Method Article

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

DOI:

10.3791/63606

⸱

May 5th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst hoe een driedimensionaal celkweeksysteem kan worden gebruikt om chromatinemodificaties in een bijna fysiologische toestand te modelleren, behandelen en analyseren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Platte culturen van zoogdiercellen zijn een veel gebruikte in vitro benadering voor het begrijpen van celfysiologie, maar dit systeem is beperkt in het modelleren van vaste weefsels als gevolg van onnatuurlijk snelle celreplicatie. Dit is vooral een uitdaging bij het modelleren van volwassen chromatine, omdat snel replicerende cellen vaak betrokken zijn bij DNA-replicatie en een heterogene polyploïde populatie hebben. Hieronder wordt een workflow gepresenteerd voor het modelleren, behandelen en analyseren van rustige chromatinemodificaties met behulp van een driedimensionaal (3D) celkweeksysteem. Met behulp van dit protocol worden hepatocellulaire carcinoomcellijnen gekweekt als reproduceerbare 3D-sferoïden in een incubator die actieve nutriëntendiffusie en lage schuifkrachten bieden. Behandeling met natriumbutyraat en natriumsuccinaat veroorzaakte respectievelijk een toename van histonacetylering en succinylering. Verhogingen van de niveaus van histonacetylering en succinylering zijn geassocieerd met een meer open chromatinetoestand. Sferoïden worden vervolgens verzameld voor isolatie van celkernen, waaruit histoneiwitten worden geëxtraheerd voor de analyse van hun posttranslationele modificaties. Histonanalyse wordt uitgevoerd via vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie, gevolgd door een interne computationele pijplijn. Ten slotte worden voorbeelden van gegevensrepresentatie getoond om de frequentie en het voorkomen van combinatorische histonmarkeringen te onderzoeken.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinds het einde van de19e eeuw worden celkweeksystemen gebruikt als model om de groei en ontwikkeling van cellen buiten het menselijk lichaam te bestuderen 1,2. Het gebruik ervan is ook uitgebreid om te bestuderen hoe weefsels en organen functioneren in zowel gezonde als zieke contexten 1,3. Suspensiecellen (bijv. bloedcellen) groeien naadloos en uitwisselbaar in petrischalen of kolven omdat ze niet in vivo in driedimensionale (3D) structuren samenkomen. Cellen afgeleid van vaste organen kunnen groeien in tweedimensionale (2D) of 3D-kweeksystemen. In 2D-kweek worden cellen gekweekt in een monolaag die zich hecht aan een plat oppervlak 2,4. 2D-celkweeksystemen worden gekenmerkt door exponentiële groei en een snelle verdubbelingstijd, meestal 24 uur tot enkele dagen5. Cellen in 3D-systemen groeien om ingewikkelde cel-celinteracties te vormen die weefselachtige conglomeraten nauwer modelleren, en ze worden gekenmerkt door hun vermogen om een dynamisch evenwicht te bereiken waarbij hun verdubbelingstijd 1 maand of langer kan bereiken5.

In dit artikel wordt een innovatieve methodologie gepresenteerd om 3D-sferoïden te laten groeien in roterende celkweeksystemen die verminderde zwaartekracht simuleren6. Dit is een vereenvoudigde afgeleide van een celkweeksysteem geïntroduceerd door NASA in de jaren 19907. Deze aanpak minimaliseert schuifkrachten, die optreden in bestaande methoden zoals draaiende kolven, en verhoogt de reproduceerbaarheid van sferoïden6. Bovendien verhoogt de roterende bioreactor de actieve nutriëntendiffusie, waardoor necrotische vorming wordt geminimaliseerd die optreedt in systemen zoals hangende druppelcelkweek waar media-uitwisseling onpraktisch is6. Op deze manier groeien cellen meestal ongestoord, waardoor structurele en fysiologische kenmerken kunnen worden gevormd die verband houden met cellen die in weefsel groeien. C3A-hepatocyten (HepG2/C3A) die op deze manier werden gekweekt, hadden niet alleen ultrastructurele organellen, maar produceerden ook hoeveelheden ATP, adenylaatkinase, ureum en cholesterol die vergelijkbaar waren met de in vivo waargenomen niveaus 1,2. Bovendien vertonen cellen gekweekt in 2D vs.3D celkweeksystemen verschillende genexpressiepatronen8. Genexpressieanalyse van C3A-hepatocyten gekweekt als 3D-sferoïden toonde aan dat deze cellen een breed scala aan leverspecifieke eiwitten tot expressie brachten, evenals genen die betrokken zijn bij belangrijke routes die de leverfunctie reguleren8. Eerdere publicaties toonden de verschillen aan tussen proteomen van exponentieel groeiende cellen in 2D-cultuur versus cellen bij dynamisch evenwicht in 3D-sferoïde culturen5. Deze verschillen omvatten cellulair metabolisme, dat op zijn beurt de structuur, functie en fysiologie van de cel5 beïnvloedt. Het proteoom van cellen gekweekt in 2D-cultuur was meer verrijkt met eiwitten die betrokken zijn bij celreplicatie, terwijl het proteoom van 3D-sferoïden meer verrijkt was in leverfunctionaliteit5.

