Method Article

Herbruikbare eencellige cel voor iteratieve epigenomische analyses

DOI:

10.3791/63456

⸱

February 11th, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft een eencellige methode voor iteratieve epigenomische analyses met behulp van een herbruikbare enkele cel. De herbruikbare enkele cel maakt analyses van meerdere epigenetische markeringen in dezelfde enkele cel en statistische validatie van de resultaten mogelijk.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige eencellige epigenoomanalyses zijn ontworpen voor eenmalig gebruik. De cel wordt na eenmalig gebruik weggegooid, waardoor analyse van meerdere epigenetische markeringen in een enkele cel wordt voorkomen en gegevens van andere cellen nodig zijn om signaal van experimentele achtergrondruis in een enkele cel te onderscheiden. Dit artikel beschrijft een methode om dezelfde enkele cel te hergebruiken voor iteratieve epigenomische analyses.

Bij deze experimentele methode worden cellulaire eiwitten eerst verankerd aan een polyacrylamidepolymeer in plaats van ze te koppelen aan eiwit en DNA, waardoor structurele vertekening wordt verlicht. Deze kritische stap maakt herhaalde experimenten met dezelfde enkele cel mogelijk. Vervolgens wordt een willekeurige primer met een steigersequentie voor nabijheidsligatie gegloeid aan het genomische DNA en wordt de genomische sequentie bij uitbreiding aan de primer toegevoegd met behulp van een DNA-polymerase. Vervolgens worden een antilichaam tegen een epigenetische marker en controle IgG, elk gelabeld met verschillende DNA-sondes, gebonden aan de respectieve doelen in dezelfde enkele cel.

Nabijheidsligatie wordt geïnduceerd tussen de willekeurige primer en het antilichaam door een connector-DNA toe te voegen met complementaire sequenties aan de scaffold-sequentie van de willekeurige primer en de antilichaam-DNA-sonde. Deze aanpak integreert antilichaaminformatie en nabijgelegen genoomsequenties in een enkel DNA-product van nabijheidsligatie. Door herhaalde experimenten met dezelfde enkele cel mogelijk te maken, maakt deze methode een toename van de gegevensdichtheid van een zeldzame cel en statistische analyse mogelijk met alleen IgG- en antilichaamgegevens van dezelfde cel. De herbruikbare afzonderlijke cellen die met deze methode zijn bereid, kunnen minstens een paar maanden worden bewaard en later worden hergebruikt om de epigenetische karakterisering te verbreden en de gegevensdichtheid te verhogen. Deze methode biedt flexibiliteit aan onderzoekers en hun projecten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Single-cell technologie betreedt het tijdperk van single-cell multiomics, dat individuele single-cell omics-technologieën integreert1. Onlangs is single-cell transcriptomics gecombineerd met methoden voor het detecteren van chromatinetoegankelijkheid (scNMT-seq2 en SHARE-seq3) of histonmodificaties (Paired-seq4 en Paired-Tag5). Meer recent werden single-cell transcriptomics en proteomics geïntegreerd met chromatine toegankelijkheid (DOGMA-seq6). Deze methoden maken gebruik van transposase-gebaseerde tagging voor het detecteren van chromatinetoegankelijkheid of histonmodificaties.

Transposase-gebaseerde benaderingen splitsen genomisch DNA en voegen een DNA-streepjescode toe aan het einde van het genomische DNA-fragment. Elk gespleten genomisch fragment kan slechts maximaal twee DNA-barcodes accepteren (= één epigenetisch merkteken per splitsingsplaats), en het genomische DNA op de splitsingsplaats gaat verloren. Daarom hebben op splitsing gebaseerde benaderingen een afweging tussen het aantal geteste epigenetische markeringen en de signaaldichtheid. Dit belemmert de analyse van meerdere epigenetische markeringen in dezelfde enkele cel. Een eencellige epigenomische methode die het genomische DNA niet splitst, werd ontwikkeld om dit probleem op te lossen 7,8.

Naast het hierboven genoemde splitsingsprobleem, hebben op transposase gebaseerde benaderingen nog andere beperkingen. Bij eencellige epigenoomanalyse is het van cruciaal belang om de locatie van histonen en DNA-geassocieerde eiwitten op het genoom te kennen. In de huidige benaderingen wordt dit bereikt door gebruik te maken van niet-gefixeerde afzonderlijke cellen en het behoud van eiwit-DNA en eiwit-eiwitinteracties. Dit genereert echter een sterke bias voor toegankelijke chromatinegebieden, zelfs bij de analyse van histonmodificaties 9. De locatie van histonen en genoom-geassocieerde eiwitten op het genoom kan worden bewaard zonder eiwit-DNA en eiwit-eiwit te vermengen, met behulp van een polyacrylamide scaffold 7,8. Deze benadering vermindert de structurele vertekening die wordt waargenomen in de huidige benaderingen die afhankelijk zijn van eiwit-DNA en eiwit-eiwitinteracties.

Transposase-gebaseerde benaderingen kunnen slechts één keer signalen van een enkele cel ontvangen. Daarom is het moeilijk om het volledige epigenoom van een enkele cel af te bakenen vanwege het wegvallen van de signalen. Herbruikbare afzonderlijke cellen zijn ontwikkeld om de huidige beperkingen te overwinnen door iteratieve epigenomische analyse in dezelfde enkele cel mogelijk te maken.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Een schematische weergave van de methode is weergegeven in figuur 1.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematische weergave van de protocolworkflow. Stappen 7.2-13 worden uitgelegd aan de hand van schematische weergaven. Elke rij geeft een stap in het protocol aan. Een cellulair eiwit dat groen gekleurd is, is een menselijk nucleosoom dat wordt gegenereerd op basis van een kristalstructuur (PDB: 6M4G). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Evenwicht van ontzoutingskolommen

OPMERKING: Ontzoutingsspinkolommen worden in evenwicht gebracht zoals beschreven in de volgende stappen. De gebalanceerde ontzoutingskolommen worden gebruikt in stap 2.1, 3.4 en 4.6.

  1. Verwijder de onderste sluiting van een ontzoutingskolom (7 kDa cut-off, 0,5 ml harsparelvolume, zie de Tabel met materialen) en maak de dop aan de bovenkant van de ontzoutingskolom los.
  2. Plaats de kolom in een 1,5 ml eiwit low-binding buis (een opvangbuis, zie de tabel met materialen) en centrifugeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur op 1.500 × g om de opslagoplossing in de kolom te verwijderen.
    OPMERKING: Gebruik een zwenkrotorcentrifuge om de bovenkant van het kraalbed plat te maken.
  3. Verwijder de doorstroming in de buis van 1,5 ml en voeg 300 μL 150 mM NaCl/100 mM fosfaatbuffer, pH 8,0 (zie tabel 1), toe aan het harsbed.
  4. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur bij 1.500 × g en verwijder de doorstroming in de opvangbuis.
  5. Herhaal stap 1.3-1.4 nog drie keer.
  6. Gooi de buffer uit de opvangbuis en plaats de kolom in een nieuwe opvangbuis.
  7. Gebruik de gebalanceerde ontzoutingskolom in stap 2.1, 3.4 en 4.4.

