Genoombrede profilering van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties bij Candida albicans: een uitgebreide CUT &amp; RUN-methode en data-analyseworkflow

Mohammad N. Qasim; Ashley Valle Arevalo; Akshay D. Paropkari; Craig L. Ennis; Suzanne S. Sindi; Clarissa J. Nobile; Aaron D. Hernday

doi:10.3791/63655

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Genoombrede profilering van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties bij Candida albicans: een uitgebreide CUT & RUN-methode en data-analyseworkflow

3.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63655

⸱

1 april 2022

Mohammad N. Qasim^*¹^,² , Ashley Valle Arevalo^*¹^,² , Akshay D. Paropkari^*¹^,² , Craig L. Ennis¹^,²^,⁴ , Suzanne S. Sindi³ , Clarissa J. Nobile¹^,⁴ , Aaron D. Hernday¹^,⁴

¹Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, ²Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, ³Department of Applied Mathematics, University of California, Merced, ⁴Health Sciences Research Institute, University of California, Merced

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een experimentele methode en data-analyse workflow voor splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT & RUN) in de menselijke schimmelpathogeen Candida albicans.

Samenvatting

Regulerende transcriptiefactoren beheersen veel belangrijke biologische processen, waaronder cellulaire differentiatie, reacties op omgevingsverstoringen en -spanningen en gastheer-pathogeeninteracties. Het bepalen van de genoombrede binding van regulerende transcriptiefactoren aan DNA is essentieel om de functie van transcriptiefactoren in deze vaak complexe biologische processen te begrijpen. Splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT & RUN) is een moderne methode voor genoombrede mapping van in vivo eiwit-DNA-bindingsinteracties die een aantrekkelijk alternatief is voor de traditionele en veel gebruikte chromatine-immunoprecipitatie gevolgd door sequencing (ChIP-seq) -methode. CUT&RUN is geschikt voor een experimentele opstelling met een hogere doorvoer en heeft een aanzienlijk hoger dynamisch bereik met lagere sequencingkosten per monster dan ChIP-seq. Hier worden een uitgebreid CUT&RUN-protocol en bijbehorende data-analyseworkflow beschreven die is toegesneden op genoombrede analyse van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties in de menselijke schimmelpathogeen Candida albicans . Dit gedetailleerde protocol omvat alle noodzakelijke experimentele procedures, van epitoop tagging van transcriptiefactorcoderende genen tot bibliotheekvoorbereiding voor sequencing; daarnaast bevat het een aangepaste computationele workflow voor CUT & RUN-gegevensanalyse.

Inleiding

Candida albicans is een klinisch relevante, polymorfe menselijke schimmelpathogeen die bestaat in een verscheidenheid aan verschillende groeiwijzen, zoals de planktonische (vrij zwevende) groeiwijze en als gemeenschappen van strak gehechte cellen beschermd door een extracellulaire matrix, bekend als de biofilmmodus van groei ^1,2,3. Net als bij andere ontwikkelings- en cellulaire processen is biofilmontwikkeling een belangrijke C. albicans virulentie eigenschap waarvan bekend is dat deze op transcriptioneel niveau wordt gecontroleerd door regulerende transcri....