De langzamere replicatiesnelheid van cellen die groeien naarmate 3D-sferoïden nauwkeuriger modelleren specifieke verschijnselen die verband houden met de chromatinetoestand en modificaties (bijv. Histon clipping9). Histon clipping is een onomkeerbare histon post-translationele modificatie (PTM) die proteolytische splitsing van een deel van de histon N-terminale staart veroorzaakt. Hoewel de biologische functie nog steeds ter discussie staat 10,11,12,13, is het duidelijk dat de aanwezigheid ervan in primaire cellen en leverweefsel wordt gemodelleerd door HepG2 / C3A-cellen gekweekt als sferoïden, maar niet als platte cellen 9. Dit is van cruciaal belang, omdat chromatinetoestand en modificaties de DNA-uitlezing meestal reguleren door de toegankelijkheid van genen en dus hun expressie te moduleren14. Histon PTM's beïnvloeden ofwel de chromatinetoestand direct door de netto lading van de nucleosomen te beïnvloeden waar histonen worden geassembleerd, of indirect door chromatineschrijvers, lezers en gummente werven 14. Honderden histon PTM's zijn geïdentificeerd tot op heden15, wat de hypothese versterkt dat chromatine een "histoncode" herbergt die door de cel wordt gebruikt om DNA16 te interpreteren. De identificatie van een groot aantal PTM-combinaties15 en de ontdekking dat combinaties van histon-PTM's vaak verschillende biologische functies hebben dan PTM's die geïsoleerd aanwezig zijn (bijv. Fischle, et al.17), benadrukt echter dat er meer werk nodig is om de "histoncode" te decoderen.

Momenteel is histon PTM-analyse gebaseerd op technieken die antilichamen gebruiken (bijv. Western blots, immunofluorescentie of chromatine-immunoprecipitatie gevolgd door sequencing [ChIP-seq]) of massaspectrometrie (MS). Op antilichamen gebaseerde technieken hebben een hoge gevoeligheid en kunnen gedetailleerde informatie verschaffen over de genoombrede lokalisatie van histonmarkeringen, maar zijn vaak beperkt in het bestuderen van zeldzame PTM's of PTM's die aanwezig zijn in combinaties 18,19,20. MS is meer geschikt voor high-throughput en onbevooroordeelde identificatie en kwantificering van enkelvoudige en naast elkaar bestaande eiwitmodificaties, met name histoneiwitten 18,19,20. Om deze redenen hebben deze en verschillende andere laboratoria de MS-pijplijn geoptimaliseerd voor de analyse van histonpeptiden (bottom-up MS), intacte histonstaarten (middle-down MS) en histoneiwitten over de volledige lengte (top-down MS)21,22,23.

Hieronder wordt een workflow beschreven voor het kweken van HepG2 / C3A-sferoïden en het voorbereiden ervan op histonpeptide-analyse (bottom-up MS) via nano-vloeistofchromatografie, online gekoppeld aan tandemmassaspectrometrie (nLC-MS / MS). Er werd een 2D-celkweek gekweekt en de cellen werden geoogst en overgebracht naar een bioreactor waar ze sferoïden zouden gaan vormen (figuur 1). Na 18 dagen in cultuur werden sferoïden behandeld met natriumbutyraat of natriumsuccinaat om de relatieve abundanties van histonacetylering en succinylering te verhogen. Met name 3D-culturen kunnen net zo goed worden behandeld met genotoxische verbindingen als hun platte cultuurequivalenten; recente publicaties benadrukken zelfs dat de toxicologische respons van cellen in 3D-cultuur meer lijkt op primaire weefsels dan die in 2D-platte cultuur24,25. Cellen werden vervolgens verzameld op bepaalde tijdstippen en nucleaire isolatie werd uitgevoerd. Vervolgens werden histonen geëxtraheerd en gederivatiseerd met propionisch anhydride voor en na trypsinevertering volgens een protocol dat voor het eerst werd ontwikkeld door Garcia et al.26. Deze procedure genereert peptiden van een geschikte grootte voor online scheiding met omgekeerde fase chromatografie (C18) en detectie met MS. Ten slotte werden histonpeptiden geïdentificeerd en gekwantificeerd en werden de gegenereerde gegevens op meerdere manieren weergegeven voor een meer complete biologische interpretatie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van buffers en reagentia

