Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Verbeterde renale denervatie verminderde hypertensie geïnduceerd door angiotensine II-infusie

4.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63719

⸱

26 mei 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Huadong Hospital Affiliated to Fudan University, 2Shanghai Key Laboratory of Clinical Geriatric Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor renale sympathische denervatie (RDN) bij muizen met hypertensie geïnduceerd door angiotensine II-infusie. De procedure is herhaalbaar, handig en maakt het mogelijk om de regulerende mechanismen van RDN op hypertensie en cardiale hypertrofie te bestuderen.

Samenvatting

De voordelen van renale sympathische denervatie (RDN) op de bloeddruk zijn de afgelopen jaren in een groot aantal klinische onderzoeken bewezen. Het regulerende mechanisme van RDN op hypertensie blijft echter ongrijpbaar. Het is dus essentieel om een eenvoudiger RDN-model bij muizen vast te stellen. In deze studie werden osmotische minipompen gevuld met Angiotensine II geïmplanteerd in 14 weken oude C57BL/6-muizen. Een week na de implantatie van de mini-osmotische pomp werd een gemodificeerde RDN-procedure uitgevoerd op bilaterale nierslagaders van de muizen met behulp van fenol. Leeftijdsseks-gematchte muizen kregen een zoutoplossing en dienden als schijngroep. De bloeddruk werd gemeten bij baseline en vervolgens elke week gedurende 21 dagen. Vervolgens werden nierslagader, abdominale aorta en hart verzameld voor histologisch onderzoek met behulp van H &E- en Masson-kleuring. In deze studie presenteren we een eenvoudig, praktisch, herhaalbaar en gestandaardiseerd RDN-model, dat hypertensie kan beheersen en cardiale hypertrofie kan verlichten. De techniek kan perifere renale sympathische zenuwen denerveren zonder schade aan de nierslagader. In vergelijking met eerdere modellen vergemakkelijkt de gemodificeerde RDN de studie van de pathobiologie en pathofysiologie van hypertensie.

Inleiding

Hypertensie is een belangrijke chronische hart- en vaatziekten over de hele wereld. Ongecontroleerde hypertensie kan doelorganen beschadigen en bijdragen aan hartfalen, beroerte en chronische nierziekten 1,2,3. De prevalentie van hypertensie is tussen 1991 en 2007 in China gestegen van 20% naar 31%. Het aantal volwassenen met hypertensie in China zou kunnen verdubbelen na een recente herziening van de diagnostische criteria voor hypertensie (130/80 mmHg)4. Hypertensie kan door de geneeskunde worden gecontroleerd, maar ongeveer 20% van de patiënten is niet in staat om hun hypertensie onder controle te houden, zelfs wanneer ze ten minste drie antihypertensiva (waaronder één diureticum) krijgen in een maximaal getolereerde dosis, wat kan leiden tot de ontwikkeling van geneesmiddelresistente hypertensie5.

Renal sympathische denervatie (RDN) is bewezen een potentiële behandeling voor hypertensie te zijn. In 2009 rapporteerden Krum en collega's voor het eerst een resistente hypertensiebehandeling met RDN. Het bleek dat percutane nierslagaderablatie effectief kan leiden tot aanhoudende bloeddrukverlaging bij patiënten6. Het falen van de Symplicity Hypertension 3 (HTN-3) studie belemmerde echter de toepassing van RDN7, waardoor RDN een controversiële therapie werd. Toch is het vooruitzicht van RDN nog niet uitgesloten. Recente klinische onderzoeken, waaronder RADIANCE-HTN SOLO, SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED en SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal hebben de werkzaamheid van RDN op hypertensie 8,9,10,11,12 bevestigd. Er moet dus meer gedetailleerd mechanistisch onderzoek worden uitgevoerd om de effecten van RDN te onderzoeken.

