Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van energiesubstraatoxidatie in vitro met 14CO2-vangst

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63568

⸱

23 maart 2022

 ,  , 
1Translational Research Program of Pediatric Orthopedics, Department of Surgery, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Orthopedic Surgery, Tongji Hospital, Huazhong University of Science and Technology

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een eenvoudig te gebruiken methode om substraatoxidatie te onderzoeken door 14CO2-productie in vitro te volgen.

Samenvatting

Mitochondriën herbergen de machines voor de tricarbonzuur (TCA) cyclus en elektronentransportketen (ETC), die adenosinetrifosfaat (ATP) genereren om de energiehomeostase te behouden. Glucose, vetzuren en aminozuren zijn de belangrijkste energiesubstraten die mitochondriale ademhaling in de meeste somatische cellen voeden. Er zijn aanwijzingen dat verschillende celtypen een duidelijke voorkeur kunnen hebben voor bepaalde substraten. Substraatgebruik door verschillende cellen in het skelet is echter niet in detail bestudeerd. Bovendien, aangezien het cellulaire metabolisme is afgestemd op fysiologische en pathofysiologische veranderingen, kunnen directe beoordelingen van substraatafhankelijkheid in skeletcellen belangrijke inzichten verschaffen in de pathogenese van botziekten.

Het volgende protocol is gebaseerd op het principe van kooldioxide-afgifte uit substraatmoleculen na oxidatieve fosforylering. Door substraten te gebruiken die radioactief gelabelde koolstofatomen (14C) bevatten, biedt de methode een gevoelige en eenvoudig te gebruiken test voor de snelheid van substraatoxidatie in celkweek. Een casestudy met primaire calvariale preosteoblasten versus beenmerg-afgeleide macrofagen (BMM's) toont een verschillend gebruik van de belangrijkste substraten tussen de twee celtypen.

Inleiding

Oxidatieve fosforylering (OXPHOS) in eukaryoten is het proces waarbij voedingsstoffen worden afgebroken in mitochondriën om chemische energie vrij te maken in de vorm van ATP door zuurstofverbruik.  Katabolisme van verschillende substraten in mitochondriën via de tricarbonzuur (TCA) cyclus genereert weinig ATP-moleculen direct, maar slaat eerder energie op door reductie van de elektronendragers nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +) en flavine adenine dinucleotide (FAD +). De gereduceerde dragers worden vervolgens geoxideerd door ETC op het binnenmembraan van mitochondriën om een protonconcentratiegradiënt over het membraan te genereren. De protonen stromen uiteindelijk hun gradiënt terug naar de mitochondriale matrix via ATP-synthase om ATP te produceren. OXPHOS is de meest efficiënte manier van ATP-productie uit energiesubstraten en heeft over het algemeen de voorkeur in aerobe omgevingen. Eerder werd gedacht dat aerobe glycolyse - productie van lactaat uit glucose terwijl zuurstof aanwezig is - pathofysiologisch was, vaak een kenmerk van kankercellen. Meer en meer wordt ontdekt dat sommige normale celtypen aerobe glycolyse gebruiken om redenen die nog niet volledig zijn ontcijferd.

Metabole flexibiliteit is het vermogen van cellen of organismen om zich aan te passen aan veranderende energiebehoeften en beschikbare brandstofbronnen. Aan de energetische vraag naar skeletspieren wordt bijvoorbeeld voornamelijk voldaan door OXPHOS in steady state, maar door anaerobe glycolyse tijdens intensieve training1. Naarmate de inspanningsduur toeneemt, dragen glucose- en vetzuuroxidatie meer bij aan de algehele energieproductie2. Substraatgebruik is echter niet alleen afhankelijk van beschikbaarheid, omdat substraten antagonistisch concurreren tijdens oxidatie. Met name is aangetoond dat vetzuuroxidatie het glucosegebruik door skeletspieren remt in een fenomeen dat bekend staat als het Randle-effect3. Een wederkerig effect werd aangetoond door latere studies 4,5. Bovendien worden veel ziekten geassocieerd met een verandering in substraatvoorkeur en de ontwikkeling van metabole inflexibiliteit in cellen. Vetzuuroxidatie is bijvoorbeeld verminderd in de skeletspieren van type II diabetespatiënten in vergelijking met normale controlepersonen6. De metabole veranderingen in ziekte-instellingen zijn een onderwerp van intensief onderzoek omdat ze kunnen bijdragen aan de pathogenese.

