Methodenartikel

Organische eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen voor robuuste proteoomzuivering vóór massaspectrometrie

DOI:

10.3791/63503

⸱

7 februari 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen onder gecontroleerde omstandigheden voor robuust en snel herstel en zuivering van proteoommonsters voorafgaand aan massaspectrometrie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel meerdere ontwikkelingen in massaspectrometrie (MS) -instrumenten de kwalitatieve en kwantitatieve proteoomanalyse hebben verbeterd, zijn betrouwbaardere front-endbenaderingen om eiwitten te isoleren, verrijken en verwerken vóór MS van cruciaal belang voor succesvolle proteoomkarakterisering. Lage, inconsistente eiwitterugwinning en resterende onzuiverheden zoals oppervlakteactieve stoffen zijn schadelijk voor MS-analyse. Eiwitprecipitatie wordt vaak als onbetrouwbaar, tijdrovend en technisch uitdagend beschouwd om uit te voeren in vergelijking met andere monstervoorbereidingsstrategieën. Deze zorgen worden overwonnen door gebruik te maken van optimale eiwitprecipitatieprotocollen. Voor acetonprecipitatie is de combinatie van specifieke zouten, temperatuurregeling, oplosmiddelsamenstelling en precipitatietijd van cruciaal belang, terwijl de efficiëntie van chloroform / methanol / waterprecipitatie afhankelijk is van de juiste pipettering en flaconmanipulatie. Als alternatief zijn deze neerslagprotocollen gestroomlijnd en semi-geautomatiseerd in een wegwerpspincartridge. De verwachte resultaten van eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen in het conventionele formaat en met behulp van een wegwerp-, tweetrapsfiltratie- en extractiepatroon worden in dit werk geïllustreerd. Dit omvat de gedetailleerde karakterisering van proteomische mengsels door bottom-up LC-MS/MS-analyse. De superieure prestaties van sds-gebaseerde workflows worden ook aangetoond ten opzichte van niet-verontreinigde eiwitten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteoomanalyse door massaspectrometrie is steeds rigoureuzer geworden, vanwege de verbeterde gevoeligheid, resolutie, scansnelheid en veelzijdigheid van moderne MS-instrumenten. Ms-vooruitgang draagt bij aan een grotere efficiëntie van eiwitidentificatie en nauwkeuriger kwantificering 1,2,3,4,5. Met verbeterde MS-instrumentatie eisen onderzoekers een overeenkomstig consistente front-end monstervoorbereidingsstrategie die in staat is tot kwantitatief herstel van zeer zuivere eiwitten in minimale tijd in alle stadia van de workflow 6,7,8,9,10,11 . Om de proteoomstatus van een biologisch systeem nauwkeurig weer te geven, moeten eiwitten op een efficiënte en onbevooroordeelde manier uit de inheemse monstermatrix worden geïsoleerd. Hiertoe zorgt het opnemen van een denaturerende oppervlakteactieve stof, zoals natriumdodecylsulfaat (SDS), voor efficiënte eiwitextractie en oplosbaarheid12. SDS interfereert echter sterk met elektrospray-ionisatie, waardoor ernstige MS-signaalonderdrukking ontstaat als het niet goed wordt geëlimineerd13.