  1. Celgroeimedia (voor HepG2/C3A-cellen): Voeg foetaal runderserum (FBS) (10% v/v), niet-essentiële aminozuren (1% v/v), L-glutaminesupplement (1% v/v) en penicilline/streptomycine (0,5% v/v) toe aan Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, met 4,5 g/L glucose). Groeimedia worden maximaal 2 weken bewaard bij 4 °C.
  2. 200 mM natriumbutyraat (NaBut) oplossing: Om 10 ml te bereiden, resuspend 220,18 mg NaBut in 10 ml ddH2O. Bewaar 1 ml aliquots bij -20 °C. Filter de oplossing vóór de celbehandeling met een spuitfilter van 0,45 mm en voeg 1 ml van de gefilterde oplossing toe aan 9 ml celgroeimedia voor een werkconcentratie van 20 mM.
  3. 100 mM natriumsuccinaat (NaSuc) oplossing: Om 10 ml te bereiden, resuspend 162,05 mg NaSuc in 10 ml ddH2O. Bewaar 1 ml aliquots bij -20 °C. Filter de oplossing vóór de celbehandeling met een spuitfilter van 0,45 mm en voeg 1 ml van de gefilterde oplossing toe aan 9 ml celgroeimedia voor een werkconcentratie van 10 mM.
  4. Koud 0,2 M H2SO4: Voeg om 1 L te bereiden 10 ml geconcentreerd H2SO4 toe aan 990 ml water van HPLC-kwaliteit. Bewaren bij 4 °C.
  5. Koude aceton + 0,1% zoutzuur (HCl): Voeg geconcentreerd HCl (0,1% v/v) toe aan aceton. Bewaren bij 4 °C.
  6. 100 mM NH4HCO3-oplossing , pH 8,0: Om 1 l te bereiden, moet u 7,91 g NH4HCO3 resuspenderen in 1 l water van HPLC-kwaliteit. Bewaar 50 ml aliquots bij -20 °C.
  7. 0,1% trifluorazijnzuuroplossing (TFA): Voeg geconcentreerd TFA (0,1% v/v) toe aan water van HPLC-kwaliteit. Bewaren bij 4 °C.
  8. 60% acetonitril/0,1% TFA-oplossing: voeg acetonitril van HPLC-kwaliteit (60% v/v) toe aan water van HPLC-kwaliteit. Voeg vervolgens geconcentreerde TFA (0,1% v/v) toe aan deze oplossing. Bewaren bij 4 °C.
  9. 2% ACETONITRIL van HPLC-kwaliteit + 0,1% mierenzuur: Voeg acetonitril van HPLC-kwaliteit (2% v/v) toe aan water van HPLC-kwaliteit. Voeg vervolgens geconcentreerd mierenzuur (0,1% v/v) toe aan deze oplossing.
  10. 80% ACETONITRIL van HPLC-kwaliteit + 0,1% mierenzuur: Voeg acetonitril van HPLC-kwaliteit (80% v/v) toe aan water van HPLC-kwaliteit. Voeg vervolgens geconcentreerd mierenzuur (0,1% v/v) toe aan deze oplossing.

2. Voorbereiding van het 3D-kweeksysteem

OPMERKING: Verschillende cellen, primair of vereeuwigd, hebben verschillende cultuureigenschappen, dus de vorming van sferoïden kan verschillen tussen celtypen. Dit protocol is opgesteld voor HepG2/C3A sferoïde vorming met behulp van bioreactoren en een innovatief 3D-celkweeksysteem.

  1. Gebruik standaard groeimedia om cellen als monolaag te laten groeien tot ze voor 80% confluent zijn.
  2. Was cellen met HBSS (5 ml voor een kolf van 75 cm2 ) en incubeer cellen met 5 ml 0,05% trypsine-EDTA verdund in HBSS (1:2 verdunning) gedurende 5 minuten bij 37 oC met 5% CO2.
  3. Controleer de celloslating onder een microscoop en neutraliseer trypsine door toevoeging van 3 ml foetaal runderserum (FBS) of groeimedia (met 5% -10% FBS).
  4. Tel het aantal cellen en verdun de celsuspensie om 1 x 106 cellen te verkrijgen in een maximaal volume van 1,5 ml.
  5. Breng een ultralage 24-put ronde bodemplaat (met meerdere microputten per put) in evenwicht door de putten te wassen met 0,5 ml groeimedia. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 3.000 x g om luchtbellen van het oppervlak van de put te verwijderen.
  6. Breng de celsuspensie over in de plaat en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 120 x g.
  7. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 oC met 5% CO2 voor sferoïdevorming. Breng ondertussen de bioreactor in evenwicht door de vochtigheidskamer te vullen met 25 ml steriel water en de celkamer met 9 ml groeimedia.
  8. Incubeer de bioreactor, roterend in de clinostat incubator, gedurende 24 uur bij 37 oC met 5% CO2.

3. Groei van sferoïden in bioreactoren

OPMERKING: Om de structuur van sferoïden te behouden, worden brede boorpunten gebruikt voor het hanteren van de 3D-structuren.

  1. Maak de sferoïden los van de ultralage bevestigingsplaat door voorzichtig op en neer te pipetteren met 1 ml brede boorpunten en breng over naar een met weefselkweek behandelde schaal.
  2. Was de plaat met 0,5 ml voorverwarmde groeimedia en breng over in dezelfde schaal.
  3. Evalueer de kwaliteit van sferoïden door microscopie en selecteer voldoende gevormde sferoïden. Sferoïden van goede kwaliteit hebben een uniforme grootte, compactheid en rondheid.
  4. Breng sferoïden over in gebalanceerde bioreactoren gevuld met 5 ml verse groeimedia. Na het overbrengen van de sferoïden, vult u de bioreactor volledig met verse groeimedia.
  5. Plaats de bioreactor in de clinostat-incubator en stel de rotatiesnelheid in op 10-11 tpm.
  6. Wissel groeimedia om de 2-3 dagen uit door 10 ml oude media te verwijderen en te vervangen door 10 ml verse media.
  7. Pas de rotatiesnelheid aan volgens de sferoïde groei en neem toe naarmate sferoïden in grootte en aantal toenemen.
  8. Na 18 dagen in cultuur zijn sferoïden klaar voor behandeling en/of verzameling

4. Behandeling en verzameling van sferoïden

OPMERKING: In dit protocol worden HepG2/C3A-sferoïden behandeld met natriumbutyraat (NaBut) en natriumsuccinaat (NaSuc) om de niveaus van histonmarkeringen te evalueren die respectievelijk acetylering en succinylering bevatten.