Het algemene doel van deze studie is om aan te tonen hoe RDN bij muizen kan worden aangepast om een eenvoudigere en stabielere operatie te produceren. Een groot aantal experimenten heeft verschillende benaderingen van RDN bestudeerd, zoals intravasculaire cryoablatie, extracorporale echografie en lokale toepassing van een chemische stof of neurotoxine in verschillende diermodellen 13,14,15,16,17. Het RDN-model gegenereerd met behulp van chemische ablatie met fenol is een goed ingeburgerd experimenteel model om de pathogenese van sympathische activering bij hypertensie te bestuderen. Dit model wordt gegenereerd door chemische corrosie van de renale sympathische zenuwen met 10% fenol/ethanol oplossing met behulp van een wattenstaafje18. Aan de ene kant remt de conventionele RDN mogelijk de renale sympathische activiteit, die vervolgens de reninesecretie en natriumreabsorptie vermindert en de renale bloedstroom verhoogt. Aan de andere kant onderdrukt het renine-angiotensine-aldosteronsysteem19. Daardoor heeft RDN een gunstig effect op hypertensie. Het door chemische ablatie gegenereerde RDN-model mist echter ablatiecriteria en ablatietijd en de details van de experimentele procedure zijn nog onduidelijk. Ook zijn er geen technische rapporten beschikbaar. In dit rapport beschrijven we een chirurgisch protocol voor het genereren van RDN-model met fenol met behulp van weegpapier bij angiotensine II (Ang II) geïnduceerde hypertensie bij C57BL/6-muizen. We wikkelen de nierslagader met weegpapier dat fenol bevat en verenigen de ablatietijd, wat helpt om een meer reproduceerbaar, betrouwbaar RDN-model vast te stellen. Dit experimentele model is gericht op het evalueren van het effect van RDN op hypertensie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproefprocedures voldeden aan de relevante ethische gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (NIH-publicatie nr. 85-23, herzien 2011) en werden goedgekeurd door de commissies voor dieronderzoek van het Huadong-ziekenhuis verbonden aan de Fudan University. Veertien weken oude mannelijke C57BL/6 muizen (28-30g) werden willekeurig verdeeld in vier groepen: Sham groep, Sham+Ang II groep, RDN groep, RDN+Ang II groep, n = 6 in elke groep. Alle dieren werden onder specifieke gesloten pathogeenvrije omstandigheden gehouden in een temperatuurgecontroleerde ruimte bij 24 ± 1 °C met een licht/donkercyclus van 12 uur en vrije toegang tot standaard knaagdier chow en water ad libitum.

1. Voorbereiding van het operatieveld

  1. Desinfecteer de operatietafel met 70% ethanol. Stel de temperatuur van het verwarmingskussen in op 37 °C.
  2. Zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten vóór de operatie bij 121 °C gedurende 30 minuten of op andere wijze worden gesteriliseerd. Deze procedure vereist een microchirurgische schaar, twee fijne rechte tangen, twee fijne gebogen tangen, hemostatische tangen, steriele gaasjes en weegpapier.