Verschillende SDS-depletiestrategieën zijn beschikbaar voor daaropvolgende proteoomanalyse, zoals het vasthouden van eiwitten boven een moleculair gewichtsafsnijdingsfilter in wegwerpspinpatronen 14,15,16. De filterondersteunde monstervoorbereidingsmethode (FASP) heeft de voorkeur omdat het sds effectief onder 10 ppm uitput, waardoor optimale MS mogelijk wordt. Eiwitherstel met FASP is echter variabel, wat leidde tot de verkenning van andere technieken. Chromatografische benaderingen die selectief eiwitten (of oppervlakteactieve stoffen) vastleggen, zijn geëvolueerd naar verschillende handige cartridges of op kralen gebaseerde formaten 17,18,19,20,21. Gezien deze eenvoudige en (idealiter) consistente strategieën voor eiwitzuivering, wordt de klassieke benadering van eiwitprecipitatie met organische oplosmiddelen vaak over het hoofd gezien als een veelbelovende benadering van eiwitisolatie. Hoewel is aangetoond dat oplosmiddelprecipitatie SDS met succes onder kritieke niveaus uitput, is eiwitterugwinning al lang een zorg van deze aanpak. Meerdere groepen hebben een eiwitherstelbias waargenomen, met onaanvaardbaar lage neerslagopbrengsten als functie van eiwitconcentratie, molecuulgewicht en hydrofobiciteit 22,23. Vanwege de diversiteit aan neerslagprotocollen die in de literatuur worden gerapporteerd, werden gestandaardiseerde neerslagcondities ontwikkeld. In 2013 rapporteerden Crowell et al. voor het eerst de afhankelijkheid van ionische sterkte van de neerslagefficiëntie van eiwitten in 80% aceton24. Voor alle onderzochte eiwitten bleek de toevoeging van maximaal 30 mM natriumchloride essentieel om de opbrengsten te maximaliseren (tot 100% herstel). Meer recent toonden Nickerson et al. aan dat de combinatie van nog hogere ionische sterkte (tot 100 mM) met verhoogde temperatuur (20 °C) tijdens acetonprecipitatie bijna kwantitatief herstel gaf in 2-5 min25. Een lichte daling in het herstel van laagmoleculaire gewicht (LMW) eiwitten werd waargenomen. Daarom toonde een daaropvolgend rapport van Baghalabadi et al. de succesvolle terugwinning van LMW-eiwitten en peptiden (≤5 kDa) aan door specifieke zouten, met name zinksulfaat, te combineren met een hoger gehalte aan organisch oplosmiddel (97% aceton)26.

Terwijl het verfijnen van het neerslagprotocol een betrouwbaardere eiwitzuiveringsstrategie biedt voor op MS gebaseerde proteomics, is het succes van conventionele neerslag sterk afhankelijk van de gebruikerstechniek. Een primair doel van dit werk is om een robuuste precipitatiestrategie te presenteren die de isolatie van de eiwitpellet van het verontreinigende supernatant vergemakkelijkt. Een wegwerpfiltratiepatroon werd ontwikkeld om pipetteren te elimineren door geaggregeerd eiwit te isoleren boven een poreusPTFE-membraanfilter 27. MS-storende componenten in het supernatant worden effectief verwijderd in een korte, lage snelheid centrifugatiestap. Het wegwerpfilterpatroon biedt ook een verwisselbare SPE-cartridge, die het mogelijk maakt om monsters op te ruimen na resolubilisatie en optionele eiwitvertering, vóór massaspectrometrie.

Een reeks aanbevolen proteoomprecipitatieworkflows worden hier gepresenteerd, waaronder gemodificeerde aceton- en chloroform / methanol / water28-protocollen , in een conventioneel (op basis van flacons) en een semi-geautomatiseerd formaat in een wegwerp tweetoestandsfiltratie- en extractiepatroon. De resulterende eiwitterugwinningen en SDS-depletie-efficiënties worden benadrukt, samen met bottom-up LC-MS / MS-proteoomdekking, om de verwachte uitkomst van elk protocol aan te tonen. De praktische voor- en nadelen van elke aanpak worden besproken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Materiaaloverwegingen en monstervoorbereiding

  1. Gebruik alleen oplosmiddelen met een hoge zuiverheidsgraad (aceton, chloroform, methanol) (>99,5%) en chemicaliën, vrij van overtollig vocht.
  2. Bereid natriumchloride- en zinksulfaatoplossingen (1 M) in water.
    OPMERKING: Zoutoplossingen kunnen voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden bewaard, zolang ze vrij zijn van verontreiniging of microbiële groei.
  3. Gebruik de kleinste polypropyleen (PP) microcentrifugeflacon die voldoende is om het vereiste volume monster en oplosmiddelen te behouden om precipitatie te induceren.
  4. Zorg ervoor dat de SDS-concentratie in het te precipiteren monster niet hoger is dan 2% (g/v). Als de SDS hoger is, verdunt u het monster met water.
  5. Zorg voor een eiwitconcentratie tussen 0,01 en 10 g/l voor een optimale neerslagefficiëntie.
    OPMERKING: De optimale massa voor neerslag varieert tussen 1-100 μg eiwit.
  6. Zorg ervoor dat alle oplosmiddelen en oplossingen vrij zijn van deeltjes voor gebruik. Voer een filtratie (<0,5 μm) of centrifugatiestap (10.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur) uit om onopgeloste deeltjes te verwijderen.
  7. Als disulfidebindingsreductie en alkylering vereist zijn, voer deze stappen dan uit voorafgaand aan eiwitprecipitatie. Overtollige reducerende en alkylerende reagentia worden verwijderd door het precipitatieproces.
  8. Bespoedig de eiwitten door een van de protocollen te selecteren en uit te voeren (stap 2, 3, 4 of 5).