2. Bufferuitwisseling van antilichamen

OPMERKING: Verwijder glycerol, arginine en natriumazide uit anti-H3K27ac 10, anti-H3K27me3 10, anti-Med111 en anti-Pol II10 (zie buffersamenstelling in tabel 1). Alle volgende procedures worden uitgevoerd onder een schone kap om DNase-besmetting te voorkomen. Tijd: 1 h

  1. Breng de antilichaamoplossing (100 μl, zie tabel 2) aan op een gebalanceerde ontzoutingskolom die is bereid na stap 1.
  2. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1.500 × g bij 4 °C en breng de doorstroming van de opvangbuis over naar een 1,5 ml eiwitarm bindende buis.
  3. Meet de IgG-concentratie met absorptie bij 280 nm12 (gebruik een microvolumespectrofotometer).
  4. Breng de antilichaamoplossing over in een ultrafiltratiecassette (moleculaire gewichtsafsnijding 100 kDa, 0,5 ml, zie de materiaaltabel) en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 12.000 × g .
  5. Meet de IgG-concentratie met behulp van de absorptie bij 280 nm.
  6. Herhaal stap 2,4-2,5 totdat de IgG-concentratie 1 mg/ml bereikt.

3. Antilichaam activatie

OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase-besmetting te voorkomen. Tijd: 2,5 uur

  1. Los 1 mg succinimidyl 6-hydrazinonicotinaat aceton hydrazone (S-HyNic, zie de Tabel van Materialen) op met 100 μL watervrij N,N-dimethylformamide (DMF, zie de Tabel van Materialen).
    OPMERKING: DMF is een ontvlambaar organisch oplosmiddel en een krachtig levertoxine dat door de huid wordt geabsorbeerd. Draag handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Volg de veiligheidsrichtlijnen van de instelling. Gooi de gebruikte labware weg volgens de richtlijnen van de instelling.
  2. Voeg 0,6 μL S-HyNic/DMF toe aan 100 μL van de antilichaamoplossing (1 mg/ml in 150 mM NaCl/100 mM Natriumfosfaat, pH8,0. Zie tabel 2 voor de gebruikte antilichamen en controle IgG.
  3. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur (beschermend tegen licht).
  4. Breng 100 μl S-HyNic-gereageerd antilichaam aan op de bovenkant van de gebalanceerde ontzoutingskolom (zie stap 1) en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 4 °C bij 1.500 × g om het monster te verzamelen.
  5. Gooi de ontzoutingskolom na gebruik weg.
    OPMERKING: De stabiliteit van HyNic-groepen op eiwitten en andere biomoleculen varieert. Het wordt aanbevolen om HyNic-gemodificeerde biomoleculen onmiddellijk te conjugeren.

4. Activering van DNA-sonde

OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase-besmetting te voorkomen. Tijd: 2,5 uur

  1. Los een pellet van een amine-gemodificeerde DNA-sonde op voor antilichaam of controle IgG (Antibody Probe, tabel 3) met 20 μL van 150 mM NaCl/100 mM Natriumfosfaatbuffer, pH 8,0.
    OPMERKING: Zoek naar een dunne, transparante pellet / film aan de onderkant van de buis. Breng de buffer direct aan op de pellet. Als de pellet niet zichtbaar is, kan de pellet zijn losgemaakt en zich aan de muur of het deksel hebben vastgemaakt. In dit geval, centrifugeer de buis en zoek naar een pellet aan de onderkant van de buis.
  2. Los 1 mg succinimidyl-4-formylbenzoaat (S-4FB, zie de materiaaltabel) op met 50 μl watervrij DMF en voeg 10 μl DMF toe aan de opgeloste antilichaamsonde.
  3. Voeg 4 μL S-4FB/DMF toe, bereid in stap 4.2, meng en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (beschermend tegen licht).
  4. Breng 34 μL S-4FB-gereageerde antilichaamsonde aan op de bovenkant van de gebalanceerde ontzoutingskolom (zie stap 1).
  5. Breng 15 μL 150 mM NaCl/100 mM natriumfosfaatbuffer, pH 8,0, aan op de bovenkant van het gelbed nadat het monster volledig is geabsorbeerd en centrifugeer bij 1.500 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C om de S-4FB-gemodificeerde antilichaamsonde te verzamelen.
  6. Gebruik de doorstroming voor de daaropvolgende vervoeging; meet de absorptie bij 260 nm; en bereken de herstelsnelheid van de Antibody Probe.

5. Conjugatie van S-HyNic-gemodificeerd antilichaam en S-4FB-gemodificeerde antilichaamsonde

OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase-besmetting te voorkomen. Tijd: 2 uur

  1. Meng het S-HyNic-gemodificeerde antilichaam en de S-4FB-gemodificeerde antilichaamsonde en pipetteer de oplossing op en neer om te mengen.
  2. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (beschermend tegen licht).
  3. Voeg om de reactie te blussen 478,8 μL blus- en bewaaroplossing toe (zie tabel 1).
  4. Breng de antilichaamsonde-geconjugeerde antilichaamoplossing over in een ultrafiltratiecassette (moleculaire gewichtsafsnijding 100 kDa).
  5. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 12.000 × g, 4 °C.
  6. Controleer het volume van de oplossing in de cassette door te pipetteren.
  7. Herhaal stap 5.5-5.6 totdat het volume 100 μl bereikt en bewaar bij -20 °C.
    OPMERKING: De IgG-concentratie wordt gemeten met sandwich ELISA13,14,15 met behulp van een IgG-standaard.