Het energiemetabolisme in skeletceltypen is relatief onderbelicht, maar heeft de laatste jaren aandacht gekregen7. Eerder werk heeft aangetoond dat aerobe glycolyse de dominante energieroute is in calvariale osteoblasten, terwijl glucose-oxidatie via de TCA-cyclus een rol speelt bij osteoclastenvorming 8,9. Anderen hebben bewijs geleverd voor vetzuren als energiebron voor osteoblasten10. Glutaminekatabolisme heeft ook aangetoond dat het osteoblastdifferentiatie van de voorlopersondersteunt 11,12. Een uitgebreid begrip van substraatgebruik door verschillende skeletceltypen ontbreekt echter nog steeds. Bovendien wordt verwacht dat veranderingen in het cellulaire metabolisme tijdens celdifferentiatie of als reactie op pathologische signalen het gebruik van brandstofsubstraat zullen veranderen. Hieronder wordt een eenvoudig te gebruiken protocol beschreven voor het testen van substraatoxidatie in vitro.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het gebruik van radioactieve materialen (RAM) vereist voorafgaande goedkeuring door een aangewezen veiligheidscomité bij elke instelling. RAMs die in dit protocol worden gebruikt, zijn goedgekeurd door Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) aan de Universiteit van Pennsylvania. Het gebruik van dieren vereist voorafgaande goedkeuring door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in de thuisinstelling. De volgende studie werd goedgekeurd door IACUC in het Children's Hospital van Philadelphia.

1. Bereiding van stamoplossingen voor 14C-gelabelde substraten

  1. Maak 4 mM runderserumalbumine (BSA) stamoplossing door 11 g BSA en 33,1 ml Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) te mengen en voorzichtig te schudden bij kamertemperatuur gedurende ~ 3 uur totdat BSA volledig is opgelost. Verwarm de BSA-stamoplossing voor gebruik in een waterbad van 70 °C.
  2. Droog 50 μCi 14C-oleaat (50 μCi/μmol in ethanol) aan de lucht in de injectieflacon met het deksel er gedurende 8 uur af in een speciale RAM-werkkap. Voeg 312,5 μl H2O en vervolgens 3,5 mg (11,5 μmol) natriumoleaat toe. Meng.
  3. Verwarm de resulterende oplossing tot 70 °C in een waterbad. Voeg 0,9375 ml van de voorgewarmde BSA-stamoplossing toe tot een 10 mM hot oleate stock-oplossing (met een verhouding van 1:11,5 van 14C-oleaat tot ongelabeld oleaat). Vul de stamoplossing toe en bewaar deze bij -20 °C voor langdurig gebruik.
  4. Gebruik 14C-glucose en 14C-glutamine direct na het ontdooien.

2. Bereiding van medium dat 14C-gelabelde substraten bevat

OPMERKING: Om betrouwbare concentraties van energiesubstraten in de media te garanderen, moeten op maat gemaakte media worden gebruikt met verse substraten die kort voor gebruik worden toegevoegd. Hier wordt een op maat gemaakt Minimum Essential Medium (MEMα) zonder glucose, pyruvaat, glutamine, fenolrood of natriumbicarbonaat gebruikt. Voor elk celtype moet echter een optimaal medium worden bepaald.