2. Snelle (op injectieflacons gebaseerde) eiwitprecipitatie met aceton

  1. Pipetteer 90 μL (deeltjesvrije) eiwit- of proteoomoplossing in een PP-microcentrifugebuis. Voeg vervolgens 10 μL van 1 M waterige NaCl toe.
    OPMERKING: Als de ionische sterkte van het proteoomextract al groter is dan 100 mM, is er geen extra zout nodig.
  2. Pipetteer 400 μL aceton in het monster. Sluit de injectieflacon af en tik zachtjes op de injectieflacon om de oplosmiddelen te combineren. Krachtig mengen is niet vereist.
    OPMERKING: Het volume van eiwitten, zout en aceton kan worden verhoogd zolang de relatieve verhouding van elk wordt gehandhaafd.
  3. Laat de injectieflacon ongestoord bij kamertemperatuur incuberen gedurende minimaal 2 minuten.
    OPMERKING: Langere incubaties, inclusief die bij lagere temperatuur (bijv. Conventionele acetonprecipitatie maakt gebruik van nachtelijke neerslag in de vriezer), kunnen leiden tot de vorming van grotere (zichtbare) geaggregeerde eiwitdeeltjes (figuur 1A), die over het algemeen de totale eiwitterugwinning niet verbeteren.
  4. Plaats na incubatie monsters in een centrifuge en noteer de oriëntatie van de injectieflacon. Draai minimaal 2 minuten, bij 10.000 x g of hoger bij kamertemperatuur.
  5. Sluit de injectieflacon af en decanteer het supernatant voorzichtig door de injectieflacon langzaam om te keren naar een afvalcontainer. Raak de omgekeerde injectieflacon aan op een papieren handdoek om het resterende oplosmiddel uit de injectieflacon te halen.
    LET OP: Afvalmiddelen moeten worden bewaard en weggegooid volgens de juiste protocollen.
  6. Voor SDS-bevattende monsters moet u 400 μL verse aceton afgeven, waarbij u moet oppassen dat u de pellet niet verstoort.
    OPMERKING: Stap 2.6 is optioneel.
    1. Centrifugeer het monster onmiddellijk (10.000 x g of hoger gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur) en plaats de injectieflacon in dezelfde richting als de eerste spin in de rotor. Decanteer het wasmiddel zoals beschreven in stap 2.5.
  7. Laat het monster volledig drogen met de dop open (~1 min). Vat de injectieflacon samen en ga verder met het oplossen van pellets (stap 6).

3. Precipitatie van peptiden met laag molecuulgewicht (LMW) (ZnSO4 + aceton)

  1. Doseer 54 μL proteoomextract aan een injectieflacon van 2 ml PP en voeg vervolgens 6 μL 1 M ZnSO4 toe.
    OPMERKING: Optimaal herstel van LMW-peptiden (≤5 kDa) wordt verkregen door aceton toe te voegen aan een laatste volumeprocent van 97. Uitgaande van een injectieflacon pp van 2 ml is het maximale initiële monstervolume 54 μl.
  2. Voeg 1940 μL aceton toe aan een laatste 97 volumeprocent. Draai zachtjes om te mengen en laat minimaal 2 minuten ongestoord op de benchtop staan.
  3. Centrifugeer (10.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur) en verwijder het supernatant door de injectieflacon om te keren en vervolgens de injectieflacon aan te raken op een papieren handdoek.
  4. Voor SDS-bevattende monsters moet u 400 μL verse aceton afgeven, waarbij u moet oppassen dat u de pellet niet verstoort.
    OPMERKING: Stap 3.4 is optioneel.
    1. Centrifugeer het monster onmiddellijk volgens stap 3.3 en plaats de injectieflacon in dezelfde richting als de eerste spin in de rotor. Decanteer het wasmiddel zoals beschreven in stap 3.3.
  5. Re-solubiliteer de resulterende droge pellet in een waterig oplosmiddel met korte vortexing of ultrasoonapparaat (~ 5 min).

