Methodenartikel

Generatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie in de skeletspierlijn

6.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63725

⸱

31 augustus 2022

 , 
1Translational Health Science and Technology Institute (THSTI), NCR Biotech Science Cluster

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie in de skeletspierlijn.

Samenvatting

Het verkennen van het therapeutisch potentieel van mesenchymale stamcellen is afhankelijk van het gemak van isolatie, de potentie voor differentiatie en de betrouwbaarheid en robuustheid van de bron. We beschrijven hier een stapsgewijs protocol voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel (uMSCs), hun immunofenotypering en de voortplanting van dergelijke culturen over verschillende passages. In deze procedure is de levensvatbaarheid van de uMSCs hoog omdat er geen enzymatische spijsvertering is. Verder zorgt het verwijderen van bloedvaten, inclusief de navelstrengslagaders en de ader, ervoor dat er geen besmetting is van cellen van endotheeloorsprong. Met behulp van flowcytometrie zijn uMSCs bij isolatie CD45−CD34−, wat wijst op een afwezigheid van cellen uit de hematopoietische afstamming. Belangrijk is dat ze belangrijke oppervlaktemarkeringen uitdrukken, CD105, CD90 en CD73. Bij het vaststellen van culturen beschrijft dit artikel een efficiënte methode om differentiatie in deze uMSCs in de skeletspierlijn te induceren. Een gedetailleerde analyse van myogene progressie in gedifferentieerde uMSCs onthult dat uMSCs Pax7 uitdrukken, een marker voor myogene voorlopers in de beginfase van differentiatie, gevolgd door de expressie van MyoD en Myf5, en ten slotte een terminale differentiatiemarker, myosine heavy chain (MyHC).

Inleiding

De menselijke navelstreng is gecrediteerd om een robuust reservoir van mesenchymale stamcellen te bezitten, die momenteel worden onderzocht voor regeneratieve therapieën vanwege hun robuuste proliferatie- en differentiatiesnelheden, immunomodulerende eigenschappen en het vermogen om cellen te genereren uit alle drie de kiemlagen1. Het navelstrengweefsel bestaat uit meerdere compartimenten zoals het navelstrengbloed, het navelstrengsubendotheel en de Wharton's jelly (WJ), die op zichzelf drie onduidelijke regio's omvat- de perivasculaire zone, de intervasculaire zone en de subamnion of de koordvoering (CL)2. Hoewel uMSC's kunnen worden geïsoleerd van al deze verschillende regio's en in grote lijnen belangrijke MSC-markers kunnen uitdrukken, is er geen duidelijkheid over de vraag of deze compartimenten dezelfde populatie uMSC's bevatten of verschillen vertonen in hun differentiatiepotenties3. Daarom vereisen protocollen voor de isolatie van uMSCs een grotere precisie in hun modus en regio van isolatie, de robuuste karakterisering van differentiatiepotentialen en ten slotte een vergelijkende analyse van verschillende compartimenten van het snoer.

In deze context hebben weinig studies verschillen aangetoond in uMSC proliferatieve en differentiatieve potentialen tussen verschillende delen van het koord. Hiervan onthulden vergelijkende analyses tussen uMSCs geïsoleerd van de CL- en WJ-regio's een groter proliferatief potentieel in CL-afgeleide uMSCs 3,4. In een afzonderlijke studie presteerden WJ-afgeleide uMSCs beter in proliferatietests in vergelijking met perivasculaire cellen (HUCPV)5. Bij het onderzoeken van verschillen tussen van navelstrengbloed afgeleide uMSCs en van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs zonder vasculaire besmetting, werd differentiële expressie van belangrijke MSC-markers gemeld tussen de twee compartimenten, evenals verhoogde proliferatiesnelheden in van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs6.