  1. Bereid groeimedia voor met de juiste werkconcentratie van de verbinding (bijv. 20 mM NaBut of 10 mM NaSuc). Wissel de media in de bioreactor uit met de behandelde media.
    OPMERKING: Om een controleconditie vast te stellen, verzamelt u voldoende sferoïden voor experimenten voordat u de behandeling toevoegt of wijst u een bioreactor aan voor onbehandelde sferoïden.
  2. Verzamel sferoïden voor proteomische analyse na voldoende behandelingstijd (bijv. 48 uur tot 1 week voor behandeling met NaSuc of 48-72 uur voor behandeling met NaBut).
    OPMERKING: Voor histonextractie met behulp van dit protocol werden zes tot acht sferoïden met ongeveer 1 x 106 cellen verzameld.
    1. Verwijder 3-5 ml media uit de bioreactor via de bovenste poort.
    2. Open de voorpoort en gebruik een 1 ml brede boorpunt om sferoïden te verwijderen en in microcentrifugebuizen te plaatsen.
    3. Centrifugeer de sferoïden gedurende 5 minuten bij 100 x g en gooi de media weg.
      OPMERKING: De media in de bioreactor kunnen worden gewijzigd en de bioreactor kan worden teruggebracht naar de incubator voor extra behandelingstijd of herstel.
    4. Was sferoïden met 200 μL HBSS om de FBS te verwijderen. Centrifugeer 5 min bij 100 x g en verwijder het supernatant.
      OPMERKING: Sferoïden kunnen worden bewaard bij -80 oC tot de verwerking.

5. Histonextractie

OPMERKING: De vele basische aminozuurresiduen die in histonen aanwezig zijn, stellen hen in staat om nauw samen te werken met DNA, dat een fosforzuurbackbone heeft. Omdat histonen enkele van de meest basale eiwitten in de kern zijn, is er minimale verontreiniging wanneer ze worden geëxtraheerd met ijskoud zwavelzuur (0,2 M H2SO4). De niet-histoneiwitten zullen neerslaan in sterk zuur. Sterk geconcentreerd trichloorazijnzuur (TCA) verdund tot een eindconcentratie van 33% wordt daarna gebruikt om de histonen uit het zwavelzuur neer te slaan. Bewaar alle monsters, buizen en reagentia op ijs voor de gehele histonextractie.

  1. Voeg vijf volumes (~100 μL) koude 0,2 M H2SO4 toe aan de celkorrel (~10-20 μL) en pipetteer op en neer om de pellet te verstoren en histonen vrij te geven.
  2. Incubeer buizen tot 4 uur bij constante rotatie of schudden bij 4 oC.
    OPMERKING: Voor geresuspendeerde monsters met een volume van meer dan 500 μL is een incubatie van 2 uur voldoende om histonen te extraheren (langere incubatie kan resulteren in extractie van andere basische nucleaire eiwitten). Voor geresuspendeerde monsters met een volume van minder dan 200 μL is een incubatie van 4 uur vereist voor een betere opbrengst.
  3. Centrifugeer bij 3.400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verzamel supernatant in een nieuwe buis en gooi de pellet later weg.
  4. Voeg koudgeconcentreerde TCA zodanig toe dat het een uiteindelijke 25% -33% v / v vormt (bijv. 40-60 μL koude TCA: 120 μL supernatant) en meng door de buis een paar keer om te keren.
  5. Incubeer buizen gedurende ten minste 1 uur bij constante rotatie of schudden bij 4 oC.
    OPMERKING: Voor kleinere beginnende pelletgroottes wordt een nachtelijke incubatie aanbevolen.
  6. Centrifugeer bij 3.400 x g gedurende 5 min bij 4 oC. Gooi het supernatant weg door te pipetteren. Aspirateer het bovennatuurlijke zorgvuldig; raak de zijkanten van de buis of de pellet niet aan.
    OPMERKING: Histonen zetten zich af aan zowel de zijkanten als de onderkant van de buis. De witte onoplosbare pellet die helemaal onderaan de buis wordt gevormd, bevat voornamelijk niet-histoneiwitten en andere biomoleculen.
  7. Was de buis (wanden en pellet) met koude aceton + 0,1% HCl met een glazen Pasteur pipet (~500 μL/tube).
  8. Centrifugeer bij 3.400 x g gedurende 5 minuten bij 4 oC. Gooi het supernatant weg door de buis om te draaien.
  9. Was de buis (wanden en pellet) met 100% koude aceton met behulp van een glazen Pasteur pipet (~ 500 μL / buis). Centrifugeer bij 3.400 x g gedurende 5 min bij 4 oC.
  10. Gooi supernatant weg door de tube om te draaien en pipetteer de resterende aceton eruit. Open het deksel en droog het monster aan de lucht op de bank gedurende ~ 20 minuten.
  11. Ga verder met propionylatie of bewaar monsters in -80 oC tot gebruik.