4. Eiwitprecipitatie door chloroform/methanol/water (CMW)

  1. Doseer 100 μL van het eiwit of de proteoomoplossing in een injectieflacon PP. Voeg 400 μL methanol toe, gevolgd door 100 μL chloroform. Sluit de injectieflacon en vortex kort af om te mengen.
    OPMERKING: Voor CMW-neerslag heeft injectieflacons van 1,5 ml met smalle bodems de voorkeur (figuur 2A).
    LET OP: Chloroform-oplosmiddel moet in een geschikte ventilatiekap worden gehanteerd. Alle oplosmiddelen die in contact komen met chloroform moeten worden behandeld als gehalogeneerd afval wanneer ze worden verwijderd.
  2. Doseer snel 300 μL water rechtstreeks in het midden van de injectieflacon. Sluit de injectieflacon af. Laat het monster 1 minuut ongestoord op de benchtop zitten.
    OPMERKING: De oplossing ziet er onmiddellijk troebel wit uit. Vermijd het mengen van de injectieflacon na toevoeging van water.
  3. Plaats de injectieflacon PP in een centrifuge en draai gedurende minimaal 5 minuten (10.000 x g of hoger bij kamertemperatuur).
    OPMERKING: Eenmaal gecentrifugeerd, zullen zich twee zichtbare oplosmiddellagen vormen (bovenste laag = methanol / water; bodem = chloroform). Een vaste eiwitkorrel vormt zich op het oplosmiddelenoppervlak (figuur 2A).
  4. Gebruik een grote (1 ml) micropipettepunt en houd de injectieflacon op ~45° en verwijder ~700 μL van het oplosmiddel uit de bovenste laag met een uniforme snelheid.
  5. Gebruik een kleinere (200 μL) micropipettepunt om door te gaan met het verwijderen van de bovenste oplosmiddellaag uit de ~45° gekantelde injectieflacon. Pipetteer in één continue beweging totdat de bovenste oplosmiddellaag een kraal vormt in de injectieflacon.
  6. Voeg 400 μL verse methanol toe aan de monsterflacon, zonder de pellet te verstoren, door het oplosmiddel langs de zijkant van de injectieflacon af te geven.
  7. Sluit de injectieflacon af. Combineer de oplosmiddellagen door de injectieflacon voorzichtig te wiegen om de oplosmiddelen samen te draaien.
    OPMERKING: Het is essentieel om te voorkomen dat de pellet wordt verstoord. Draai de injectieflacon niet vortex.
  8. Let op de oriëntatie van de injectieflacon in de rotor, centrifugeer gedurende minimaal 10 minuten (10.000 x g bij kamertemperatuur). De eiwitpellet hecht zich aan de onderkant van de injectieflacon (figuur 2B).
  9. Zet de injectieflacon op 45°, met de pellet naar beneden gericht. Plaats de pipetpunt langs de bovenrand van de injectieflacon en verwijder het supernatant met een micropipettepunt van 1 ml met een langzame maar continue snelheid. Houd ~20 μL oplosmiddel in de injectieflacon.
  10. Was de eiwitkorrel voor SDS-bevattende monsters door langzaam 400 μL verse methanol af te geven. Draai de injectieflacon niet vortex.
    1. Ga direct verder met centrifugatie (10.000 x g gedurende 2 minuten bij temperatuur) en plaats de injectieflacon in de rotor met dezelfde oriëntatie als de initiële spin.
  11. Verwijder het oplosmiddel volgens stap 4.9. Laat het monster in een rookkap aan de lucht drogen totdat het resterende oplosmiddel verdampt.
  12. Raadpleeg de aanbevolen resolubilisatieprocedures in stap 6.

5. Eiwitprecipitatie met behulp van een wegwerpfiltratiepatroon

OPMERKING: Elk op oplosmiddelen gebaseerd precipitatieprotocol dat in stap 2-5 wordt beschreven, kan worden uitgevoerd in een tweetrapsfiltratie- en extractiepatroon (zie Materiaaltabel).