2. Angiotensine II geïnduceerde hypertensie

  1. Geef meloxicam (0,5 mg/kg, SC) aan de C57BL/6-muizen kort voor de inductie van de anesthesie. Verdoof vervolgens de muizen met behulp van natriumpentobarbitalinjectie zoals eerder beschreven20,21. Isofluraan kan ook worden gebruikt, indien gewenst. Bevestig de anesthesiediepte met een negatieve teenknijpreflex.
  2. Verwijder het haar op de rug met een scheerapparaat. Breng dierenartszalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen terwijl u onder narcose bent.
  3. Leg het dier op een operatietafel in de dorsale positie. Wattenstaafje en veeg het geschoren gebied af met povidon-jodium gevolgd door drie doekjes met 70% ethanol.
  4. Maak een incisie van 1 cm met behulp van een steriel scalpelmes, loodrecht op de staart, achter het oor over het schouderblad van het voorbeen.
  5. Gebruik een steriele hemostaat om een onderhuidse tunnel onder de huid te maken en een zak voor de pomp te maken22. Steek een osmotische pomp gevuld met Angiotensine II (1.000 ng/kg/min) voorzichtig in de zak. Zorg ervoor dat er voldoende vrije ruimte is om de wond te hechten zonder de huid uit te rekken.
  6. Hecht de spier met onderbroken 6-0 Vicryl hechtingen en sluit de huid met onderbroken 4-0 nylon hechtingen. Wattenstaafje en veeg de wondplaats af met povidon-jodium. Voer dezelfde operatie uit met een gelijk volume zoutoplossing voor de controlegroep.
  7. Plaats alle chirurgische instrumenten gedurende 10 s in een sterilisator en vervang de steriele handschoenen tussen de operaties door. Controleer alle muizen totdat ze volledig zijn hersteld.
  8. Nauwlettend toezicht houden en observeren van wondgenezing bij muizen ten minste tweemaal daags tijdens de eerste week en eenmaal per dag daarna, inclusief roodheid, zwelling en infectie. Voer dissectie onmiddellijk uit als de muizen sterven tijdens de Ang II-infusie.
  9. Meet de bloeddruk bij baseline en elke week na Ang II-infusie met de staart-manchet plethysmografiemethode23 bij bewuste muizen. Zorg ervoor dat de bloeddrukmetingsexperimenten worden uitgevoerd in een rustige omgeving, bij 22 ± 2 °C, waar muizen gedurende 1 uur worden geacclimatiseerd voordat het experiment begint. Laat muizen minstens 5 opeenvolgende dagen wennen vóór de bloeddrukmetingenbij aanvang 23,24.

3. Bilaterale renale denervatie

  1. Selecteer de muizen met verhoogde bloeddruk (BP) ≥140/90mmHg of 25% toename van systolische BP/diastolische BP, 1 week na de Ang II-infusie.
  2. Noteer het gewicht van het dier vóór de operatie en kies dieren met een minimumgewicht van 24 g voor nierdenervatiechirurgie.
  3. Verdoof de muizen met natriumpentobarbital. Bevestig de anesthesiediepte met een negatieve teenknijpreflex.
  4. Verwijder het haar op de buik met een scheerapparaat. Voer deze procedure zorgvuldig en grondig uit om chirurgische besmetting te voorkomen.
  5. Plaats de muizen op de operatietafel, houd de buik omhoog en bevestig de ledematen met tape. Desinfecteer de buikhuid met povidon-jodium gevolgd door drie doekjes met 70% ethanol.
  6. Maak een ventrale buikincisie van 2 cm met behulp van een scalpelmesje. Trek de darm terug met gaas gedrenkt in een zoutoplossing van 37 °C om de linker nierslagader bloot te leggen. Ontleed voorzichtig maar botweg het vet weg van de nierslagader met behulp van een gebogen pincet. (Figuur 1A-C).
  7. Snijd het weegpapier in een rechthoek van dezelfde grootte als de nierslagader met een steriele scherpe schaar. Snijd ter referentie het weegpapier in hetzelfde formaat als aangegeven door de stippellijn in figuur 1C.
    OPMERKING: Het is een cruciaal onderdeel van de operatie, probeer meerdere stukken van het weegpapier tegelijk te snijden om dezelfde vorm te behouden.
  8. Dompel het weegpapier gedurende ten minste 30 s in 10% fenol/ethanoloplossing. Bedek het oppervlak van de linker nierslagader en wikkel het vat in met het weegpapier, gedurende 2 minuten bewaren (figuur 1D). Gebruik gaas om de omliggende weefsels te beschermen om te voorkomen dat het weegpapier de omliggende nier en darm raakt.
    OPMERKING: De fenoloplossing is stabiel in plastic buizen, maar niet in glazen injectieflacons. Daarom moet de oplossing voor elk experiment vers worden bereid18.
  9. Voer dezelfde procedure uit voor de rechter nierslagader. Voer de schijnoperatie uit met weegpapier ondergedompeld in zoutoplossing.
  10. Verplaats de spieren in hun beginpositie en sluit het peritoneum met 6-0 Vicryl-hechtingen in een onderbroken hechting. Sluit vervolgens de huid met onderbroken 4-0 nylon hechtingen. Controleer alle muizen totdat ze volledig zijn hersteld.