  1. Reconstitueer 8,67 g van het medium poeder in 1 L gezuiverd water. Voeg 2,2 g natriumbicarbonaat toe om een pH van 7,4 te bereiken en filtreer de oplossing met behulp van vacuümfiltratie van 0,22 μm.
  2. Voeg verse ingrediënten toe om het volledige medium (cMEMα) te verkrijgen met eindconcentraties van 5,5 mM glucose, 2 mM glutamine, 1 mM pyruvaat en 10% foetaal runderserum (FBS). Verder supplement cMEMα met 100 mM L-carnitine en 10 μM HEPES om vetzuuroxidatie te vergemakkelijken.
  3. Voeg vlak voor gebruik 14C-gelabelde substraten toe aan vers bereide cMEMα om hete media te maken. Om het oleaathete medium te maken, voegt u de 10 mM hete oleaatvoorraadoplossing toe aan cMEMα voor een eindconcentratie van 100 μM oleaat (1:100 verdunning, uiteindelijke radioactiviteit 0,4 μCi/ml).
    OPMERKING: De 10 mM hete oleaatvoorraad met een verhouding van 1:11,5 warm:koud oleaat (zie stap 1.3) wordt gebruikt om een fysiologisch niveau van 100 μM totaal oleaat in de media te bereiken en tegelijkertijd de hoeveelheid radioactief materiaal te minimaliseren.
  4. Maak 10 mM ongelabelde oleaatbouillon door 24,36 mg natriumoleaat toe te voegen aan 2 ml H2O in een waterbad bij 70 °C gedurende ~ 20 minuten totdat het volledig is opgelost voordat het snel wordt gemengd met 6 ml van de 4 mM BSA-stamoplossing voorgewarmd tot 70 °C. Breng gedurende 1 uur over in een waterbad van 37 °C en filtreer door een filter van 0,22 μm. Aliquot en bewaren bij -20 °C voor langdurig gebruik.
  5. Om glucose heet medium te maken, voegt u 14C-glucose toe aan een eindconcentratie van 1,333 μM (1:4.125 verdunning, uiteindelijke radioactiviteit 0,4 μCi/ml). Om glutamine heet medium te maken, voegt u 14C-glutamine toe aan de eindconcentratie van 2 μM (1:1.000 verdunning, uiteindelijke radioactiviteit 0,4 μCi/ml).
  6. Vul het glucose- en glutaminehete medium aan met een 10 mM stockoplossing van ongelabeld oleaat uit stap 2.4 om de uiteindelijke concentratie van 100 μM oleaat te bereiken, dezelfde als die in het oleaathete medium.

3. Bereiding van cellen

OPMERKING: Calvariale preosteoblasten en beenmergmacrofagen worden hier als voorbeelden gebruikt. Gebruikers moeten hun celtype naar keuze voorbereiden volgens de juiste protocollen. Optimaliseer de concentratie van collagenase II voor gebruik voor de spijsvertering in proefexperimenten, omdat de enzymatische activiteit tussen verschillende partijen kan variëren.