6. Voorbereiding van magnetische kernparels

OPMERKING: Bij deze methode wordt een enkele cel ingebed in een dubbellaagse acrylamidekraal (zie figuur 2). De kern is een magnetische polyacrylamide kraal. De buitenste laag is alleen polyacrylamide. De magnetische kernparels worden in deze sectie gegenereerd. Dit gedeelte is niet essentieel voor het experiment. Tijd: 3 h

figure-protocol-2
Figuur 2: Structuur van een dubbellaagse polyacrylamide kraal voor zichtbaarheid en eenvoudige hantering in REpi-seq experimenten . (A) Magnetische nanodeeltjes van stap 6.6 na centrifugeren. De magnetische nanodeeltjes worden gemodificeerd met monomeer acrylamide en geïntegreerd in de polyacrylamide magnetische kraal afgebeeld in B. (B) Schematische weergave van een herbruikbare enkele cel met een polyacrylamide magnetische kraal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Meng 50 μL van 1 M natriumbicarbonaatbuffer, pH 8,5 en 450 μL van 40% acrylamide-oplossing.
    OPMERKING: Acrylamide is een neurotoxine. Draag handschoenen, een oogbeschermer en een laboratoriumjas. Volg de veiligheidsrichtlijnen van de instelling. Gooi de gebruikte labware weg volgens de richtlijnen van de instelling.
  2. Suspensie 1 g NHS-ester-gefunctionaliseerd 30 nm ijzeroxidepoeder (zie de materiaaltabel) in de acrylamide/natriumbicarbonaatbuffer en incubeer 's nachts bij 4 °C.
    OPMERKING: Omdat acrylamidekralen transparant zijn, kan het moeilijk zijn om de positie van de kralen te zien en te manipuleren. De opname van een kernkraal gemaakt van ijzeroxide verbetert de zichtbaarheid en vergemakkelijkt manipulatie omdat de positie van de kralen kan worden geregeld met behulp van een magneet. Als gebruikers echter bekend zijn met de REpi-seq-experimenten, kan het gebruik van de kernmagnetische polyacrylamidekralen worden overgeslagen.
  3. Breng de nanobead-suspensie over in 2 buizen (1,5 ml), centrifugeer gedurende 1 uur bij 21.300 × g (gebruik een schuine rotor) bij 4 °C en verwijder het supernatant.
  4. Suspensie de onderste slurry met 1 ml 40% acrylamide/bis-acrylamide (19:1, zie de materiaaltabel).
    OPMERKING: Bis-acrylamide is een neurotoxine. Draag handschoenen en een labjas. Volg de veiligheidsrichtlijnen van de instelling. Gooi de gebruikte labware weg volgens de richtlijnen van de instelling.
  5. Centrifugeer bij 21.300 × g gedurende 1 uur (gebruik een schuine rotor) bij 4 °C.
  6. Centrifugeer bij 5.000 × g gedurende 30 minuten (gebruik een zwenkrotor zonder rem) bij 4 °C.
  7. Verwijder het supernatant met behulp van een P1000-pipet met langzame aspiratie.
  8. Stel het volume in op 400 μL 40% acrylamide/bis-acrylamide (19:1, zie de materiaaltabel).
  9. Voeg 25 μL 10% ammoniumpersulfaatoplossing toe (zie tabel 1).
    OPMERKING: Ammoniumpersulfaat is een sterk oxidatiemiddel. Stof in de lucht dat ammoniumpersulfaat bevat, kan het oog, de neus, de keel, de longen en de huid irriteren bij contact. Draag handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Volg de veiligheidsrichtlijnen van de instelling. Gooi de gebruikte labware weg volgens de richtlijnen van de instelling.
  10. Om kern magnetische polyacrylamide kralen te genereren, brengt u 0,5 μL van de acrylamide-gemodificeerde ijzeroxidesuspensie over naar een PCR-buis.
  11. Voeg 50 μL 4% N,N,N', N'-tetramethylethyleendiamine/minerale olie (TEMED, zie tabel 1) toe en incubeer een nacht bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: TEMED is een ontvlambaar oplosmiddel. Werk onder een motorkap. Niet inademen. Uit de buurt houden van open vuur, hete oppervlakken en ontstekingsbronnen. Draag handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Volg de veiligheidsrichtlijnen van de instelling. Gooi de gebruikte labware weg volgens de richtlijnen van de instelling.

7. Het modificeren van de aminogroep van cellulaire eiwitten met monomeeracrylamide

OPMERKING: REpi-seq is ontworpen om het epigenoom van muizen- en menselijke cellen op eencellig niveau te analyseren. Elke stap moet worden geoptimaliseerd wanneer deze methode wordt gebruikt op cellen van andere soorten dan muizen of mensen.

  1. Oogsten van de cellen
    OPMERKING: Tijd: 30 min
    1. Meet de celconcentratie en levensvatbaarheid met behulp van een celteller (zie de tabel met materialen).
      OPMERKING: De levensvatbaarheid van de cellen in deze stap beïnvloedt hoeveel cellen levende cellen zijn in de gegevensanalyse.
    2. Stel de celconcentratie in op 1 × 105 cellen/ml met kweekmedium (*) dat 10% foetaal runderserum bevat.
      OPMERKING: *Kweekmedium is een optimaal kweekmedium voor de cellen van belang.
    3. Breng 1 ml van de celsuspensie over in een buis van 1,5 ml.
    4. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 240 × g en verwijder het supernatant.
    5. Voeg 1 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) toe, meng de cellen door voorzichtig pipetteren en centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 240 × g .
    6. Verwijder het supernatant.
      OPMERKING: Alle bovenstaande stappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire flow clean hood om besmetting te voorkomen.
  2. Het modificeren van de aminogroep van cellulaire eiwitten met monomeer acrylamide
    OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase-besmetting te voorkomen. Tijd: 1,5 uur
    1. Voeg 1 ml Amino Group Modification-oplossing (zie tabel 1) toe aan de celpellet en suspensie de celpellet door voorzichtig pipetteren.
    2. Incubeer de buis gedurende 1 uur op ijs en centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 240 × g bij 4 °C.
    3. Verwijder het supernatant en resuspensie van de cellen met 100 ml 4% acrylamide/1 mM EDTA/PBS met een intercalatorkleurstof voor DNA (zie tabel 1, 1 cel/μl).

