
  2. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).
  3. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  4. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  5. Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
  6. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  7. Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
  8. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
  9. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  10. Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784(2020).
  11. Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
  12. Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362(2020).
  13. Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy-based high-content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
  14. Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
  15. Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
  16. Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033(2019).
  17. Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
  18. Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
  19. Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
  20. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  21. Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043(2020).
  22. Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
  23. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
  24. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904(2020).
  25. Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
  26. Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
  27. Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Productie van sfero denmulticellular tumor sfero den3D celkweekconfocale microscopiefluorescentie imagingmorfologische analysecelsegmentatiestudies naar geneesmiddelentoedieningproteomische analyse

Gerelateerde artikelen