  1. Met de plug bevestigd aan de bovenste filtratiecartridge (figuur 3A), doseer het gewenste volume van het geëxtraheerde proteoom, zout en oplosmiddel zoals beschreven in een van de drie onderstaande opties.
    1. (Optie 1) Voor eiwitprecipitatie met aceton combineert u 90 μL eiwit of proteoomoplossing, 10 μL 1 M waterige NaCl en 400 μL aceton. Incubeer minimaal 2 minuten op de benchtop.
      OPMERKING: Er zal een zichtbaar neerslag ontstaan voor geconcentreerde eiwitmonsters (1 g/l) (figuur 3B).
    2. (Optie 2) Combineer voor LMW-peptideprecipitatie 15 μL van het monster, 1,5 μL 1 M ZnSO4 en 485 μL aceton. Incubeer minimaal 2 minuten op de benchtop.
      OPMERKING: Een zoutconcentratie van 90 mM in het waterige monster heeft geen invloed op de terugwinning ten opzichte van de in stap 3 aanbevolen 100 mM.
    3. (Optie 3) Voeg voor CMW-precipitatie 50 μL proteoomextract, 200 μL methanol en 50 μL chloroform toe. Sluit de injectieflacon af en vortex kort om te combineren.
      1. Doseer snel 150 μL water rechtstreeks in het midden van de injectieflacon. Incubeer gedurende 1 minuut op de benchtop.
  2. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 2.500 x g bij kamertemperatuur met de plug nog steeds bevestigd aan de filtratiepatroon.
  3. Keer de cartridge om en schroef de stekker uit de cartridgebasis en verwijder deze.
  4. Plaats de filtratiepatroon in een schone injectieflacon en keer terug naar de centrifuge. Draai gedurende 3 minuten bij 500 x g bij kamertemperatuur. Gooi het doorstroomoplosmiddel uit de onderste injectieflacon weg.
    OPMERKING: Als er een oplosmiddel achterblijft in de bovenste filtratiepatroon, keer dan terug naar de centrifuge en voer een extra spin uit.
  5. Was de eiwitpellet door 400 μL aceton aan de filtratiepatroon toe te voegen (voor CMW-precipitatie, stap 5.1.3, voeg 400 μL methanol toe).
  6. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 500 x g bij kamertemperatuur of totdat er geen oplosmiddel in de bovenste patroon achterblijft.
  7. Verzacht de neerslagkorrel opnieuw zoals beschreven in stap 6.

6. Resolubilisatie van eiwitpellet

  1. Maak het membraan aan de basis van de filtratiepatroon nat door 2-5 μL isopropanol rechtstreeks op het membraan af te geven onmiddellijk vóór de hieronder beschreven resolubilisatieprotocollen.
  2. Volg een van de volgende resolubilisatiemethoden.
    1. (Optie 1) Voeg minimaal 20 μL waterige buffer met ≥ 2% SDS toe aan de filtratiecartridge. Dop en vortex krachtig (~1 min). U kunt ook ultrasoonapparaat (>10 min) om de eiwitpellet te dispergeren.
      1. Verwarm het monster gedurende 5 minuten op 95 °C). Herhaal de mengstap na het verwarmen.
        OPMERKING: Laemmli gel laadbuffer kan de eiwitkorrel opnieuw oplossen. SDS-bevattende monsters zijn echter onverenigbaar met trypsinevertering en omgekeerde fase LC en MS.
    2. (Optie 2) Bereid een oplossing van 80% (v/v) mierenzuur in water. Prechill de zure oplossing (-20 °C), evenals de filtratiepatroon met neergeslagen eiwit.
      1. Doseer 50 μL koud mierenzuur in de patroon; dop en vortex gedurende 30 s. Terug naar de vriezer (-20 °C) gedurende 10 min.
      2. Vortex de cartridge opnieuw voor 30 s. Herhaal vervolgens de koel- en mengcyclus nog een keer (10 min, -20 °C, 30 s vortex).
      3. Voeg water toe aan een laatste 500 μL en verdun het mierenzuur tot 8%.
        OPMERKING: Het koude mierenzuurprotocol is onverenigbaar met de daaropvolgende trypsinevertering, maar is compatibel met LC-MS.
    3. (Optie 3) Voeg 50 μL vers bereid 8 M ureum in water toe aan de filterpatroon. Soniceer gedurende 30 minuten.
      1. Laat de patroon 1 uur (tot een nacht) incuberen op de benchtop.
      2. Verdun het ureum van 8 M minimaal 5 keer met water of een geschikte buffer.
        OPMERKING: Eenmaal verdund, is het ureumoplosbaarheidsprotocol compatibel met de daaropvolgende trypsinevertering, evenals LC-MS.

