Ensemble Force Spectroscopie door Shear Forces

Summary

Ensemble force spectroscopy (EFS) is een robuuste techniek voor mechanische ontvouwing en real-time detectie van een ensemble set van biomoleculaire structuren in biofysische en biosensing velden.

Abstract

Single-molecule technieken op basis van fluorescentie en mechanochemische principes bieden superieure gevoeligheid in biologische detectie. Vanwege het gebrek aan hoge doorvoermogelijkheden is de toepassing van deze technieken echter beperkt in de biofysica. Ensemblekrachtspectroscopie (EFS) heeft een hoge doorvoer aangetoond bij het onderzoek van een enorme reeks moleculaire structuren door mechanochemische studies van individuele moleculen om te zetten in die van moleculaire ensembles. In dit protocol werden de secundaire DNA-structuren (i-motieven) ontvouwd in de schuifstroom tussen de rotor en stator van een homogenisatorpunt met schuifsnelheden tot 77796/s. De effecten van stroomsnelheden en moleculaire groottes op de schuifkrachten die het i-motief ervaart, werden aangetoond. De EFS-techniek onthulde ook de bindingsaffiniteit tussen DNA i-motieven en liganden. Bovendien hebben we een klikchemiereactie aangetoond die kan worden geactiveerd door schuifkracht (d.w.z. mechano-klikchemie). Deze resultaten stellen de effectiviteit vast van het gebruik van schuifkracht om de conformatie van moleculaire structuren te regelen.

Introduction

In single-molecule force spectroscopy¹ (SMFS) zijn de mechanische eigenschappen van individuele moleculaire structuren bestudeerd door geavanceerde instrumenten zoals de atoomkrachtmicroscoop, optische pincetten en magnetisch pincetten ^2,3,4. Beperkt door dezelfde directionaliteitseis van de moleculen in de krachtgenererende/detecterende opstellingen of het kleine gezichtsveld in een magnetisch pincet en de miniatuurcentrifugekrachtmicroscoop (MCF)5,6,7,8, kan slechts een beperkt aantal moleculen tegelijkertijd worden onderzocht met behulp van SMFS. De lage doorvoer van SMFS verhindert de brede toepassing ervan in het moleculaire herkenningsveld, wat de betrokkenheid van een grote set moleculen vereist.

Shear flow biedt een mogelijke oplossing om krachten toe te passen op een enorme set moleculen⁹. In een vloeistofstroom in een kanaal geldt: hoe dichter bij het kanaaloppervlak, hoe langzamer de stroomsnelheid¹⁰. Zo'n stroomsnelheidsgradiënt veroorzaakt schuifspanning die evenwijdig is aan het grensvlak. Wanneer een molecuul in deze afschuifstroom wordt geplaatst, heroriënteert het molecuul zich zodat de lange as uitlijnt met de stroomrichting, omdat de schuifkracht wordt uitgeoefend op de lange as¹¹. Als gevolg van deze heroriëntatie wordt verwacht dat alle moleculen van hetzelfde type (grootte en lengte van de handgrepen) in dezelfde richting uitlijnen terwijl ze dezelfde schuifkracht ervaren.

Dit werk beschrijft een protocol om zo'n schuifstroom te gebruiken om schuifkracht uit te oefenen op een massieve set moleculaire structuren, zoals geïllustreerd door het DNA i-motief. In dit protocol wordt een schuifstroom gegenereerd tussen de rotor en de stator in een homogenisatorpunt. De huidige studie wees uit dat de gevouwen DNA i-motiefstructuur kon worden ontvouwd door schuifsnelheden van 9724-97245 s⁻¹. Bovendien werd een dissociatieconstante van 36 μM gevonden tussen het L2H2-4OTD-ligand en het i-motief. Deze waarde komt overeen met die van 31 μM gemeten door de gelverschuivingstest¹². Verder wordt de huidige techniek gebruikt om het i-motief te ontvouwen, dat het gechelateerde koper (I) kan blootstellen om een klikreactie te katalyseren. Dit protocol maakt het dus mogelijk om een grote set i-motiefstructuren met goedkope instrumenten in een redelijke tijd (korter dan 30 minuten) uit te vouwen. Aangezien de schuifkrachttechniek de doorvoer van de krachtspectroscopie drastisch verhoogt, noemen we deze techniek ensemblekrachtspectroscopie (EFS). Dit protocol heeft tot doel experimentele richtlijnen te geven om de toepassing van dit efs op basis van schuifkracht te vergemakkelijken.