6. Eerste ronde van derivatisatie

OPMERKING: Het gebruik van trypsine om histoneiwitten te verteren leidt tot te kleine peptiden die moeilijk te identificeren zijn met behulp van traditionele proteomics-opstellingen. Om deze reden wordt propionzuuranhydride gebruikt om de ɛ-aminogroepen van ongewijzigde en monomethyllysineresiduen chemisch te derivatiseren. Dit beperkt trypsine proteolyse tot C-terminal arginine residuen. Voor monsters in 96-putplaten wordt het gebruik van meerkanaalspipeten en reservoirs voor het opnemen van reagens aanbevolen (figuur 2A). Derivatisatie wordt ook uitgevoerd na de spijsvertering om de vrije N-termini van de peptiden te labelen die de peptidehydrofobiciteit verhogen en dus chromatografische retentie in omgekeerde fase.

  1. Resuspend monsters in 20 μL van 15%-20% acetonitril in 100 mM ammoniumbicarbonaat (pH 8,0). Vortex gedurende 15 s en draai dan naar beneden bij 1.000 x g gedurende 30 s.
  2. Als er acht of meer monsters zijn, breng dan elk geresuspendeerd monster over in een plaat met 96 putten.
    OPMERKING: Als de monsters niet zijn overgebracht naar een 96-putplaat, kan een eenkanaalspipet worden gebruikt in de stappen 6.3-6.7, 7.1-7.5 en 8.1-8.5.
  3. Voeg onder de motorkap 2 μL propionzuuranhydride toe met behulp van een meerkanaalspipet. Mix door 5x op en neer te pipetteren.
  4. Voeg snel 10 μL ammoniumhydroxide toe met behulp van een meerkanaalspipet. Mix door 5x op en neer te pipetteren.
    OPMERKING: Propionzuur is een product van de reactie tussen propionzuuranhydride en vrije amines uit peptiden en kan de pH van het monster verlagen. pH 8 kan worden hersteld door ammoniumhydroxide aan het monster toe te voegen in een verhouding van 1:5 (v/v).
  5. Zorg ervoor dat de pH 8 is met pH-testpapier. Als de pH < 8, past u deze aan door 1 μL ammoniumhydroxide toe te voegen. Als de pH > 8, pas dan aan door 1 μL mieren- of azijnzuur toe te voegen. Wanneer de pH > 10, is etikettering van andere aminozuurresiduen met een hogere pKa mogelijk.
  6. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
  7. Herhaal stap 6.3-6.6. Een dubbele ronde histonpropionylatie zorgt voor een bijna volledige reactie-efficiëntie.
  8. Droge plaat in snelheidsvacuüm totdat alle putten volledig zijn gedroogd (~ 9 uur).
  9. Ga verder met trypsinevertering of bewaar monsters bij -80 oC tot gebruik.

7. Histonvertering

OPMERKING: Histonen worden verteerd tot peptiden met behulp van trypsine, dat snijdt aan de carboxylzijde van arginine en lysineresiduen. Omdat propionylatie echter lysineresiduen wijzigt, worden alleen arginineresiduen gesplitst (figuur 2B).

  1. Bereid trypsine-oplossing (25 ng/μL in 50 mM NH4HCO3, pH 8,0). Voeg 20 μL trypsine (500 ng) toe aan elk monster.
    1. Om 50 mM NH4HCO3-oplossing te bereiden, verdunt u 100 mM NH4HCO3-oplossing 1:1 v/v met water van HPLC-kwaliteit.
  2. Zorg ervoor dat de pH 8 is met pH-testpapier. Als de pH < 8, past u deze aan door 1 μL ammoniumhydroxide toe te voegen. Als de pH > 8, pas dan aan door 1 μL mieren- of azijnzuur toe te voegen.
  3. Verteer 's nachts bij kamertemperatuur of incubeer bij 37 oC gedurende 6-8 uur.
  4. Controleer indien mogelijk de pH na ~ 3 uur spijsvertering, omdat deze mogelijk is afgenomen. Als de pH < 8, past u deze aan door 1 μL ammoniumhydroxide toe te voegen.
  5. Voeg nog eens 5 μL van 50 ng/μL trypsine-oplossing (250 ng) toe en ga verder met de spijsvertering.
  6. Ga verder met de tweede propionylatieronde of bewaar monsters bij -80 oC tot gebruik.

8. Derivatisatie van peptide N-termini

OPMERKING: De propionylatie van histonpeptiden op hun N-terminus verbetert de retentie van de kortste peptiden door omgekeerde fase vloeistofchromatografie (bijv. Aminozuren 3-8 van histon H3), omdat de propionylgroep de peptidehydrofobiciteit verhoogt.