4. Postoperatieve zorg

  1. Breng povidon-jodium aan op de incisie en plaats het dier in een verwarmde elektrische deken voor herstel en postoperatieve monitoring.
  2. Controleer de muizen twee keer per dag om te beoordelen op roodheid, zwelling en pijn of buikinfectie. Geef meloxicam (0,5 mg/kg, SC) aan alle muizen ongeveer 1 uur voor en 24 uur na de RDN-procedure.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Statistiek
Alle gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. One-way ANOVA werd gebruikt voor experimenten met drie of meer aandoeningen gevolgd door Bonferroni posthoc tests voor vergelijkingen tussen individuele groepen. Beschouw een p-waarde gelijk aan of kleiner dan 0,05 als significant. Een commerciële software werd gebruikt om alle statistische analyses uit te voeren.

Verhoging van de bloeddruk geïnduceerd door Ang II werd verzwakt na RDN

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Of RDN de bloeddruk zou kunnen verlagen, is controversieel geworden sinds de publicatie van het negatieve resultaat van de sympliciteit HTN-3-studie 7,25. De verschillende klinische onderzoeken en dierproeven hebben echter positieve en effectieve resultaten van RDN aangetoond bij hypertensieve mensen en dieren 9,10,11,12,13,14,15,16,17....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er zijn geen belangenconflicten, financieel of anderszins, zoals verklaard door de auteurs.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81770420), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (20140900600), Shanghai Key Laboratory of Clinical Geriatric Medicine (13dz2260700), Shanghai Municipal Key Clinical Specialty (shslczdzk02801) en Center of geriatric coronary artery disease, Huadong Hospital Affiliated to Fudan University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Angiotensin IISangon BiotechCAS:4474-91-3Om een hypertensief diermodel te maken
Anti-Tyrosine Hydroxylase-antilichaamAbcamab137869Om de expressie van TH van nierzenuwen te evalueren
BloeddrukanalyseVisitech SystemsBP-2000De bloeddruk van muizen meten
Mini-osmotische pompDURECT CorporationCA 95014Vullen met Angiotensin II
Norepinefrine ELISA-kitAbcamab287789Om nier norepinefrine niveaus te meten
FenolSangon BiotechCAS:108-95-2Schade aan de niersympathieke zenuw
WeegpapierSangon BiotechF512112Om de nierzenuw te vernietigen met weegpapier gedrenkt in fenol; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112. 