7. Eiwitvertering

  1. Voor bottom-up MS-analyse, onderwerp de opnieuw opgeloste eiwitten aan enzymatische spijsvertering met behulp van een van de twee onderstaande methoden.
    1. (Optie 1) Voor mierenzuurrelubilisatie verlaagt u het initiële volume van 80% mierenzuur in stap 6.2.2.1 tot 25 μL. Gebruik in stap 6.2.2.3 3 375 μL water om het mierenzuur te verdunnen tot 5% (v/v).
    2. Doseer pepsine in de patroon met een geschatte eiwit-enzymverhouding van 50:1. Met een plug bevestigd aan de filtratiecartridge, incubeer het monster 's nachts bij kamertemperatuur.
  2. (Optie 2) Voor resolubilisatie in ureum moet u zorgen voor een pH tussen 8 en 8,3 met inbegrip van 100 mM Tris of ammoniumbicarbonaat in stap 6.2.3.2.
    1. Voeg trypsine toe bij een geschatte verhouding tussen eiwit en enzymmassa van 50:1. Met een plug die aan de patroon is bevestigd, incubeer het monster een nacht in een warmwaterbad bij 37 °C.
    2. Beëindig de spijsvertering door de oplossing met 10% TFA te verzuren tot een laatste 1%.
  3. Herstel het pepsine- of trypsine-verteerde eiwit door de plug van de basis van het filter te verwijderen en de patroon in een schone injectieflacon (2 min, 5000 x g, kamertemperatuur) te centrificeren.

8. SPE opruimen

OPMERKING: Voor extra monsterontzouting na vertering of oplosmiddeluitwisseling kan het monster worden onderworpen aan omgekeerde fasereiniging zoals beschreven.