  1. Voeg onder de motorkap 2 μL propionzuuranhydride toe met behulp van de meerkanaalsp pipet. Mix door 5x op en neer te pipetteren.
  2. Voeg snel 10 μL ammoniumhydroxide toe met behulp van de meerkanaalspion. Mix door 5x op en neer te pipetteren.
    OPMERKING: Propionzuur is een product van de reactie tussen propionzuuranhydride en vrije amines uit peptiden en kan de pH van het monster verlagen. pH 8 kan worden hersteld door ammoniumhydroxide aan het monster toe te voegen in een verhouding van 1:5 (v/v).
  3. Zorg ervoor dat de pH 8 is met pH-testpapier. Als de pH < 8, past u deze aan door 1 μL ammoniumhydroxide toe te voegen. Als de pH > 8, pas dan aan door 1 μL mieren- of azijnzuur toe te voegen. Wanneer de pH > 10, is etikettering van andere aminozuurresiduen met een hogere pKa mogelijk.
  4. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
  5. Herhaal stap 8.1-8.4. Een dubbele ronde histonpropionylatie zorgt voor een bijna volledige reactie-efficiëntie.
  6. Droge plaat in snelheidsvacuüm totdat alle putten volledig zijn gedroogd (~ 9 uur).
  7. Ga verder met de ontzoutingsstap of bewaar monsters bij -80 oC tot gebruik.

9. Ontzouten en monsteropruiming

OPMERKING: Zouten die in het monster aanwezig zijn, interfereren met massaspectrometrieanalyse. Zouten worden ook geïoniseerd tijdens elektrospray en kunnen signalen van peptiden onderdrukken. Zouten kunnen ionische adducten vormen op peptiden, waardoor het geadduceerde peptide een andere massa heeft. Dit vermindert de signaalintensiteit van het peptide en voorkomt een goede identificatie en kwantificering. De opstelling voor ontzouting wordt geïllustreerd in figuur 2C.

  1. Begin met het mengen van de HLB-hars (50 mg/ml in 100% acetonitril) op een magneetroerplaat.
  2. Zorg ervoor dat er een 96-well opvangplaat onder de 96-well polypropyleen filterplaat is geplaatst om de doorstroom op te vangen.
  3. Voeg 70 μL HLB-suspensie per put toe aan de filterplaat. Zet de stofzuiger voorzichtig aan om spatten te voorkomen. Gooi de doorstroming weg.
  4. Was de hars met 100 μL van 0,1% TFA. Zet de stofzuiger voorzichtig aan om spatten te voorkomen. Gooi de doorstroming weg.
  5. Resuspend elk monster in 100 μL van 0,1% TFA. Controleer de pH; het zou ~2-3 moeten zijn.
  6. Laad elk monster in elke put. Zet de stofzuiger voorzichtig aan om spatten te voorkomen. Gooi de doorstroming weg.
  7. Wassen met 100 μL 0,1% TFA. Zet de stofzuiger voorzichtig aan om spatten te voorkomen. Gooi de doorstroming weg.
  8. Vervang de opvangplaat door een nieuwe 96-wells opvangplaat.
  9. Voeg 60 μL 60% acetonitril/0,1% TFA per putje toe. Zet de stofzuiger voorzichtig aan om spatten te voorkomen. Vang de doorstroming op en droog in een snelheidsvacuüm.
  10. Ga verder met LC-MS/MS of bewaar monsters bij -80 oC tot gebruik.

10. Histonpeptide analyse via vloeistofchromatografie in combinatie met massaspectrometrie

  1. Bereid de mobiele fasen voor op de high-performance vloeistofchromatografie (HPLC). Mobiele fase A (MPA): 2% ACETONITRIL van HPLC-kwaliteit + 0,1% mierenzuur. Mobiele fase B (MPB): 80% HPLC-kwaliteit acetonitril + 0,1% mierenzuur.
  2. Programmeer de HPLC-methode als volgt: (1) 4% -34% MPB gedurende 30 minuten; (2) 34% -90% MPB over 5 minuten; en (3) isocratisch 90% MPB gedurende 5 min. Gebruik de volgende aanbevolen kolomeigenschappen: C18 3 μm verpakkingsmateriaal, 75 μm inwendige diameter, 20-25 cm lengte. Stel het debiet in op 250-300 nL/min voor nanokolommen met een inwendige diameter van 75 μm.
    1. In het geval dat de HPLC niet is geprogrammeerd om kolomevenwichtigheid te automatiseren voordat het monster wordt geladen, neem dan (4) 90% -4% MPB op gedurende 1 min en (5) isocratisch 4% MPB gedurende 10 minuten.
  3. Programmeer de MS-acquisitiemethode.
    1. Zorg ervoor dat het instrument aan het begin van elke taakcyclus één volledige MS-scan uitvoert. Instrumentatie met hoge resolutie (bijv. orbitrap of time-of-flight analyzers) wordt aanbevolen, vanwege de massanauwkeurigheid die kan worden gebruikt tijdens signaalextractie. Instrumentatie met lage resolutie kan echter ook worden gebruikt zoals eerder beschreven27,28.
    2. Zorg ervoor dat de volledige MS-scan wordt gevolgd door 16 MS/MS-scangebeurtenissen, elk met een isolatiebreedte van 50 m/z, verspreid over het m/z-bereik van 300-1100. De eerste scan moet bijvoorbeeld signalen isoleren bij 300-350 m/z, de tweede bij 350-400 m/z, enz. Verkrijg indien mogelijk ook MS/MS-scans in hoge resolutie, maar een lagere resolutie in vergelijking met de volledige MS-scan is voldoende (vanwege de kleinere massa's fragmentionen in vergelijking met intacte ionen).
    3. De HPLC-methode genereert chromatografische signalen met piekbreedtes van ~3-40 s; om een goede signaalkwantificering te garanderen, moet ervoor worden gezorgd dat de massaspectrometer ten minste 10 duty cycles per chromatografische piek uitvoert (d.w.z. een duty cycle van 3 s of sneller).
    4. Als u een vangachtige massaanalysator (orbitrap, ionenval) gebruikt, moet u ervoor zorgen dat de tijdslimiet voor ioneninjectie is ingesteld op <200 ms; voor andere analyzers (quadrupool, time-of-flight) is dit geen probleem vanwege hun snellere scantijd. Een voorlopige test kan nodig zijn.
      OPMERKING: Meer details over MS-methoden voor histonpeptide-analyse zijn te vinden in de volgende referenties 27,28,29.
  4. Resuspend monster in 10 μL MPA, wat overeenkomt met ~1 μg/μL verteerd histonmonster. De exacte laadhoeveelheid is niet kritisch (ook niet triviaal om te beoordelen) als alle monsters in de batch worden geladen met vergelijkbare verdunningen en volumes.
  5. Laad 1 μL monster op de HPLC-kolom.
  6. Voer de LC-MS/MS-methode uit die is geprogrammeerd in stap 10.1-10.3.