Van de verschillende studies die de differentiatiemogelijkheden van uMSCs onderzoeken, voornamelijk in weefsels van de mesoderm-afstamming, zoals osteogene, adipogene en chondrogene afstammingslijnen, hebben er maar heel weinig gedetailleerde protocollen opgeleverd voor myogene differentiatie en daaropvolgende karakterisering, evenals vergelijkende analyses tussen verschillende koordcompartimenten. In deze context hebben we een robuust spierdifferentiatieprotocol ontwikkeld en waargenomen dat van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs superieure myogene differentiatiemogelijkheden vertonen in vergelijking met navelstrengbloed6. Hier wordt een stapsgewijs protocol beschreven voor de isolatie van uMSCs van het hele navelstrengweefsel zonder cellen geassocieerd met de vasculatuur, hun karakterisering en hun differentiatie in de myogene afstamming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het gebruik van navelstrengweefsel in deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR), de Institutional Ethics Committee, Translational Health Science and Technology Institute (IEC-THSTI), de Institutional Ethics Committee of Civil Hospital, Gurugram, Haryana en de Institutional Biosafety Committee, THSTI. Menselijke navelstrengweefselmonsters werden geoogst van termijnbevallingen op het moment van geboorte. Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van proefpersonen. Alle methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften.

1. Isolatie van MSC's uit navelstrengweefsel

  1. Snijd op het moment van levering ten minste 5 cm koord door, bij voorkeur dichter bij de placenta, en steriliseer het koord door het buitenoppervlak af te vegen met 70% ethanol. Breng het stuk navelstrengweefsel sequentieel over van de ene verzamelbuis van 50 ml met fosfaatbuffered zoutoplossing (PBS) naar een andere buis met dezelfde. Transporteer de verzamelbuis met de naam van de proefpersoon op ijs binnen 1 uur naar het laboratorium.
    OPMERKING: Voor een groter onderzoek kan het nuttig zijn om de monsters van een streepjescode te voorzien om hun tracking gedurende het hele onderzoek mogelijk te maken. Belangrijk is dat al het personeel dat menselijke weefsels behandelt, het volledige regime van het hepatitis B-vaccin moet krijgen.
  2. Schakel in het laboratorium de UV gedurende 25 minuten in de BSL-2-kap in om geautoclaveerde instrumenten en pipetten vóór gebruik te steriliseren.
  3. Breng het navelstrengweefselstuk over van de verzamelbuis naar een metweefselkweek behandelde schaal van 10 cm 2 met PBS verrijkt met 5 g/L glucose, 50 μg/ml gentamicine, 2,5 μg/ml amfotericine B, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine (schematisch in figuur 1).
  4. Snijd met behulp van een scalpel het koordweefsel verticaal langs de lengteas om twee halve cilindrische stukken te verkrijgen. Vanwege koordtorsie en het slijmvliesoppervlak, pint u het weefsel vast met een tang in de andere hand.
  5. Observeer op dit punt de navelstrengslagaders en ader en verwijder de bloedvaten door een scalpel te gebruiken om ze in één richting van het oppervlak af te schrapen. Spoel het navelstrengweefsel nogmaals in PBS om al het resterende bloed dat geassocieerd is met het weefsel te verwijderen. Zorg ervoor dat het schrapen zacht is om de integriteit van cellen in de WJ rond de vaten te behouden.
  6. Gehakt elke helft van het koordweefsel in fragmenten van 0,5 cm3 formaat en plaats de fragmenten met het luminale oppervlak naar beneden gericht op de schaal. Incubeer het gerecht kort gedurende 10 minuten in een bevochtigde kamer van 37 °C met 5% CO2.
  7. Na incubatie overspoelt u de schaal met de stukjes na het navelstrengweefsel met 20 ml medium dat MEM Alpha Modification bevat zonder L-glutamine, ribo- en deoxyribonucleosiden, 15% foetaal runderserum (niet warmte-geïnactiveerd) en 50 μg / ml gentamycine. Voeg het groeimedium voorzichtig langs de zijkanten toe om te voorkomen dat de weefselexplantaten uit hun oriëntatie worden losgemaakt. Voeg overtollig medium toe om rekening te houden met een fractie die tijdens de incubatie door de weefselexplantaten zal worden opgezogen.
  8. Voeg na 3 dagen incubatie vers medium toe aan de culturen. Zorg ervoor dat de culturen worden beschermd tegen schokken en beweging van de explantaten tijdens het hanteren van de gerechten.
  9. Verwijder na 1 week de weefselfragmenten afzonderlijk met behulp van een steriele tang en gooi ze weg met geschikte biohazard-zakken voor verwijdering. Behoud het bestaande medium en voeg 10 ml vers groeimedium toe. Vervang het groeimedium om de 4 dagen totdat individuele kolonies een samenvloeiing van 70% bereiken.
    OPMERKING: Het is waarschijnlijk dat de cellen niet gelijkmatig over het gerecht worden verdeeld, omdat er individuele proliferatieve kolonies zullen zijn die met de tijd moeten worden gecontroleerd op samenvloeiing. Over het algemeen genereert een schaal van 10 cm2 binnen een maand voldoende cellen om in een aparte schaal te worden gesplitst.
  10. Oogst de aanhangende cellen met behulp van trypsine/EDTA-oplossing (1x 0,25% trypsine en 0,02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Centrifugeer de celsuspensie bij 470 × g gedurende 5 minuten bij 25 °C en resuspenseer de celpellet in groeimedium.