8. Bereiding van herbruikbare enkelvoudige cellen

  1. Bereiding van herbruikbare enkelvoudige cellen (handmatige versie)
    OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase-besmetting te voorkomen. Tijd: 9 h/96 cellen
    1. Meng 1 ml van de celsuspensie (1 cel/μl) en 199 ml 1 ml EDTA/PBS met een intercalatorkleurstof voor DNA (zie tabel 1).
    2. Breng 200 μL van de celsuspensie over naar elke put van 96-putplaten met vlakke bodem (totaal 10 platen, zie de materiaaltabel).
    3. Plaats de deksel op de 96-putplaat en scan de 10 platen met een scanmicroscoop (zie de materiaaltabel) om putten te identificeren die een enkele cel bevatten.
    4. Breng de inhoud van de put met een enkele cel over naar een PCR-buis.
      1. Kantel de plaat (in de richting van de operator) en wacht een paar minuten totdat de enkele cel naar de onderrand van de put is gezonken.
      2. Plaats de pipetpunt in de benedenhoek en breng de enkele cel en de buffer (aspiraat 210 μL/put = 200 μL buffer + 10 μL lucht) over in een PCR-buis.
        OPMERKING: Zorg ervoor dat u een P200-tip met lage retentie gebruikt.
      3. Controleer de put met behulp van een fluorescentiemicroscoop om de overdracht te bevestigen.
      4. Als een enkele cel zich nog in de put bevindt, voeg dan 200 μL / put van 1 mM EDTA / PBS toe met een intercalatorkleurstof voor DNA.
      5. Herhaal vervolgens de overdracht.
    5. Centrifugeer de PCR-buis gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 240 × g met behulp van een zwenkrotor zonder rem.
      OPMERKING: Remmen veroorzaakt een wervelende waterstroom in de buis, die de neerslag van de enkele cel verstoort. Bij het centrifugeren met een zwenkbare rotor zonder rem zal de enkele cel altijd naar de bodem van de buis zinken. Als echter een schuine rotor wordt gebruikt, hecht de enkele cel zich aan de zijwand van de PCR-buis en kan deze verloren gaan.
    6. Verwijder 195 μL van het supernatant met een zeer lage pipetteersnelheid.
    7. Voeg 195 μL/tube acrylamide/Bis-acrylamide/APS-oplossing toe (zie tabel 1).
    8. Centrifugeer de PCR-buis gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 240 × g met behulp van een zwenkrotor zonder rem.
    9. Verwijder 195 μL van het supernatant met een zeer lage pipetteersnelheid.
    10. Breng de onderste 3 μL over in de PCR-buis met 4% TEMED/minerale olie en een magnetische polyacrylamidekraal (gegenereerd in stap 6).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u een P10-tip met lage retentie gebruikt. Doseer de cel in de buurt van de magnetische polyacrylamidekraal. In de minerale olie hecht de vloeistof die de enkele cel bevat zich door oppervlaktespanning aan het oppervlak van de magnetische polyacrylamidekraal.
    11. Incubeer een nacht bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Dit proces genereert een dubbellaagse acrylamidegelkraal. De kern is een magnetische gelkraal. De buitenste laag is polyacrylamidegel die een enkele cel bevat. De enkele cel is ingebed in de buitenste laag van de gel. Veilige stopplaats: Na het wassen van de herbruikbare enkelvoudige cellen met 50% glycerol/1 mM EDTA/0,05% Tween 20/0,5% BSA/TBS-buffer kunnen de herbruikbare enkelvoudige cellen tot 6 maanden bij -20 °C worden bewaard.
  2. Bereiding van herbruikbare enkelvoudige cellen (semi-geautomatiseerde versie)
    OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase-besmetting te voorkomen. Tijd: 3 h/96 cellen
    1. Meng 1 ml celsuspensie (1 cel/μl) en 199 ml 1 ml EDTA/PBS met een intercalatorkleurstof voor DNA (zie tabel 1).
    2. Breng 200 μL van de celsuspensie over naar elke put van een 4 nL nanowellplaat (zie figuur 3 en de materiaaltabel) en plaats de 4 nL nanowellplaat op een geautomatiseerde single-cell-picking robot (zie de Tabel met materialen).
    3. Plaats een PCR-plaat met 96 putten als bestemmingsplaat op de geautomatiseerde eencellige pickrobot. Zorg ervoor dat elk putje 200 μL/put acrylamide/Bis-acrylamide/APS-oplossing bevat (zie tabel 1).
    4. Breng een enkele cel over van een nanoput van 4 nL naar een put van de PCR-plaat met 96 putten (zie Aanvullende video S1).
    5. Plaats een deksel op de 96-well PCR-plaat en centrifugeer de 96-well plaat bij 240 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C met behulp van een zwenkrotor zonder rem.
    6. Plaats de PCR-plaat met 96 putten op het dek van een automatische vloeistofbehandelingsrobot (zie de materiaaltabel, figuur 4 en aanvullende code 1).
    7. Sleep de aanvullende code 1 naar het softwarevenster (zie de materiaaltabel) van de vloeistofbehandelingsrobot.
    8. Voer het programma uit op de automatische vloeistofbehandelingsrobot (zie Aanvullende video S2 en aanvullende video S3).
      1. Verwijder 195 μL van het supernatant met een zeer lage pipetteersnelheid.
      2. Voeg 50 μL 4% TEMED/minerale olie toe.
        OPMERKING: Stappen 8.2.8.1-8.2.8.2 kunnen worden uitgevoerd door handmatig pipetteren.
    9. Incubeer 's nachts bij kamertemperatuur (figuur 5). Veilige stopplaats: Bewaar de herbruikbare enkelcellen na het wassen met 50% glycerol/1 mM EDTA/0,05% Tween 20/0,5% BSA/TBS-buffer de herbruikbare enkelvoudige cellen maximaal 6 maanden bij -20 °C.

figure-protocol-3
Figuur 3: Automatische single-cell picking en transfer in een 96-well PCR-plaat in stap 8.2 . (A) Overzicht van een single cell-picking systeem. Een single cell-picking robot zit in een laminaire flow clean hood om besmetting te voorkomen. (B) Een plaat met 24 putten met 4 nL nanowells in de put. (C) Celverdeling in een put van de 24-putplaat. Groene stippen zijn cellen geïdentificeerd als een enkele cel in elke 4 nL nanoput. Magenta-stippen zijn cellen die worden geïdentificeerd als doubletten of vermenigvuldigingen van cellen. (D) Brightfield-afbeelding van de put in de 24-putplaat. Een groen vierkant is een nanoput van 4 nL die een enkele cel bevat. Een magenta vierkant is een 4 nL nanowell die meerdere cellen bevat. (E) Vergroot veld van ongeveer 4 nL nanowells. Heldere stippen zijn enkele cellen in nanowells van 4 nL. Het single cell-picking systeem identificeert nanowells die een enkele cel bevatten door brightfield- en fluorescentiebeelden van cellen met DAPI-kleuring te verkrijgen. Geïdentificeerde afzonderlijke cellen worden overgebracht van de 4 nL nanowell naar een put van een 96-well PCR-plaat. Schaalstaven = 2 mm (C, D), 100 μm (E). Afkorting = DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-4
Figuur 4: Het genereren van herbruikbare afzonderlijke cellen met behulp van een vloeistofbehandelingsrobot . (A) Een dek van de vloeistofbehandelingsrobot. Het dek heeft 11 sleuven voor pipetpuntrekken (P300-tip: sleuven 1-3, P20-tip: sleuven 5-6), 2 ml deep-well 96-well-plaat (sleuf 4), twee 96-well PCR-platen met een enkele cel per put (sleuven 7 en 10) en twee 96-putplaten met platte bodem voor vloeibaar afval (sleuven 8 en 11). (B) Het dek na het plaatsen van de labware. (C) Schematische weergave van robotpipetteren in stap 8.8.1. Het programma verwijdert het supernatant zonder een enkele cel van de bodem van de 96-well PCR-plaat te zuigen. (D) Herbruikbare afzonderlijke cellen die zijn gegenereerd met behulp van de aanvullende code 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