11. Data-analyse

  1. Importeer de MS raw-gegevensbestanden in software die is ontworpen om piekgebiedintegratie uit te voeren.
    OPMERKING: EpiProfile 30,31 wordt gebruikt in de huidige studie en wordt over het algemeen aanbevolen, omdat het is geoptimaliseerd voor betrouwbare piekgebiedextractie van bekende histonpeptiden. Andere vrij beschikbare software voor geëxtraheerde ionchromatografie zoals Skyline32,33 zijn echter geschikt.
  2. Bereken de relatieve abundantie van een gegeven (on)gemodificeerd peptide als de oppervlakte van een enkel peptide gedeeld door de totale oppervlakte van het peptide in al zijn gemodificeerde vormen. Software zoals EpiProfile30,31 bevat al bibliotheken met peptiden voor signaalextractie. Genereer anders een bibliotheek met interessante peptiden, handmatig of via peptide-identificatie met behulp van routinematige proteomics-pijplijnen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol werden HepG2/C3A-sferoïden behandeld met 20 mM NaBut en 10 mM NaSuc, die beide de wereldwijde niveaus van histon-PTM's beïnvloedden (figuur 3A). Histon PTM's werden vervolgens geïdentificeerd en gekwantificeerd op het niveau van één residu via MS/MS-acquisitie (figuur 3B).