  1. Primeer een SPE-patroon (zie materiaaltabel) door 300 μL methanol (2 min, 400 x g) door te geven, gevolgd door 300 μL 5% acetonitril/0,1% TFA (2 min, 400 x g).
  2. Sluit de geprimeerde SPE-cartridge aan op de basis van de filtratiecartridge met opnieuw opgelost of verteerd eiwit.
  3. Spin het eiwit door de SPE cartridge (5 min, 800 x g bij kamertemperatuur). Als er oplosmiddel in de bovenste patroon achterblijft, brengt u de patroon terug naar de centrifuge en herhaalt u de centrifuge.
    OPMERKING: Als u het monster een tweede keer door de SPE-cartridge laat gaan, kan het herstel worden verbeterd.
  4. Voeg 300 μL 5% acetonitril/0,1% TFA in water toe aan de patroon. Om te wassen, stroomt u door de SPE-cartridge (2 min, 2000 x g). Gooi de doorstroom weg.
  5. Voor LMW-eiwitten of verteerde peptiden elueert u het monster door 300 μL 50% acetonitril / 0,1% TFA (5 min, 2500 x g) te laten stromen.
  6. Volg voor intacte eiwitten stap 8,5 met een extra elutiestap met 300 μL van 75% acetonitril/0,1% TFA. Combineer de twee resulterende extracten.
    OPMERKING: Stap 8.6 is optioneel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 4 geeft een overzicht van de verwachte SDS-uitputting na injectieflacongebaseerde of patroongefaciliteerde precipitatie van eiwitten in een wegwerpfilterpatroon met behulp van aceton. Conventionele nachtelijke incubatie (-20 °C) in aceton wordt vergeleken met het snelle acetonprecipitatieprotocol bij kamertemperatuur (stap 2), evenals CMW-neerslag (stap 4). Residueel SDS werd gekwantificeerd door de methyleenblauwactieve stoffen (MBAS) assay29. In het kort werd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optimale MS-karakterisering wordt bereikt wanneer het resterende SDS onder 10 ppm wordt uitgeput. Terwijl alternatieve benaderingen, zoals FASP en on-bead digestion, kwantitatieve SDS-uitputting bieden met variabel herstel 31,32,33, is het primaire doel van neerslag om de zuiverheid en opbrengst tegelijkertijd te maximaliseren. Dit hangt af van het effectief isoleren van het supernatant (dat de SDS bevat) zonder de eiwitkorrel t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het Doucette-laboratorium bedacht en patenteerde de ProTrap XG die in deze studie werd gebruikt. AAD is ook een van de oprichters van Proteoform Scientific, dat de monstervoorbereidingscartridge op de markt bracht.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. De auteurs bedanken Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) en SPARC BioCentre (Molecular Analysis) van het Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) voor hun bijdragen aan de verwerving van MS-gegevens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AcetonFisher ScientificAC177170010≤0,002 % aldehyde
AcetonitrilFisher ScientificA998-4HPLC-kwaliteit
AmmoniumbicarbonaatMillipore SigmaA6141-1KGvast
Bèta mercaptoethanolMillipore SigmaM3148-25MLMoleculaire biologie kwaliteit
BromofenolblauwMillipore SigmaB8026-5GBromofenolblauw natriumzout
ChloroformFisher ScientificC298-400Chloroform
ForminezuurHoneywell56302Eluentadditief voor LC-MS
Fusion Lumos Mass SpectrometerThermoFisher Scientificvoor analyse van standaard eiwitmengsel
GlycerolMillipore Sigma356352-1L-MVoor moleculaire biologie, > 99%
IsopropanolFisher ScientificA4641HPLC-kwaliteit
MethanolFisher ScientificA452SK-4HPLC-kwaliteit
MicrocentrifugeFisher Scientific75-400-102tot 21.000 xg
Microcentrifugebuisje (1,5 ml)Fisher Scientific05-408-130conische bodem
Microcentrifugebuisje (2 ml)Fisher Scientific02-681-321afgeronde bodem
Micropipettipjes (0,1-10 µL)Fisher Scientific21-197-28Universele pipettip, niet-steriel
Micropipettipjes (1-200 µL)Fisher Scientific07-200-302Universele pipettip, niet-steriel
Micropipettipjes (200-1000 µL)Fisher Scientific07-200-303Universele pipettip, niet-steriel
MicropipettenFisher Scientific13-710-903Micropipet Trio-pakket
PepsineMillipore SigmaP0525000Gelyofiliseerd poeder, >3200 eenheden/ mg
ProTrap XGProteoform ScientificPXG-000250 complete eenheden per doos
NatriumchlorideMillipore SigmaS9888-1KGACS-reagens, >99 %
NatriumdodecylsulfaatThermoFisher Scientific28312poedervormige vaste stof
timsTOF Pro Mass SpectrometerBrukervoor analyse van leverproteoomextract
TrifluorazijnzuurThermoFisher ScientificL06374.AP99%
TrisFisher ScientificBP152-500Moleculaire biologie kwaliteit
TrypsineMillipore Sigma9002-07-7Uit runderspeuzen, TPCK-behandeld
UreaBio-Rad1610731vast
Water (de-ioniseerde)Sartorius Arium Mini Waterzuiveringssysteem76307-662Type 1 ultrapuur (18,2 MΩ cm)
ZinksulfaatMillipore Sigma307491-100Gvast

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
  3. Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
  4. Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
  5. Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
  6. Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
  7. Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
  8. Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318(2021).
  9. Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856(2021).
  10. Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524(2020).
  11. Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051(2021).
  12. Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
  13. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
  14. Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  15. Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
  16. Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
  17. Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757(2014).
  18. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  19. Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
  20. Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
  21. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
  22. Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
  23. Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
  24. Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
  25. Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
  26. Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
  27. Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
  28. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  29. Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
  30. Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, at http://www.jstor.org/stable/2529486 768(1977).
  31. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  32. Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
  33. Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983(2021).
  34. Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
  35. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  36. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  37. Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
  38. Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
  39. Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
  40. Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
  41. Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
  42. Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
  43. Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
  44. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  45. Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
  46. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Precipitatie met organische oplosmiddelenacetonprecipitatiechloroform methanolprecipitatiespin cartridgeSDS verwijderingbottom up proteomicseiwitherstel

Gerelateerde artikelen