  1. Isolatie en cultuur van calvariale preosteoblasten
    1. Offer postnatale dag 3-5 (P3-5) pups door onthoofding en breng ze over naar ijskoude DPBS met penicilline-streptomycine (P / S).
    2. Stel de calvaria bloot door de huid en het zachte weefsel te verwijderen. Verzamel het middelste gebied door de omliggende weefsels van achter naar voren weg te snijden in DPBS (figuur 1A). Kras de binnen- en buitenoppervlakken van de calvaria voorzichtig met een pincet om de cellen vrij te maken bij de daaropvolgende spijsvertering.
    3. Bereid een 2 mg/ml en een 4 mg/ml oplossing van Collagenase type II in DPBS en filtreer elke oplossing met een vers filter van 0,22 μm. Verteer de gereinigde calvaria eerst met de 2 mg/ml collagenase-oplossing gedurende 15 minuten en gooi de digestieoplossing weg. Verteer de gereinigde monsters in 4 mg / ml collagenase-oplossing 3 keer gedurende 15 minuten per keer, bundel en bewaar de verteringsoplossing.
    4. Filtreer de digestieoplossing door 70 μm cel strainers en centrifugeer het filtraat bij 300 × g gedurende 5 minuten. Resuspend de celkorrel in cMEMα (zie stap 2.2) met 10% FBS en P/S.
    5. Tel en zaai de cellen op 4 × 104 cellen/cm2 in 10 cm platen. Kweek de cellen in een incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende 3 dagen.
    6. Dissocieer de cellen bij 37 °C met 0,25% trypsine-EDTA. Tel en zaai de cellen in 24-well celkweekplaten met cMEMα die 10% FBS en P/S bevatten bij 7,5 × 105/cm2. Zaai ten minste 4 putjes per celtype per substraat en minstens drie extra putjes voor elk celtype voor celtelling vóór de test.
    7. Kweek de cellen bij 37 °C 's nachts vóór de oxidatietests van het substraat.
  2. Isolatie en cultuur van BMM's
    OPMERKING: Cultuur van BMM's vereist macrofaag koloniestimulerende factor (M-CSF), die commercieel kan worden gekocht als een recombinant eiwit. Geconditioneerd medium uit de cellijn CMG14-12 ontworpen om M-CSF uit te drukken is een economisch alternatief dat hier wordt gebruikt13.
    1. Verzamel dijbenen en tibia's van 8 weken oude muizen na het verwijderen van de spier en bindweefsels. Knip en gooi beide uiteinden van de botten weg met een scherpe schaar.
    2. Spoel het beenmerg uit één dijbeen en één scheenbeen in een petrischaaltje van 10 cm met een spuit voorzien van een naald van 23 G met 15 ml cMEMα met 10% FBS, P/S en 10% CMG14-12 geconditioneerd medium (BMM-medium). Kweek de cellen in de petrischaal in een incubator van 37 °C met 5% CO2.
    3. Gooi na 3 dagen de kweekmedia weg en spoel af met DPBS. Dissocieer de aangehechte cellen bij 37 °C met 0,25% trypsine-EDTA gedurende 5 minuten. Centrifugeer en resuspend de celkorrel in het BMM-medium.
    4. Tel en zaai de cellen in 24-well celkweekplaten op 7,5 × 105/cm2 op dezelfde manier als beschreven in 3.1.6. Kweek bij 37 °C 's nachts in het BMM-medium voordat met de testen wordt begonnen.

4. Substraatoxidatietest met CO2-val

OPMERKING: Voor elk celtype moet een geschikte zaaidichtheid worden bepaald om 80-90% samenvloeiing te bereiken vóór het begin van de test. Merk op dat celdichtheid de metabole toestand van de cellen kan beïnvloeden.

  1. Was de cellen in de extra putjes twee keer met DPBS. Dissociëer de cellen met 0,25% trypsine-EDTA en gemengde 20 μL cellen geresuspendeerd in DPBS met 20 μL acridine sinaasappel/propidiumjodide (AO/PI) kant-en-klare commerciële kleurstofoplossing. Bepaal het aantal levende cellen met een geautomatiseerde celteller en noteer het aantal voor de uiteindelijke berekeningen.
  2. Was de cellen in de testputten tweemaal met DPBS. Voeg 500 μL heet medium toe aan elke testput in de door RAM aangewezen weefselkweekkap. Sluit de platen af met parafilm en incubeer de cellen in een door RAM aangewezen incubator bij 37 °C gedurende 4 uur.
  3. Snijd tijdens de incubatie het filtreerpapier in cirkelvormige stukken die iets groter zijn dan het gebied in de dop van microcentrifugebuizen van 1,5 ml en steek het papier goed in de dop (figuur 1B). Voeg 200 μL 1 M perchloorzuur toe aan elke buis en 20 μL natriumhydroxide aan het filtreerpapier dat in de dop is aangebracht.
  4. Breng na incubatie van de cellen 400 μL kweekmedium van elke put over naar de voorbereide buizen en sluit de doppen onmiddellijk. Laat de buizen gedurende 1 uur in een buizenrek op kamertemperatuur.
  5. Stel tijdens de incubatie een scintillatieflacon in voor elke buis en vul deze met 4 ml scintillatievloeistof. Breng elk stuk filtreerpapier over in een injectieflacon met scintillatie en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Voer veegtests uit op de weefselkweekkap, het waterbad (gebruikt voor 14C-oleaatbereiding), koelkast, incubator, gootsteen, grond en elk ander werkgebied voor mogelijke RAM-verontreiniging. Doe de papieren doekjes in scintillatieflacons met scintillatievloeistof.
  7. Meet 14C radioactiviteit in de scintillatieflacons met een scintillatieteller. Noteer de leesresultaten. Ontsmet de werkomgeving indien nodig volgens de richtlijnen voor stralingsveiligheid.