9. Willekeurige primer gloeien en extensie

OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase-besmetting te voorkomen. Asterisken (*) bij de volgende stappen geven aan dat een magnetische separator kan worden gebruikt om de positie van de polyacrylamidekorrels met een herbruikbare enkele cel in de buis te regelen. Het gebruik van de magneetscheider is echter niet essentieel. Door de pipetpunt langzaam langs de wand van de buis te bewegen, worden de kralen omhoog geduwd voor wassen of buffervervanging. Tijd: 9 h

  1. Verwijder de minerale olie door pipetteren(*) en was (*) 5 keer met 200 μL 1x TP Mg(-) buffer (verdun 10x TP Mg(-) buffer tot 1x buffer met ultrapuur water, zie tabel 1).
  2. Verwijder het supernatant (*) en voeg 15 μL gloeibuffer toe (zie tabel 1).
  3. Incubeer gedurende 1 uur op ijs.
    OPMERKING: Het doel van deze incubatie is om het plasma en de kernmembranen te permeabiliseren en de willekeurige primer aan de celkern te leveren.
  4. Plaats de PCR-buizen op een thermische cycler en verwarm gedurende 3 minuten op 94 °C.
    OPMERKING: De buisgrootte is 0,2 ml. Het volume van de oplossing is ongeveer 20 μL, inclusief het volume van de polyacrylamidekraal. De temperatuur van het deksel van de thermische fietser is 105 °C.
  5. Breng de buizen over in een ijsgekoeld metalen blok en incubeer gedurende 2 minuten.
  6. Voeg 4 μL MgSO4/NaCl/dNTP-mix toe (zie tabel 1) en meng met een vortexmixer op een gemiddelde snelheid.
  7. Voeg 1 μL Bst-polymerase toe, groot fragment (zie de materiaaltabel) en meng met behulp van een vortexmixer op een gemiddelde snelheid.
  8. Incubeer gedurende 4 uur op een schudder (600 tpm bij 4 °C).
    OPMERKING: Het doel van deze incubatie is om het Bst-polymerase aan de celkern af te leveren.
  9. Plaats de PCR-buis op een thermische cycler en voer een van de volgende programma's uit.
    1. Voer een programma van 4 uur uit: 10 °C gedurende 30 minuten, 20 °C gedurende 30 minuten en 25 °C gedurende 180 minuten.
    2. U kunt ook een nachtprogramma uitvoeren: 4 °C gedurende 4 uur, 10 °C gedurende 2 uur, 20 °C gedurende 2 uur, 25 °C gedurende 4 uur en 4 °C vasthouden.
      OPMERKING: De buisgrootte is 0,2 ml. Het volume van de oplossing is ongeveer 25 μL, inclusief het volume van de polyacrylamidekraal. De temperatuur van het deksel van de thermische cycler is 105 °C. Veilige stopplaats: Stop het experiment hier voor maximaal 1 dag door de herbruikbare enkele cellen bij 4 °C te bewaren.

10. Antilichaambinding

OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase-besmetting te voorkomen. Tijd: 1,5 uur

  1. Voeg 1,625 μl NaCl/EDTA/BSA-oplossing toe (zie tabel 1) en meng door vortexing op lage snelheid.
    OPMERKING: Deze stap heeft tot doel 1) de chelatie van Mg2 + door EDTA te vergemakkelijken, 2) de binding van de verlengde 1ewillekeurige primer met 300 mM NaCl te stabiliseren en 3) niet-specifieke binding van antilichamen te blokkeren met behulp van runderserumalbumine (BSA) in de daaropvolgende reactie.
  2. Incubeer gedurende 1 uur op ijs en voeg 0,1 μg/ml elk van antilichamen toe en controle IgG geconjugeerd met antilichaamsonde (bereid in stap 5).
  3. Incubeer 's nachts op ijs met zacht schudden op een shaker.

11. Nabijheidsligatie van antilichaamsonde en proximaal verlengde willekeurige primer

OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase-besmetting te voorkomen. Sterretjes (*) geven in de volgende stappen aan waar een magnetische separator kan worden gebruikt om de positie van polyacrylamidekorrels met een herbruikbare enkele cel in de buis te regelen. Het gebruik van de magneetscheider is echter niet essentieel. Door de pipetpunt langzaam langs de wand van de buis te bewegen, kunnen de kralen omhoog worden geduwd voor wassen of bufferuitwisseling. Tijd: 6 h

  1. Was (*) tweemaal met 200 μL 1x TPM-T buffer (20 min incubatie in elke wasbeurt) op ijs. Verdun 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Kaliumchloride/Magnesiumsulfaat/Triton X-100) tot 1x met ultrapuur water).
  2. Verwijder (*) het supernatant en was (*) eenmaal met 1x T4 DNA ligasebuffer (zie de Tabel met Materialen).
  3. Verwijder (*) het supernatant en voeg 19 μL ligatieadapteroplossing toe (zie tabel 1).
  4. Incubeer gedurende 1 uur bij 25 °C.
  5. Voeg 1 μL T4 DNA-ligase toe (zie de materiaaltabel) en meng de buis op een vortexmenger op gemiddelde snelheid.
  6. Plaats de buis op een thermische cycler en voer het volgende programma uit: nabijheidsligatieprogramma, 4 uur bij 16 °C en 30 minuten bij 25 °C.
    OPMERKING: De buisgrootte is 0,2 ml. Het volume van de oplossing is ongeveer 25 μL, inclusief het volume van de polyacrylamidekraal. De temperatuur van het deksel van de thermische fietser is kamertemperatuur.
  7. Was (*) tweemaal kort met 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(+) buffer (zie tabel 1; bereid 1x buffer van 10x voorraadbuffer) en bewaar de cel bij 4 °C, gedurende een nacht. Veilige stopplaats: Stop het experiment hier voor maximaal 1 dag door de herbruikbare afzonderlijke cellen bij 4 °C te bewaren.

12. Volledige verlenging van de 1e willekeurige primer

OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase-besmetting te voorkomen. Tijd: 4,5 uur

  1. Was tweemaal met 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(-) buffer (zie tabel 1, bereid 1x buffer van 10x voorraadbuffer), verwijder het supernatant en voeg 20 μL Bst/dNTPs/MgSO4 mengsel toe (zie tabel 1).
  2. Meng met een vortexmixer op gemiddelde snelheid en incubeer gedurende 4 uur op een orbitale shaker (bij 6 °C en 500 rpm).
  3. Plaats de buis op een thermische cycler en voer het volgende programma uit: full-extension programma: 10 °C gedurende 1 uur, 20 °C gedurende 1 uur, 30 °C gedurende 1 uur, 40 °C gedurende 1 uur, 50 °C gedurende 1 uur, 65 °C gedurende 1 uur, 94 °C gedurende 10 minuten en houd op 4 °C.
    OPMERKING: Veilige stopplaats: Het experiment kan hier maximaal 1 dag worden gestopt door de herbruikbare afzonderlijke cellen bij 4 °C te bewaren.

