Ensemble force spectroscopy (EFS) is een robuuste techniek voor mechanische ontvouwing en real-time detectie van een ensemble set van biomoleculaire structuren in biofysische en biosensing velden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ensemble Force Spectroscopie door Shear Forces
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Single-molecule technieken op basis van fluorescentie en mechanochemische principes bieden superieure gevoeligheid in biologische detectie. Vanwege het gebrek aan hoge doorvoermogelijkheden is de toepassing van deze technieken echter beperkt in de biofysica. Ensemblekrachtspectroscopie (EFS) heeft een hoge doorvoer aangetoond bij het onderzoek van een enorme reeks moleculaire structuren door mechanochemische studies van individuele moleculen om te zetten in die van moleculaire ensembles. In dit protocol werden de secundaire DNA-structuren (i-motieven) ontvouwd in de schuifstroom tussen de rotor en stator van een homogenisatorpunt met schuifsnelheden tot 77796/s. De effecten van stroomsnelheden en moleculaire groottes op de schuifkrachten die het i-motief ervaart, werden aangetoond. De EFS-techniek onthulde ook de bindingsaffiniteit tussen DNA i-motieven en liganden. Bovendien hebben we een klikchemiereactie aangetoond die kan worden geactiveerd door schuifkracht (d.w.z. mechano-klikchemie). Deze resultaten stellen de effectiviteit vast van het gebruik van schuifkracht om de conformatie van moleculaire structuren te regelen.
Inleiding
In single-molecule force spectroscopy1 (SMFS) zijn de mechanische eigenschappen van individuele moleculaire structuren bestudeerd door geavanceerde instrumenten zoals de atoomkrachtmicroscoop, optische pincetten en magnetisch pincetten 2,3,4. Beperkt door dezelfde directionaliteitseis van de moleculen in de krachtgenererende/detecterende opstellingen of het kleine gezichtsveld in een magnetisch pincet en de miniatuurcentrifugekrachtmicroscoop (MCF)5,6,7,8, kan slechts een beperkt aantal moleculen tegelijkertijd worden....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Alle buffers en de chemische reagentia die in dit protocol worden gebruikt, worden vermeld in de tabel Materialen.
1. Voorbereiding van de schuifkrachtmicroscoop
OPMERKING: De schuifkrachtmicroscoop bestaat uit twee delen, een reactie-eenheid (homogenisator) en een detectie-eenheid (fluorescentiemicroscoop). De vergroting van het oculair is 10x en de vergroting van de objectieflens (lucht) is 4x.
- Monteer de homogenisator en de microscoop op een montagetafel. Draag een bril en zet de fluorescentiemicroscoop aan en pas vervolgens de homogenisator aan om ervoor ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 schetst de mechanische ontvouwing en real-time detectie van ensemblemoleculen in EFS. In figuur 1B werd waargenomen dat de fluorescentie-intensiteit van i-motif DNA toenam met de schuifsnelheid variërend van 9.724 s−1 tot 97.245 s−1 in een pH 5,5 MES-buffer. Als controle werd de fluorescentie-intensiteit niet verhoogd wanneer hetzelfde i-motief-DNA werd geschoren met een snelheid van 63.209 s−1 in een pH.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, maakt real-time onderzoek mogelijk van de ontvouwing van een ensembleset van biomoleculaire structuren door schuifkracht. De hier gepresenteerde resultaten onderstrepen dat DNA i-motiefstructuren kunnen worden ontvouwd door schuifkracht. Het ontvouwen van het ligandgebonden i-motief en de schuifkracht-aangedreven klikreacties waren proof-of-concept toepassingen voor deze ensemblekrachtspectroscopiemethode.
Figuur 1
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Dit onderzoekswerk werd ondersteund door de National Science Foundation [CBET-1904921] en de National Institutes of Health [NIH R01CA236350] aan H.M.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbinezuur | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersie tip | Zwitserland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligo's | IDT | ||
| Kleurstof | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescentiemicroscoop | Japan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenisator | Zwitserland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
Referenties
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