5. Data-analyse

OPMERKING: Ervan uitgaande dat elk substraat volledig is geoxideerd om CO2 vrij te maken, kan de oxidatiesnelheid van het substraat worden berekend op basis van de opgesloten CO2-radioactiviteit .

  1. Bereken de oxidatiesnelheid van het substraat met behulp van Eq (1) en de X-, Y- en Z-waarden in tabel 1 voor verschillende substraten.
    Substraat oxidatiesnelheid (μmol/cel/h) = figure-protocol-1   (1)
    1. Bereken de totale desintegraties per min (DPM) voor elke reactie goed. Gebruik voor X de DPM-waarde (scintillatietelleraflezing) van 0,4 ml van het reactiemedium dat wordt gebruikt voor CO2-opvang van 0,5 ml van het totale reactiemedium. Daarom is de totale DPM van elke reactieput X × 1,25.
    2. Deel de totale DPM door een factor 2.220.000 om te converteren naar μCi.
    3. Converteer de radioactiviteit in μCi naar het aantal van 14C-gelabelde moleculen. Deel de μCi-waarde door de specifieke activiteit (Y) van elk gelabeld substraat. Gebruik de volgende Y-waarden (tabel 1): 14C-glucose: 300 mCi/mmol; 14 C-glutamine: 200 mCi/mmol; 14 C-oleaat: 50 mCi/mmol.
    4. Bereken het totale aantal geoxideerde moleculen van de geoxideerde 14C-gelabelde moleculen door deze laatste te vermenigvuldigen met de hot-to-total verdunningsfactor (Z). Gebruik de volgende Z-waarden (tabel 1): Glucose: 4.125; glutamine: 1.000; oleaat: 12,5.
    5. Deel het resulterende product door het celnummer (cel#) en 4 (voor de reactietijd van 4 uur) om de oxidatiesnelheid van het substraat per cel te bepalen. Gebruik de cel# bepaald in de parallelle putjes aan het begin van de test.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit voorbeeld wordt de CO 2-vangmethode gebruikt om substraatoxidatie door primaire calvariale preosteoblasten te vergelijken met BMM's, die vaak worden gebruikt voor respectievelijk in vitro osteoblasten- of osteoclastendifferentiatie. Nadat de primaire cellen 's nachts in cMEMα zijn gepasseerd en gekweekt, bereiken ze meestal 80-90% van de samenvloeiing en vertonen ze hun karakteristieke morfologie. De calvariale preosteoblasten zijn opvallend groter dan BMM's (figuur 2

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol biedt een eenvoudig te gebruiken methode om de oxidatiesnelheid van belangrijke energiesubstraten te bepalen. Het is een eenvoudiger alternatief voor andere protocollen die kolven gebruiken die een centrale put bevatten en afgedekt zijn met rubberen stoppen 14,15,16. Hoewel de voorbeeldstudie hier wordt uitgevoerd met celkweek, kan de methode gemakkelijk worden aangepast voor weefselexplantaten of weefselhomogenaten...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Dankbetuigingen