13. Versterking met meerdere verplaatsingen

OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase-besmetting te voorkomen. Tijd: 2,5 uur (stappen 13.1-13.2) + 15 min (stappen 13.3-13.4) + 1 dag (stappen 13.5-13.10)

  1. Voeg 0,4 μL 100 μM2e willekeurige primer toe (zie tabel 3) en meng met een vortexmenger op gemiddelde snelheid.
  2. Incubeer gedurende 2 uur bij 6 °C en 500 tpm op een orbitale schudder en plaats de buis op een thermische cycler en verwarm gedurende 3 minuten op 94 °C.
    OPMERKING: De buisgrootte is 0,2 ml. Het volume van de oplossing is ongeveer 25,4 μl, inclusief het volume van de polyacrylamidekraal. De temperatuur van het deksel van de thermische fietser is 105 °C.
  3. Plaats de buisjes in een ijsgekoeld metalen blok en voeg 1 μL/buisje Bst DNA polymerase toe.
  4. Vortex op lage snelheid, plaats de buizen op een thermische cycler en voer het volgende programma uit:
    4 °C gedurende 4 uur, 10 °C gedurende 30 minuten, 20 °C gedurende 30 minuten, 30 °C gedurende 30 minuten, 40 °C gedurende 30 minuten, 50 °C gedurende 30 minuten, 65 °C gedurende 60 minuten, 94 °C gedurende 3 minuten en houden op 4 °C.
    OPMERKING: De buisgrootte is 0,2 ml. Het volume van de oplossing is ongeveer 26,4 μl, inclusief het volume van de polyacrylamidekraal. De temperatuur van het deksel van de thermische cycler is 105 °C. Veilige stopplaats: Stop het experiment hier voor maximaal 1 dag door de herbruikbare enkele cellen bij 4 °C te bewaren.
  5. Verzamel het supernatant (ongeveer 20 μL) en breng het over in een PCR-buis.
  6. Bewaar het verzamelde supernatant bij -80 °C.
  7. Voeg 20 μL/buis van 0,05% Tween 20/0,1x TE-buffer toe aan een PCR-buis met de herbruikbare enkele cel (zie tabel 1) en incuber de herbruikbare enkele cel bij 4 °C, gedurende een nacht. Veilige stopplaats: Stop het experiment hier een paar dagen door de incubatietijd te verlengen.
  8. Verzamel het supernatant en combineer het supernatant met het monster dat is verzameld bij stap 13.5.
  9. Herhaal stap 13.7-13.8 nogmaals. Week de herbruikbare enkele cel in 50% glycerol/5 mM EDTA/0,5% BSA/0,05% Tween20/TBS buffer en incubeer deze gedurende 30 minuten op een orbitale shaker (4 °C, 600 rpm). Bewaar de herbruikbare enkele cel bij -20 °C tot het volgende experiment.
  10. Voeg 40 μL Exo-mastermix toe (zie tabel 1) en plaats de buis op een thermische cycler en voer het volgende programma uit: i) 95 °C gedurende 5 minuten, ii) 95 °C gedurende 30 s, iii) 60 °C 30 s, iv) 72 °C gedurende 30 s, v) herhaal stap ii-iv 19 keer, vi) 72 °C gedurende 5 minuten, vii) houden bij 4 °C.
    OPMERKING: De buisgrootte is 0,2 ml. Het volume van de oplossing is ongeveer 45 μL, inclusief het volume van de polyacrylamidekraal. De temperatuur van het deksel van de thermische cycler is 105 °C. Veilig stoppunt: Het experiment kan hier minstens enkele dagen worden gestopt door het monster bij -80 °C te bewaren.

14. Fenol-chloroform zuivering en polyethyleenglycol precipitatie

OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase-besmetting te voorkomen. Tijd: 1,5 uur

  1. Breng het product over in een 0,5 ml DNA laagbindende buis en voeg 100 μL fenol: chloroform: isoamylalcohol toe.
    OPMERKING: Fenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol veroorzaakt irritatie en mogelijk brandwonden door contact. Draag handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Gebruik alleen met voldoende ventilatie of draag een geschikt gasmasker. Volg de veiligheidsrichtlijnen van de instelling. Gooi de gebruikte labware weg volgens de richtlijnen van de instelling.
  2. Schud gedurende 30 s met de hand en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 12.000 × g .
  3. Verzamel de waterige fase (80 μL) in een 0,5 ml DNA laagbindende buis en voeg 40,84 μL/buis lineair acrylamide/MgCl2-mengsel toe (zie tabel 1).
  4. Voeg 47,06 μL/tube van 50% (m/v) PEG8000 (RNase-vrij) toe en meng door pipetteren.
  5. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 240 × g bij kamertemperatuur.
  6. Verwijder het supernatant en voeg 400 μL/tube 80% ethanol (EtOH) toe.
  7. Wassen met 80% EtOH, verwijder het supernatant met een aspirator en droog de pellet aan de lucht.
  8. Suspensie van de pellet met 20 μL 1 mM EDTA/10 mM Tris-HCl, pH 7,4 buffer, en bewaar de oplossing bij -80 °C.
    OPMERKING: Meet de DNA-concentratie met behulp van een dubbelstrengs DNA-specifieke intercalatorkleurstof (zie de tabel met materialen). Veilige stopplaats: Het experiment kan hier veilig voor minstens een week worden gestopt.

15. In vitro transcriptie

OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase- en RNase-verontreiniging te voorkomen. Tijd: 5 h

  1. Ontdooi DNA van van één cel afgeleide producten (vanaf stap 14) en bereid een gemengde bibliotheek van van één cel afgeleide producten voor door 2 μL/cel van de DNA-producten te mengen (totaal volume 20 μL).
  2. Voeg 26 μL in vitro transcriptiemastermix toe (zie de materiaaltabel en het protocol van de fabrikant) en meng door pipetteren.
  3. Plaats de PCR-buis op een thermische cycler en incubeer gedurende 4 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: De buisgrootte is 0,2 ml. Het volume van de oplossing is 46 μL. De temperatuur van het deksel van de thermische fietser is 105 °C.
  4. Voeg 5 μL 10x DNase I-buffer toe (zie de Materiaaltabel) en voeg 4 μL DNase I toe (RNase-vrij, 4 U, zie de Materiaaltabel).
  5. Meng en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C en breng het monster over in een buis van 0,5 ml.
  6. Voeg 300 μL/tube Guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform toe (zie de tabel met materialen) en meng door zachte vortexing.
    OPMERKING: Guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform kan leiden tot ernstige chemische brandwonden door contact. Draag handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Gebruik alleen met voldoende ventilatie of draag een geschikt gasmasker. Volg de veiligheidsrichtlijnen van de instelling. Gooi de gebruikte labware weg volgens de richtlijnen van de instelling.
  7. Incubeer gedurende 5 minuten bij R.T. op een shaker en bewaar de monsters vervolgens bij -80 °C gedurende maximaal 3 dagen.
    OPMERKING: Veilige stopplaats: Het experiment kan hier veilig worden gestopt voor maximaal 3 dagen.