Protocol

OPMERKING: Alle buffers en de chemische reagentia die in dit protocol worden gebruikt, worden vermeld in de tabel Materialen.

1. Voorbereiding van de schuifkrachtmicroscoop

OPMERKING: De schuifkrachtmicroscoop bestaat uit twee delen, een reactie-eenheid (homogenisator) en een detectie-eenheid (fluorescentiemicroscoop). De vergroting van het oculair is 10x en de vergroting van de objectieflens (lucht) is 4x.

1. Monteer de homogenisator en de microscoop op een montagetafel. Draag een bril en zet de fluorescentiemicroscoop aan en pas vervolgens de homogenisator aan om ervoor te zorgen dat de excitatielichtstraal van een geschikte golflengte (hier werd 488 nm gebruikt) door het midden van de dispergeerpunt van de homogenisator gaat.
2. Bereid een reactiekamer met platte bodem voor die 5 cm hoog is en 1,5 cm² x 1,5 cm² in doorsnede. Om de achtergrond te verminderen, moet u ervoor zorgen dat het geselecteerde kamermateriaal niet fluoresceert, zoals een bril (sommige kunststoffen hebben fluorescentie).
3. Kies een geschikte homogenisatordisperseerpunt die de gewenste schuifkracht kan leveren.
   OPMERKING: De afschuifsnelheid is afhankelijk van de afstand tussen de rotor en de stator bij een vaste roterende snelheid¹¹ volgens de volgende vergelijking:
   
   waarbij μ de dynamische viscositeit van water bij 20 °C is; D is de binnendiameter van de stator; d is de buitendiameter van de rotor en V is de schuifsnelheid (toerental/s).
4. Klem de reactiekamer op het monsterstadium van de fluorescentiemicroscoop en pas vervolgens de kamer aan om de dispergeerpunt van de homogenisator vast te houden (figuur 1). Zorg ervoor dat de dispergeerpunt zich iets boven (~ 1 mm) het onderste oppervlak van de reactiekamer bevindt.
5. Pas de verticale positie van de homogenisator en de kamer samen aan om ervoor te zorgen dat de focus van de microscoop op het oppervlak van de dispergeerpunt ligt. Pas vervolgens de horizontale positie van de dispergeerpunt aan om ervoor te zorgen dat het detectiegebied (gezichtsveld) is ingesteld tussen de rotor en de stator (figuur 1).
6. Schakel de fluorescentiekanalen in volgens de fluorescerende kleurstof die in het experiment is gebruikt.
7. Gebruik vóór het high-speed shearing experiment gedeïoniseerd (DI) water om het afschuiven te testen met een lage schuifsnelheid (bijv. 2.000 rpm) om ervoor te zorgen dat de dispergeerpunt op de juiste manier kan werken zonder de reactiekamer aan te raken.

2. I-motieven ontvouwen met en zonder liganden

1. Bereid een menselijk telomerisch i-motief-DNA (Tabel van Materialen) gelabeld met respectievelijk een kleurstof en een quencher aan de twee uiteinden in DI-water, zoals beschreven in Hu et ^al.11.
   OPMERKING: i-motief met volgorde: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA.
2. Verdun het DNA tot 5 μM in de 30 mM MES-buffer bij pH 5,5 of pH 7,4. Voeg aan de DNA-oplossing ligand L2H2-4OTD toe, dat werd gesynthetiseerd volgens Abraham Punnoose et ^al.13, in een concentratiebereik van 0-60 μM. Meng de oplossing voorzichtig gedurende 10 minuten om de i-motiefstructuren zonder licht te vouwen.
3. Controleer en minimaliseer de achtergrondfluorescentie-intensiteit van de reactiekamer die is gevuld met gedeïoniseerd DI-water met behulp van de fluorescerende microscoop zonder afschuiving. Een eenvoudige manier om de achtergrondfluorescentie te minimaliseren, is door de reactiekamer te wassen met DI-water. De achtergrondfluorescentiewaarde moet later in de data-analyses worden afgetrokken.
   OPMERKING: Strooilicht moet vanaf deze stap worden vermeden.
4. Stel de parameters van de CCD-camera in met behulp van de software. De aanbevolen parameters zijn als volgt: belichtingstijd = 0,5 s, CCD-gevoeligheid = 1600 en opnametijd = 20 min.
5. Voeg met behulp van een lange pipet de DNA-oplossing toe aan de lege en schone reactiekamer. Bedek de reactiekamer met een zwarte doos. Start vervolgens de homogenisator om af te scheren met een geselecteerde schuifsnelheid variërend van 9.724 s−1 tot 97.245 s⁻¹ (geselecteerd met behulp van de software die is gekoppeld aan de homogenisator) gedurende 20 minuten met de CCD-camera ingeschakeld om de gegevens vast te leggen.
6. Verwijder na het experiment de kamer en was deze met DI-water.

