Proteomische ontregeling speelt een belangrijke rol bij de verspreiding van diffuus infiltrerende gliomen, maar verschillende relevante eiwitten blijven ongeïdentificeerd. Digitale ruimtelijke verwerking (DSP) biedt een efficiënte, high-throughput benadering voor het karakteriseren van de differentiële expressie van kandidaat-eiwitten die kunnen bijdragen aan de invasie en migratie van infiltratieve gliomen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Digitale ruimtelijke profilering voor karakterisering van de micro-omgeving in diffuus infiltrerend glioom van het volwassen type
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Diffuus infiltrerende gliomen zijn geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit als gevolg van de infiltratieve aard van tumorverspreiding. Het zijn morfologisch complexe tumoren, met een hoge mate van proteomische variabiliteit over zowel de tumor zelf als zijn heterogene micro-omgeving. Het kwaadaardige potentieel van deze tumoren wordt versterkt door de ontregeling van eiwitten die betrokken zijn bij verschillende belangrijke routes, waaronder processen die de cellulaire stabiliteit handhaven en de structurele integriteit van de micro-omgeving behouden. Hoewel er talloze bulk- en eencellige glioomanalyses zijn geweest, is er een relatief gebrek aan ruimtelijke stratificatie van deze proteomische gegevens. Het begrijpen van verschillen in ruimtelijke verdeling van tumorigene factoren en immuuncelpopulaties tussen de intrinsieke tumor, invasieve rand en micro-omgeving biedt waardevol inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan tumorproliferatie en -verspreiding. Digitale ruimtelijke profilering (DSP) vertegenwoordigt een krachtige technologie die de basis kan vormen voor deze belangrijke meerlagige analyses.
DSP is een methode die efficiënt eiwitexpressie kwantificeert binnen door de gebruiker gespecificeerde ruimtelijke gebieden in een weefselmonster. DSP is ideaal voor het bestuderen van de differentiële expressie van meerdere eiwitten binnen en tussen onderscheidregio's, waardoor meerdere niveaus van kwantitatieve en kwalitatieve analyse mogelijk zijn. Het DSP-protocol is systematisch en gebruiksvriendelijk, waardoor ruimtelijke analyse van proteomische gegevens op maat mogelijk is. In dit experiment worden weefselmicroarrays opgebouwd uit gearchiveerde glioblastoomkernbiopten. Vervolgens wordt een panel van antilichamen geselecteerd, gericht op eiwitten van belang in het monster. De antilichamen, die worden voorgeconjugeerd tot UV-fotocleavable DNA-oligonucleotiden, worden vervolgens 's nachts geïncubeerd met het weefselmonster. Onder fluorescentiemicroscopievisualisatie van de antilichamen worden regio's van belang (ROI's) gedefinieerd waarbinnen eiwitexpressie kan worden gekwantificeerd met de monsters. UV-licht wordt vervolgens gericht op elke ROI, waarbij de DNA-oligonucleotiden worden gesplitst. De oligonucleotiden worden gemicroaspirateerd en geteld binnen elke ROI, waarbij het overeenkomstige eiwit op ruimtelijke basis wordt gekwantificeerd.
Inleiding
Diffuus infiltrerende gliomen zijn het meest voorkomende type kwaadaardige hersentumor bij volwassenen en zijn steevast dodelijk. De neiging voor glioomcellen om uitgebreid in de hersenen te migreren is een grote therapeutische uitdaging. Het mechanisme waarmee ze zich verspreiden, omvat gerichte migratie en ongecontroleerde invasie. Van invasieve glioomcellen is aangetoond dat ze tropisme en migratie vertonen langs witte stofkanalen1, waarbij recent onderzoek demyelinisatie van deze kanalen impliceert als een actief, protumorigene eigenschap2. Invasie wordt gemedieerd door een epitheliale naar mesenchymale overgang, waa....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het onderstaande protocol volgt de richtlijnen van de Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten van wie weefselmonsters in dit onderzoek waren opgenomen. Zie de sectie Tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, reagentia, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Dia voorbereiding17
- Ophalen of bereiden formaline-gefixeerd, paraffine-ingebed weefsel van menselijke volwassen type diffuus infiltrerende gliomen.
OPMERKING: In dit experiment werden in paraffine ingeb....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 4 toont de representatieve resultaten van een DSP-experiment uitgevoerd op monsters van glioblastoom. Er wordt een heatmap gepresenteerd, die een van de methoden illustreert waarmee gegevens visueel kunnen worden vastgelegd met behulp van de DSP-software. Rijen vertegenwoordigen eiwitdoelen en elke kolom komt overeen met een interessegebied. Een kleurbereik van blauw tot rood duidt respectievelijk op een lage tot hoge expressie. Variabiliteit van kleur binnen een rij weerspiegelt regi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Gezien de diversiteit aan eiwitten die mogelijk de agressiviteit van gliomen kunnen beïnvloeden en het idee dat verschillende van deze eiwitten onontdekt blijven, is een high-throughput eiwitkwantificeringsmethode een ideale technologische benadering. Aangezien ruimtelijke gegevens in oncologische monsters vaak correleren met differentiële expressie18, maakt het opnemen van ruimtelijke profilering in de eiwitkwantificeringsbenadering bovendien een effectievere analyse mogelijk.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen de steun van het Laboratorium voor Klinische Genomica en Geavanceerde Technologie in de afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde van het Dartmouth Hitchcock Health System. De auteurs erkennen ook de Pathology Shared Resource in het Dartmouth Cancer Center met NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Duitsland | DS9455 | Open detectiesysteem met open containers in een reagentenbakje |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Duitsland | AR950 | 10X geconcentreerde bufferoplossing voor het wassen van vast weefsel |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact opnemen met bedrijf | Blokmiddel |
| Cy3-conjugatiekit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3-fluorescente antilichaamconjugatiekit |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact opnemen met bedrijf | Systeem voor het beeldvormen en karakteriseren van eiwit- en RNA-doelwitten |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Bufferkit voor GeoMX DSP (inclusief buffers voor monsterverwerking en -voorbereiding) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controles voor het uitvoeren van GeoMX DSP-experimenten |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Eiwitmodule met doelwitten voor humane immuuncellen en immuno-oncologische doelwitten |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Eiwitmodule met doelwitten voor meerdere humane tumortypen en voor markers van epitheliale-mesenchymale overgang |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Monstervoorbereidingsreagentia voor GeoMX DSP-eiwitanalyse |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Duitsland | contact opnemen met bedrijf | Volledig geautomatiseerde IHC-kleuringsapparaat |
| Master Kit--12 reacties | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materialen en reagentia voor gebruik met het nCounter Analysis-systeem |
| nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact opnemen met bedrijf | Geautomatiseerd systeem voor multiplex doelwitexpressiekwantificering (te gebruiken met GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Boedapest, Hongarije | Om de weefselmicroarray-blok te maken |
Referenties
- Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
- Wang, J., et al. Invasion of white ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