2. Immunofenotypering en vermeerdering van uMSCS

  1. Ga verder met immunofenotypering zodra de aanhangende cellen 50% -60% confluence hebben bereikt en goed verspreid zijn. Voer geen MSC-markeranalyse uit op volledig confluente culturen, omdat dit de neiging heeft om downregulatie van belangrijke MSC-markers te veroorzaken.
  2. Verdeel na trypsinisatie een celsuspensie van 1 × 106 cellen /ml in FACS-buizen (1 × 105 cellen / buis) en kleur met geschikte fluorofoor-gekoppelde antilichamen (alle 1:50 verdunning) in combinatie: niet-gekleurd; CD105 + CD90; CD105 + CD73; cd105; CD90; cd73; CD34 + CD45 (gewone fluorofoor); isotype controles voor elke fluorofoor. Noteer een totaal aantal gebeurtenissen van ten minste 10.000 op de flowcytometer voor verdere analyse.
    OPMERKING: Aangezien de cellen voor elke oppervlaktemarker afzonderlijk worden geanalyseerd, is gating op celsubsets niet vereist.
  3. Bevestig naast de bovenstaande markers de aanwezigheid van positieve en negatieve oppervlaktemarkers in uMSC-lijnen die zijn gemaakt van individuele navelstrengweefselmonsters (tabel 1).
  4. Analyseer de gelabelde cellen door flowcytometrie en bepaal het percentage CD105+CD90+ en CD105+CD73+ cellen. Analyseer CD105+ en CD34−CD45− cellen afzonderlijk.

3. Differentiatie van uMSCs in skeletspieren

  1. Coat weefselkweekplaten met 0,01% collageen en 20 μg/ml laminine in PBS. Bekleed deze platen minimaal 4 uur bij kamertemperatuur.
  2. Plaat uMSCs met een dichtheid van 10.000 cellen/cm2 in groeimedium.
  3. Wanneer de cellen voor 70% samenvloeien, adem dan het groeimedium op en spoel de culturen 2x met PBS. Voeg myogeen differentiatiemedium (M1) bestaande uit DMEM + 5% paardenserum + 0,1 μM dexamethason + 50 μM hydrocortison toe aan de uMSCs. Voor het bepalen van de kinetiek van myogene progressie, voeg M1 medium om de andere dag toe aan de culturen.
  4. Om de kinetiek van myogene progressie te bepalen, analyseert u uMSCs voor Pax7, MyoD, Myogenin en MyHC-expressie na respectievelijk 2 dagen, 4-5 dagen, 6-7 dagen en 10-14 dagen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het succes van isolatie van uMSCs uit navelstrengweefsel is >95%, in tegenstelling tot de slechte succespercentages van vol navelstrengbloed. Na succesvolle isolatie van uMSCs onthult FACS-analyse dat alle cellen CD34−CD45−CD105+CD90+ zijn. In vergelijkende analyse vertonen uMSCs geïsoleerd uit navelstrengbloed echter heterogene populaties, waarbij een deel van de cellen CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%) vertoont. Bovendien zijn dubbel-positieve CD1...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kritieke stappen
Een cruciale stap in dit protocol is het verzamelen van weefsel onder aseptische omstandigheden, vanaf het moment van levering tot het onderhoud van steriele culturen, voor de gehele duur van de vermeerdering. Tijdens het verzamelen van het snoer is het essentieel dat het snoer geen niet-gesteriliseerd oppervlak raakt en extern wordt afgeveegd met 70% ethanol voordat het wordt verzameld in buizen met PBS aangevuld met antibiotica. Het is belangrijk om de tijd tussen het verzamelen van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Dankbetuigingen