3. Schuifkracht-bediende klikreactie

1. Bereid i-motief DNA in DI water. Incubeer 10 μM i-motief DNA in 300 μL van 30 mM Tris buffer (pH 7,4) aangevuld met 150 μM CuCl en 300 μM ascorbinezuur gedurende 10 minuten om de i-motiefstructuren te vouwen (alle concentraties zijn eindconcentraties in de oplossing).
   OPMERKING: CuCl is de katalysator van de klikreactie. Ascorbinezuur voorkomt koper (I) oxidatie.
2. Ultrafiltreer de oplossing met een ultrafiltratieapparaat met een centrifugale kracht van 14.300 x g. Vul de oplossing aan tot ~500 μL met 30 mM Tris-buffer (pH 7,4) aangevuld met 300 μM ascorbinezuur na elke filtratie.
3. Herhaal de filtratie 3x.
4. Verzamel de restoplossing en maak een eindvolume van 300 μL door 30 mM Tris (pH 7,4) toe te voegen, aangevuld met 300 μM ascorbinezuur samen met 20 μM Calfluor 488 azide, 20 μM HPG en 10 μM TBTA. Zodra de reagentia zijn toegevoegd, verplaatst u de oplossing naar de donkere kamer.
   OPMERKING: Licht moet na deze stap worden vermeden.
5. Controleer en minimaliseer de achtergrondfluorescentie-intensiteit van de reactiekamer gevuld met DI-water met behulp van de microscoop vóór de afschuifexperimenten. Een eenvoudige manier om de achtergrondfluorescentie te minimaliseren, is door de reactiekamer te wassen met DI-water.
6. Voeg de DNA-oplossing met een lange pipet toe aan de lege reactiekamer en start vervolgens het afschuiven van de homogenisator met een afschuifsnelheid van 63.209 s−1 gedurende 20 minuten met de ^CCD-camera ingeschakeld.
7. Verwijder na het experiment de kamer en was deze met DI-water.

Results

Figuur 1 schetst de mechanische ontvouwing en real-time detectie van ensemblemoleculen in EFS. In figuur 1B werd waargenomen dat de fluorescentie-intensiteit van i-motif DNA toenam met de schuifsnelheid variërend van 9.724 s⁻¹ tot 97.245 s⁻¹ in een pH 5,5 MES-buffer. Als controle werd de fluorescentie-intensiteit niet verhoogd wanneer hetzelfde i-motief-DNA werd geschoren met een snelheid van 63.209 s⁻¹ in een pH...

Discussion

Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, maakt real-time onderzoek mogelijk van de ontvouwing van een ensembleset van biomoleculaire structuren door schuifkracht. De hier gepresenteerde resultaten onderstrepen dat DNA i-motiefstructuren kunnen worden ontvouwd door schuifkracht. Het ontvouwen van het ligandgebonden i-motief en de schuifkracht-aangedreven klikreacties waren proof-of-concept toepassingen voor deze ensemblekrachtspectroscopiemethode.

Figuur 1

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3K MWCO Amicon	Millipore Sigma	ufc900324
Ascorbinezuur	VWR	VWRC0143-100G
Calfluor 488 azide	Click Chemistry Tools	1369-1
CuCl	Thermo	ACRO270525000
Dispersie tip	Zwitserland	PT-DA07/2EC-B101
DNA oligo's	IDT
Kleurstof	IDT	/5Cy5/
Fluorescentiemicroscoop	Japan	Nikon TE2000-U
Homogenisator	Zwitserland	PT 3100D
HPG	Santa Cruz Biotechnology	cs-295271
KCl	VWR	VWRC26760.295
MES	VWR	VWRCE169-500G
Quencher	IDT	/3IAbRQSp/
TBTA	Tokyo Chemical Industry	T2993
Tris	VWR	VWRCE133-100G