16. RNA-zuivering

OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase- en RNase-verontreiniging te voorkomen. Tijd: 2 uur

  1. Voeg 80 μl/buisje chloroform toe aan het monster uit stap 15.7 en schud de buis gedurende 15 s krachtig met de hand.
  2. Incubeer gedurende 2-15 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 12.000 × g bij 4 °C.
  3. Verzamel en breng de waterige fase van het monster (~ 200 μL) over naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
  4. Voeg 600 μL/tube Guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform toe en breng het monster over in een buis van 1,5 ml.
  5. Voeg 180 μL/tube Chloroform toe en schud de tube krachtig met de hand gedurende 15 s.
  6. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 12.000 × g bij 4 °C.
  7. Verzamel en breng de waterige fase van het monster (~ 450 μL) over naar een buis van 1,5 ml.
  8. Voeg 60 μL/tube lineair acrylamide (5 μg/μL) toe en voeg 400 μL/tube 100% isopropanol toe aan de waterige fase.
  9. Incubeer de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer deze gedurende 10 minuten bij 12.000 × g bij 4 °C.
  10. Verwijder het supernatant voorzichtig.
  11. Was de RNA-pellet 3 keer met 200 μL 75% ethanol (EtOH/RNase-vrij water), verwijder het supernatant en droog de RNA-pellet aan de lucht.
    OPMERKING: Laat het RNA niet volledig drogen omdat de pellet zijn oplosbaarheid kan verliezen.
  12. Resuspendeer de RNA-pellet in 20 μL RNase-vrij water met een RNAse-remmer (1 μL/20 μL) en los de pellet op door pipetteren.
  13. Meet de absorptie bij 260 nm.

17. Omgekeerde transcriptie

OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase-besmetting te voorkomen. Tijd: 1 h

  1. Voeg 7 μL/tube Reverse Transcription primer + dNTP mix toe (zie tabel 1 en tabel 3) en plaats de buizen op een thermische cycler.
    OPMERKING: De buisgrootte is 0,2 ml. Het volume van de oplossing is 27 μL. De temperatuur van het deksel van de thermische fietser is 105 °C.
  2. Verwarm gedurende 5 minuten op 65 °C en plaats de buizen minstens 1 minuut op ijs.
  3. Voeg 14 μL/tube reverse transcriptase master mix toe (zie tabel 1) en meng door pipetteren.
  4. Plaats de buizen op een thermische cycler en incubeer ze bij 55 °C gedurende 10 minuten en vervolgens bij 80 °C gedurende 10 minuten.
    OPMERKING: De buisgrootte is 0,2 ml. Het volume van de oplossing is 60 μL. De temperatuur van het deksel van de thermische fietser is 105 °C.

18. Tweede streng synthese

OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase-besmetting te voorkomen. Tijd: 2,5 uur

  1. Voeg 40 μL/tube ultrapuur water toe en splits de 100 μL oplossing in twee 0,2 ml PCR-buizen (50 μL/buis).
  2. Voeg 60 μL/buis tweede streng synthesemengsel toe (zie tabel 1) en plaats de buizen op een thermische cycler en voer het volgende programma uit: i) 95 °C gedurende 5 minuten, ii) 95 °C gedurende 30 s, iii) 60 °C gedurende 30 s, iv) 72 °C gedurende 30 s, v) herhaal stap ii-iv 20 keer en vi) houd bij 4 °C.
    OPMERKING: De buisgrootte is 0,2 ml. Het volume van de oplossing is 110 μL. De temperatuur van het deksel van de thermische fietser is 105 °C.
  3. Voeg 4,4 μL/tube van 0,5 M EDTA (laatste 20 mM) toe en bewaar bij -80 °C, een nacht.
    OPMERKING: Veilige stopplaats: Het experiment kan hier veilig worden gestopt voor maximaal een paar dagen.
  4. Zuiver DNA door fenol-chloroform zuivering en polyethyleenglycol precipitatie (beschreven in stap 14).
    OPMERKING: Veilige stopplaats: Het experiment kan hier veilig worden gestopt voor ten minste een week.

19. Restrictie enzymvertering en grootteselectie

OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd onder een schone kap om DNase-besmetting te voorkomen. Tijd: 3 uur (stappen 19.1-19.7)

  1. Meet de DNA-concentratie van het gezuiverde DNA (vanaf stap 18.4) door de absorptie bij 260 nm te meten.
  2. Breng 6 μg DNA over naar een PCR-buis, voeg 30 μL 10x de spijsverteringsbuffer toe en pas het volume aan tot 294 μL met ultrapuur water.
  3. Voeg 6 μl BciVI-restrictie-enzym toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
  4. Voer EtOH-precipitatie uit met lineair polyacrylamide.
    1. Voeg 60 μL/tube 3 M natriumacetaat (pH 5,2) toe en voeg vervolgens 40 μL/tube Lineair acrylamide toe (5 mg/ml, zie de materiaaltabel).
    2. Voeg 400 μL/tube EtOH toe en incubeer een nacht bij -20 °C.
      OPMERKING: Veilige stopplaats: Het experiment kan hier veilig voor één dag worden gestopt.
    3. Centrifugeer 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant.
    4. Was de pellet twee keer met 80% EtOH en droog de pellet.
    5. Los de pellet op met 20 μL 1xTE buffer en voeg 4 μL/tube verse 6x Gel Loading buffer toe.
  5. Laad het monster in een 5% agarose gel/0,5x TAE-buffer en voer elektroforese uit (50 V gedurende 40 min).
  6. Knip en verzamel de gel boven 50 bp (zie figuur 6) en extraheer het DNA met behulp van een Gel Extraction kit.
    OPMERKING: Veilige stopplaats: Het experiment kan hier veilig worden gestopt voor ten minste een week.
  7. Construeer de sequencingbibliotheek met behulp van een DNA-bibliotheekvoorbereidingskit (zie de materiaaltabel)16,17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K562 enkele cellen werden gegenereerd met behulp van het protocol beschreven in stap 8 (zie figuur 5). Enkele cellen waren ingebed in de buitenste laag van de polyacrylamidekraal. Cel-DNA werd gekleurd en gevisualiseerd met behulp van een intercalatorkleurstof voor DNA-kleuring.

figure-results-1
Figuur 5: Gegenereerde herbruikb...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft het stapsgewijze protocol voor de onlangs gerapporteerde eencellige multi-epigenomische analyse met herbruikbare afzonderlijke cellen7. In de volgende paragrafen bespreken we kritieke punten, waarbij we de nadruk leggen op mogelijke beperkingen in het protocol.