Het werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidie R01 AR060456 (FL). We bedanken Dr. Michael Robinson en Elizabeth Krizman (The Children's Hospital of Philadelphia) voor hun genereuze hulp bij de sprankelende teller.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 µm filtersSigma-AldrichSLGVM33RSWorden gebruikt om BSA-oplossing te filteren
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200056Dissociëren van cellen van celkweekplaten
1.5 mL Eppendorf tubesPR1MAPR MCT17 RBWorden gebruikt voor reactie-incubatie
10 cm platesTPP93100Worden gebruikt voor celkweek
10 mL syringeBD302995Worden gebruikt om beenmerg uit lange botten te spoelen
10% FBSAtlanta biologicalsS11550Voor de bereiding van celkweekmedium
14C-GlucosePerkinElmerNEC042X050UCWorden gebruikt om heet medium te maken
14C-glutaminePerkinElmerNEC451050UCWorden gebruikt om heet medium te maken
14C-oleaatPerkinElmerNEC317050UCWorden gebruikt om heet medium te maken
23 G naaldBD305120Worden gebruikt om beenmerg uit lange botten te spoelen
24-well platesTPP92024Worden gebruikt voor celkweek
70 μm celstrainersMIDSCI70CELLWorden gebruikt om supernatant te filteren tijdens cavariale vertering
Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) kleurstofNexcelom BiosciencesCS2-0106Kleurt levende cellen om de zaaddichtheid te bepalen
Bovine Serum AbluminProliant Biologicals68700Worden gebruikt voor vetzuurconjugatie
Cellometer Auto 2000Nexcelom BiosciencesBepaalt het aantal levensvatbare cellen
CentrifugeThermo FisherLegend Micro 21RWorden gebruikt om cellen te pellen
Collageenase type IIWorthingtonLS004176Dissociëren van cellen uit weefsel
Custom MEM alphaGIBCOSKU: ME 18459P1Worden gebruikt om aangepast heet medium te maken
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineGibco10010023Worden gebruikt om reagentia op te lossen en te verdunnen, en kweekschalen te wassen
FilterpapierMillipore-SigmaWHA1001090Vang CO2 met natriumhydroxide
GlucoseSigma-Aldrichg7528Worden gebruikt om aangepast medium te maken
HEPESGibco15630080Vang CO2 tijdens celkweek
L-carnitineSigma-AldrichC0283Aangevuld voor vetzuuroxidatie
L-GlutamineSigma-Aldrichg3126Worden gebruikt om aangepast medium te maken
MEM alphaThermoA10490Celkweekmedium
ParafilmPecheney Plastic PackagingPM998Worden gebruikt om celkweekschalen te verzegelen
Penicilline-StreptomycineThermo Fisher15140122Voorkomt besmetting in celkweek
PerchlorazuurSigma-Aldrich244252Geeft CO2 vrij tijdens metabolisch onderzoek
PyrofeenzuurSigma-Aldrichp5280Worden gebruikt om aangepast medium te maken
ScintillatietellerBeckman CoulterLS6500Bepaalt de radioactiviteit van het filterpapier
ScintillatievloeistofMP Biomedicals882453Absorbeert de energie die wordt uitgezonden door RAM's en geeft deze opnieuw uit als lichtflitsen
ScintillatieglasFisher Scientific03-337-1Reactiecontainers voor scintillatievloeistof
NatriumcarbonaatSigma-AldrichS5761Balansbuffer voor medium
NatriumhydroxideSigma-Aldrich58045Vang CO2 tijdens metabole bepaling
NatriumoleaatSANTA CRUZSC-215879BSA-geconjugeerd vetzuurpreparaat
Vacuumfiltratie 1000TPP99950Filter cMEMα

Referenties

  1. Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
  2. Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
  3. Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
  4. Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
  5. Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
  6. Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
  7. Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
  8. Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
  9. Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108(2020).
  10. Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704(2017).
  11. Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
  12. Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
  13. Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
  14. Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
  15. Oba, M., Baldwin, R. L. 4th, Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
  16. Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
  17. Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
  18. Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
  19. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

CO2-opvangoxidatieve fosforyleringsubstraatbenuttingmitochondriale respiratiecalvariale preosteoblastenbeenmergmacarofagenscintillatietellingcelcultuurassaymetabole flexibiliteit
Beoordeling van energiesubstraatoxidatie in vitro met 14CO2-vangst
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.