We bedanken de heer Ojas Tikoo voor hun hulp bij het filmen en videoproductie. We erkennen ook de hulp die is ontvangen van het GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India) personeel, verpleegkundigen en senior onderzoeksfunctionarissen in het Gurugram Civil Hospital en Dr. Pallavi Kshetrapal voor hulp bij logistiek. Dit werk werd ondersteund door subsidies toegekend aan Suchitra Gopinath van het Department of Biotechnology, India (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Amphotericin BSigma AldrichA2411
Antibiotic oplossing 100x Vloeibaar, endotoxine getest (10.000 U Penicilline en 10 mg Streptomycine/mL in 0,9% normale zoutoplossing)HiMediaA001A-50mL
Anti-GAPDH antilichaamSigma AldrichG8795
Anti-MyHC antilichaam (My32)Novus BiologicalsNBP2-50401AF647
Anti-MyoD antilichaam (5.8A)Novus BiologicalsNB100-56511
Anti-Myogeen antilichaam (Clone F5D)Novus BiologicalsNBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antilichaamDSHBDSHB-C1-576
APC Muis anti-menselijk CD90 klon 5E10BD Biosciences559869
Collageen Type 1MerckC8919
D (+) GlucoseSigma AldrichG7021
DexamethasonSIGMAD4902
FACSCanto II of FACSAria IIIBD Biosciences
Foetaal Runderserum, gekwalificeerd BraziliëGIBCO10270106niet te verhitten
FITC Muis anti-menselijk CD106 klon 51-10C9BD Biosciences551146
FITC Muis anti-menselijk CD14 klon M5E2BD Biosciences557153
FITC Muis anti-menselijk CD31 klon WM59BD Biosciences557508
FITC Muis anti-menselijk CD34 klon 581BD Biosciences555821
FITC Muis anti-menselijk CD45 klon HI30BD Biosciences555482
FITC Muis anti-menselijk CD49D klon 9F10BD Biosciences560840
FITC Muis anti-menselijk CD90 klon 5E10BD Biosciences555595
FITC Muis anti-menselijk HLA-A,B,C klon G46-2.6BD Biosciences557348
FITC Muis anti-menselijk IgG klon G18-145BD Biosciences555786
FlowJo softwareBD Biosciences
GentamicinSigma AldrichG1264
Paarden serumHiMediaRM1239
HydrocortisonMerckH4001
LaminineMerckL2020
MEM Alpha Modificatie zonder L-glutamine, ribo- en deoxyribonucleosideHycloneSH30568.FSBasismedium voor uMSCs
PE Muis anti-menselijk CD105 klon 266BD Biosciences560839
PE Muis anti-menselijk CD44 klon 515BD Biosciences550989
PE Muis anti-menselijk CD49E klon llA1BD Biosciences555617
PE Muis anti-menselijk IgG klon G18-145BD Biosciences555787
PE-Cy7 Muis anti-menselijk CD73 KLON AD2BD Biosciences561258
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH=7,4HiMediaM1866
Trypsine/EDTA oplossing (1x 0,25% Trypsine en 0,02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)HiMediaTCL049-100mL

Referenties

  1. Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
  2. Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
  3. Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
  4. Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
  5. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  6. Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978(2020).
  7. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  8. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
  9. Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
  10. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. BioMed Research International. 2013, 428726(2013).
  11. Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
  12. Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Differentiatie van skeletspierenmyogene differentiatieflowcytometrieceloppervlaktemarkersCD105 CD90CD73 expressiemyosine zware ketenmyogene progenitorcellen

Gerelateerde artikelen