Een van de kritieke punten in het protocol (van stap 7.2-13) is het vermijden van DNase-besmetting. Een enkele cel heeft slechts twee kopieën van genomisch DNA. Daarom vermindert het besch...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drs. Ohnuki en Tosato zijn mede-uitvinders van een patent getiteld "Methods for preparing a reusable single cell and methods for analyzing the epigenome, transcriptome and genome of a single cell" (EP3619307 en US20200102604). De octrooiaanvraag werd gedeeltelijk ingediend op basis van voorlopige resultaten met betrekking tot de technologie die in het huidige manuscript wordt beschreven. De uitvinding of uitvindingen die in deze octrooiaanvraag worden beschreven en geclaimd, zijn gedaan terwijl de uitvinders fulltime werknemers van de Amerikaanse overheid waren. Daarom zijn onder 45 Code of Federal Regulations Part 7 alle rechten, titels en belangen met betrekking tot deze octrooiaanvraag bij wet toegewezen aan de Amerikaanse overheid. De Amerikaanse overheid draagt een deel van de royalty's die zij ontvangt over aan haar werknemersuitvinders onder 15 U.S. Code § 3710c.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken Drs. David Sanchez-Martin en Christopher B. Buck voor hun commentaar tijdens de conceptualiseringsfase van het project. We bedanken ook de Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health voor hulp bij voorbereidende experimenten en de Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH voor advies in computationele analyse. We bedanken mevrouw Anna Word voor het helpen met de optimalisatie van DNA-polymerasen die in de methode worden gebruikt. Dit werk maakte gebruik van de computationele middelen van het NIHHPC Biowulf-cluster (http://hpc.nih.gov). Dit project wordt ondersteund door het intramurale programma van het Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, de NCI Director's Innovation Award (# 397172) en federale fondsen van het National Cancer Institute onder contractnummer HHSN261200800001E. We bedanken Drs. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy en alle leden van het Laboratorium voor Cellulaire Oncologie voor productieve opmerkingen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x CutSmart bufferNew England BioLabsB600410x Digestion buffer
200 proof ethanolWarner-Graham Company200 proofEthanol
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9]EpigentekA-1018-100Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Iodide StainLogos BiosystemsF23001Cell counter
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biologyMilliporeSigma01697-500ML40% acrylamide solution
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710KeyenceBZ-X710Scanning microscope
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMilliporeSigmaUFC510024Ultrafiltration cassette
Ammonium persulfate for molecular biologyMilliporeSigmaA3678-100GAmmonium persulfate powder
Anhydrous DMFVector laboratoriesS-4001-005Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF)
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8]Abcamab5408Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibodyAbcamab60950Anti-Med1
BciVINew England BioLabsR0596LBciVI
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biologyMilliporeSigmaB8667-5ML20% BSA (Table 7)
Bst DNA Polymerase, Large FragmentNew England BioLabsM0275LBst DNA polymerase
BT10 Series 10 µl Barrier TipNEPTUNEBT10P10 low-retention tip
CellCelectorAutomated Lab SolutionsN/AAutomated single cell picking robot
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULAAutomated Lab SolutionsCC00794 nL nanowell plate
ChloroformMilliporeSigmaChloroform
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom MicroplateCorning3596Flat-bottom 96-well plates
Deep Vent (exo-) DNA PolymeraseNew England BioLabsM0259LExo- DNA polymerase
DNA LoBind Tubes, 0.5 mLEppendorf301080350.5 mL DNA low-binding tube
DNA Oligo, 1st random primerIntegrated DNA TechnologiesN/A, see Table 31st random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01Integrated DNA TechnologiesN/A, see Table 32nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02Integrated DNA TechnologiesN/A, see Table 32nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03Integrated DNA TechnologiesN/A, see Table 32nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04Integrated DNA TechnologiesN/A, see Table 32nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05Integrated DNA TechnologiesN/A, see Table 32nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06Integrated DNA TechnologiesN/A, see Table 32nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07Integrated DNA TechnologiesN/A, see Table 32nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08Integrated DNA TechnologiesN/A, see Table 32nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09Integrated DNA TechnologiesN/A, see Table 32nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10Integrated DNA TechnologiesN/A, see Table 32nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11Integrated DNA TechnologiesN/A, see Table 32nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12Integrated DNA TechnologiesN/A, see Table 32nd random primer
DNA Oligo, 2nd synthesis primerIntegrated DNA TechnologiesN/A, see Table 32nd synthesis primer
DNA Oligo, Ligation AdaptorIntegrated DNA TechnologiesN/A, see Table 3Ligation Adaptor
DNA Oligo, Reverse Transcription primerIntegrated DNA TechnologiesN/A, see Table 3Reverse Transcription primer
DNase I (RNase-free)New England BioLabsM0303LDNase I (RNase-free, 4 U).
DNase I Reaction BufferNew England BioLabsB0303S10x DNase I buffer (NEB)
dNTP Mix (10 mM each)Thermo FisherR019210 mM dNTPs
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivatedMilliporeSigmaF4135-500MLFetal bovine serum
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BioLabsE2040SIn-vitro-transcription master mix
Histone H3K27ac antibodyActive motif39133Anti-H3K27ac
Histone H3K27me3 antibodyActive motif39155Anti-H3K27me3
IgG from rabbit serumMillipore SigmaI5006-10MGControl IgG
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalizedMilliporeSigma747467-1GNHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder
K-562American Type Culture Collection (ATCC)CCL-243cells
Linear Acrylamide (5 mg/mL)Thermo FisherAM9520Linear Acrylamide
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell CounterLogos BiosystemsL20001Cell counter
LUNA Cell Counting Slides, 50 SlidesLogos BiosystemsL12001Cell counter
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oilMilliporeSigmaM5904-500MLMineral oil
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biologyMilliporeSigmaT7024-100MLN,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
NaCl (5 M), RNase-freeThermo FisherAM9760G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
  2. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781(2018).
  3. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
  4. Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
  5. Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
  6. Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
  7. Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
  8. Tosato, G., Ohnuki, H. Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).
  9. Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
  10. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  11. Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
  12. Weast, R. C., et al. Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).
  13. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  14. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).
  15. Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  16. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).
  17. Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).
  18. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  19. Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
  20. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Reusable Single CellIterative Epigenomic AnalysisSingle Cell EpigenomeProximity LigationPolyacrylamide EmbeddingAntibody DNA ProbeHistone ModificationsMultiple Displacement AmplificationCapillary ElectrophoresisMultiomics Analysis

Related Articles