Referenties

  1. Messerli, F. H., Rimoldi, S. F., Bangalore, S. The transition from hypertension to heart failure: Contemporary update. JACC Heart Failure. 5 (8), 543-551 (2017).
  2. Lackland, D. T., et al. Implications of recent clinical trials and hypertension guidelines on stroke and future cerebrovascular research. Stroke. 49 (3), 772-779 (2018).
  3. Rossignol, P., et al. The double challenge of resistant hypertension and chronic kidney disease. The Lancet. 386 (10003), 1588-1598 (2015).
  4. Du, X., Patel, A., Anderson, C. S., Dong, J., Ma, C. Epidemiology of cardiovascular disease in China and opportunities for improvement. JACC International. Journal of the American College of Cardiology. 73 (24), 3135-3147 (2019).
  5. Valenzuela, P. L., et al. Lifestyle interventions for the prevention and treatment of hypertension. Nature Review Cardiology. 18 (4), 251-275 (2021).
  6. Krum, H., et al. Catheter-based renal sympathetic denervation for resistant hypertension: a multicentre safety and proof-of-principle cohort study. The Lancet. 373 (9671), 1275-1281 (2009).
  7. Bhatt, D. L., et al. A controlled trial of renal denervation for resistant hypertension. The New England Journal of Medicine. 370 (15), 1393-1401 (2014).
  8. Kjeldsen, S. E., Narkiewicz, K., Burnier, M., Oparil, S. Renal denervation achieved by endovascular delivery of ultrasound in RADIANCE-HTN SOLO or by radiofrequency energy in SPYRAL HTN-OFF and SPYRAL-ON lowers blood pressure. Blood Press. 27 (4), 185-187 (2018).
  9. Böhm, M., et al. Efficacy of catheter-based renal denervation in the absence of antihypertensive medications (SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal): a multicentre, randomised, sham-controlled trial. The Lancet. 395 (10234), 1444-1451 (2020).
  10. Azizi, M., et al. Endovascular ultrasound renal denervation to treat hypertension (RADIANCE-HTN SOLO): a multicentre, international, single-blind, randomised, sham-controlled trial. The Lancet. 391 (10137), 2335-2345 (2018).
  11. Kandzari, D. E., et al. Effect of renal denervation on blood pressure in the presence of antihypertensive drugs: 6-month efficacy and safety results from the SPYRAL HTN-ON MED proof-of-concept randomised trial. The Lancet. 391 (10137), 2346-2355 (2018).
  12. Townsend, R. R., et al. Catheter-based renal denervation in patients with uncontrolled hypertension in the absence of antihypertensive medications (SPYRAL HTN-OFF MED): a randomised, sham-controlled, proof-of-concept trial. The Lancet. 390 (10108), 2160-2170 (2017).
  13. Sun, X., et al. Renal denervation restrains the inflammatory response in myocardial ischemia-reperfusion injury. Basic Research in Cardiology. 115 (2), 15(2020).
  14. Sharp, T. E., et al. Renal denervation prevents heart failure progression via inhibition of the renin-angiotensin system. Journal of the American College of Cardiology. 72 (21), 2609-2621 (2018).
  15. Wang, H., et al. Renal denervation attenuates progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice independent of blood pressure lowering. Hypertension. 65 (4), 758-765 (2015).
  16. Chen, H., et al. Renal denervation mitigates atherosclerosis in ApoE-/- mice via the suppression of inflammation. American Journal of Translational Research. 12 (9), 5362-5380 (2020).
  17. Wang, Y., et al. Renal denervation promotes atherosclerosis in hypertensive apolipoprotein E-deficient mice infused with Angiotensin II. Frontiers in Physiology. 8, 215(2017).
  18. Eriguchi, M., Tsuruya, K. Renal sympathetic denervation in rats. Methods in Molecular Biology. 1397, 45-52 (2016).
  19. Thukkani, A. K., Bhatt, D. L. Renal denervation therapy for hypertension. Circulation. 128 (20), 2251-2254 (2013).
  20. Zhang, Y. J., et al. NAD(+) administration decreases microvascular damage following cardiac ischemia/reperfusion by restoring autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 115 (5), 57(2020).
  21. Wang, M., et al. Long-term renal sympathetic denervation ameliorates renal fibrosis and delays the onset of hypertension in spontaneously hypertensive rats. American Journal of Translational Research. 10 (12), 4042-4053 (2018).
  22. Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e53191(2015).
  23. Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204(2017).
  24. Daugherty, A., Rateri, D., Hong, L., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1291(2009).
  25. Esler, M. Illusions of truths in the Symplicity HTN-3 trial: generic design strengths but neuroscience failings. Journal of the American Society of Hypertension. 8 (8), 593-598 (2014).
  26. Han, W., et al. Low-dose sustained-release deoxycorticosterone acetate-induced hypertension in Bama miniature pigs for renal sympathetic nerve denervation. Journal of the American Society of Hypertension. 11 (5), 314-320 (2017).
  27. Han, W., et al. The safety of renal denervation as assessed by optical coherence tomography: pre- and post-procedure comparison with multi-electrode ablation catheter in animal experiment. Hellenic Journal of Cardiology. 61 (3), 190-196 (2020).
  28. Cai, X., et al. Noninvasive stereotactic radiotherapy for renal denervation in a swine model. Journal of the American College of Cardiology. 74 (13), 1697-1709 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Hypertensiemodelbloeddrukmetingcardiale hypertrofiesympatische zenuwablatieosmotische minipompfenoltoepassinghistologisch onderzoektyrosinehydroxylase
Verbeterde renale denervatie verminderde hypertensie geïnduceerd door angiotensine II-infusie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.