Wanneer monsters in replicaties worden uitgevoerd, kan statistische analyse worden uitgevoerd om de vouwveranderingsverrijking van een PTM ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De analyse van histon PTM's is fundamenteel anders dan de typische proteomics analyse pijplijn. De meeste histon PTM's hebben nog steeds raadselachtige biologische functies; als gevolg hiervan zijn annotaties zoals Gene Ontology of pathway-databases niet beschikbaar. Er bestaan verschillende bronnen die histonmodificaties associëren met het enzym dat verantwoordelijk is voor hun katalyse of eiwitten die domeinen bevatten die deze PTM's binden (bijv. HISTome36). Ook is het mogelijk om te speculeren...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het Sidoli-lab erkent dankbaar de Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck en het NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% trypsin-EDTA oplossingGibco25300054
0.5-20 µL pipettipsBRAND13-889-172 (Fisher Scientific)
1.5 mL microcentrifugebuisjesBio-Rad2239480
10 µL multikanaals pipetteBRANDBR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL spuitHenke Sass Wolf14-817-31 (Fisher Scientific)Luer lock tip, gegradueerd tot 12 mL
10, 20, 200 en 1000 µL enkelkanaals pipettesEppendorf14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µL pipettipsRainin30389164
18 G spuitnaaldAir-Tite14-817-100 (Fisher Scientific)3" lengte, 0.05" diameter
200 µL multikanaals pipetteCorning4082
2-200 µL pipettipsBRANDZ740118 (Millipore Sigma)
24-well ultra-low attachment microplaatCorning07-200-602
75 cm2 U-vormige celkweekkolfCorning461464UOnbehandeld, met ventilatiekap
96-well randplaatAxygenPCR-96-FS-C (Corning)
AcetonFisher ScientificA949-1Aceton moet koud worden gebruikt
Ammoniumbicarbonaat (NH4HCO3)Sigma-AldrichA6141-25G
Ammoniumhydroxide-oplossingFisher ScientificAC423300250
Water van celkweekkwaliteitCorning25-055-CV
ClinoReactorCelVivo10004-12Bioreactor voor 3D celkweek
ClinoStarCelVivoN/AClinostaat CO2 incubator voor 3D celkweek
Controle-eenheidCelVivoN/ATablet voor ClinoStar instellingen
Dulbecco's Aangepast Eagle's Medium (DMEM)Corning17-205-CV1X oplossing met 4,5 g/L glucose en natriumpyruvaat, zonder L-glutamine en fenolrood
Foetaal bovien serum (FBS)Corning35-010-CV
ForminezuurThermo Scientific28905
AfzuigkapMottN/AModel 7121000
Glas Pasteur pipetFisher Scientific13-678-8B9", met katoenen plug, borosilicaatglas, niet-steriel
Glutagro supplementCorning25-015-CI200 mM L-ananyl-L-glutamine
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV1X oplossing zonder calcium, magnesium en fenolrood
HPLC-kwaliteit acetonitrileFisher ScientificA955-4
HPLC-kwaliteit waterFisher ScientificW6-1
Zoutzuur (HCl)Fisher ScientificA481-212
IJsN/AN/A
MEM niet-essentiële aminozurenCorning25-025-CI100X oplossing
Oasis HLB-harsWaters186007549Hydrofiel-Lipofiel-Gebalanceerde (HLB) Hars met 30µm deeltjesgrootte
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid massaspectrometerThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFADBMBHQHoge resolutie massaspectrometer
Oro-Flex I polypropyleen filterplaatOrochemOF110096-well polypropyleen filterplaat met 10 µM PE frit
Penicilline-StreptomycineCorning30-002-CI100X oplossing
pH-papierHydrionZ111848 (Sigma-Aldrich)0-13 pH testpapier
PipetpistoolEppendorfZ666467 (Millipore Sigma)
Polymicro capillairMolex50-110-7740 (Fisher Scientific)Flexibel gefuseerd silica capillair met polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD
Polystyreen 10 mL serologische pipetten, sterieleFisher Scientific1367549
PropionylzuuranhydrideSigma-Aldrich240311-50G
Gekoelde centrifugeThermo Scientific75-217-420
Reprosil-Pur-harsMSWILR13.AQ.0003120 Å poriegrootte, C18-AQ fase, 3 µM kralengrootte
RotatorClay Adams25477 (American Laboratory Trading)Nutator Mixer 1105
Sequencing-kwaliteit gemodificeerd trypsinePromegaV5111
NatriumbutyraatThermo ScientificA11079
Natriumsuccinaat dibasischSigma-Aldrich14160-100G
SpeedVac vacuüm concentrator (1.5 mL microcentrifugebuisjes)Savant20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac vacuüm concentrator (96-well)Thermo Scientific15308325Savant SPD1010
Steriele kapThermo Scientific1375Klasse II, Type A2
Zwavelzuur (H2SO4)Fisher Scientific02-004-375Baker Analysed ACS reagens
Weefselkweek behandelde 100 mm x 20 mm schotelFisher Scientific08-772-23
Trichloroazijnzuur (TCA)Thermo ScientificAC421451000Hersuspensie 100% w/v in HPLC-kwaliteit water
Trifluorazijnzuur (TFA)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  2. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  3. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
  4. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
  5. Wrzesinski, K., et al. The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments. PLoS One. 9 (9), 106973(2014).
  6. Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering (Basel). 5 (1), 22(2018).
  7. Gonda, S. R., et al. Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment. Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).
  8. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  9. Tvardovskiy, A., et al. Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).
  10. Azad, G. K., et al. Modifying chromatin by histone tail clipping. Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).
  11. Kragesteen, B. K., Amit, I. Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity. Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).
  12. Dhaenens, M. Histone clipping: the punctuation in the histone code. EMBO Reports. 22 (8), 53440(2021).
  13. Anderson, L. C., et al. Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments. Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).
  14. Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation. Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).
  15. Chan, J. C., Maze, I. Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function. Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).
  16. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  17. Fischle, W., et al. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).
  18. Onder, O., et al. Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations. Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).
  19. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).
  20. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  21. Moradian, A., et al. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
  22. Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).
  23. Sidoli, S., Garcia, B. A. Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology. Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).
  24. Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255(2021).
  25. Calitz, C., et al. Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures. Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).
  26. Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
  27. Sidoli, S., et al. Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).
  28. Sidoli, S., et al. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).
  29. Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry. Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).
  30. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).
  31. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  32. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  33. Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
  34. Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics. Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).
  35. Lex, A., et al. UpSet: Visualization of intersecting sets. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 20 (12), 1983-1992 (2014).
  36. Shah, S. G., et al. HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs. Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31(2020).
  37. Xie, Z., et al. Lysine succinylation and lysine malonylation in histones. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).
  38. Liu, J., et al. Histone succinylation and its function on the nucleosome. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).
  39. Howe, F. S., et al. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).
  40. Nicetto, D., Zaret, K. S. Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance. Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).
  41. Wojcik, J. B., et al. Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss. Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).
  42. Sellers, W. R., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
  43. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  44. Farrelly, L. A., et al. Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3. Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).
  45. Chen, Q., et al. ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair. The EMBO Journal. 40 (2), 104542(2021).
  46. Zheng, Q., et al. Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature Communications. 10 (1), 1289(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Histone ModificationsPost Translational Modifications3D Cell CultureHepatic SpheroidsChromatin StateLiquid Chromatography Mass SpectrometryHistone AcetylationHistone SuccinylationSpheroid FormationNuclei Isolation

Related Articles