Methodenartikel

Isolatie en identificatie van watergedragen antibioticaresistente bacteriën en moleculaire karakterisering van hun antibioticaresistentiegenen

9.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63934

⸱

3 maart 2023

 , 
1Antimicrobial Research (AMR) Lab, Department of Biotechnology, University of Mumbai

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de isolatie en identificatie van antibioticaresistente bacteriën uit water en de moleculaire karakterisering van hun antibioticaresistentiegenen (ARGs). Het gebruik van op cultuur gebaseerde en niet-cultuurgebaseerde (metagenomische analyse) technieken biedt volledige informatie over de totale bacteriële diversiteit en de totale pool van verschillende ARGs aanwezig in zoet water uit Mumbai, India.

Samenvatting

De ontwikkeling en verspreiding van antibioticaresistentie (AR) via microbiota geassocieerd met zoetwaterlichamen is een groot wereldwijd gezondheidsprobleem. In de huidige studie werden zoetwatermonsters verzameld en geanalyseerd met betrekking tot de totale bacteriële diversiteit en AR-genen (ARGs) met behulp van zowel conventionele op cultuur gebaseerde technieken als een high-throughput cultuuronafhankelijke metagenomische benadering. Dit artikel presenteert een systematisch protocol voor de inventarisatie van de totale en antibioticaresistente kweekbare bacteriën uit zoetwatermonsters en de bepaling van fenotypische en genotypische resistentie in de kweekbare isolaten. Verder rapporteren we het gebruik van hele metagenomische analyse van het totale metagenomische DNA geëxtraheerd uit het zoetwatermonster voor de identificatie van de algehele bacteriële diversiteit, inclusief niet-kweekbare bacteriën, en de identificatie van de totale pool van verschillende ARGs (resistoom) in het waterlichaam. Volgens deze gedetailleerde protocollen hebben we een hoge antibioticaresistente bacteriebelasting waargenomen in het bereik van 9,6 × 10 5-1,2 × 109 CFU / ml. De meeste isolaten waren resistent tegen de meerdere geteste antibiotica, waaronder cefotaxime, ampicilline, levofloxacine, chlooramfenicol, ceftriaxon, gentamicine, neomycine, trimethoprim en ciprofloxacine, met meerdere antibioticaresistentie (MAR) -indexen van ≥0,2, wat wijst op hoge niveaus van resistentie in de isolaten. De 16S rRNA-sequencing identificeerde potentiële menselijke pathogenen, zoals Klebsiella pneumoniae, en opportunistische bacteriën, zoals Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. en Aeromonas spp. De moleculaire karakterisering van de isolaten toonde de aanwezigheid van verschillende ARGs, zoals blaTEM, blaCTX-M (β-lactams), aadA, aac (6')-Ib (aminoglycosiden) en dfr1 (trimethoprims), wat ook werd bevestigd door de hele metagenomische DNA-analyse. Een hoge prevalentie van andere ARGs die coderen voor antibioticum effluxpompen-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, het chlooramfenicol acetyltransferase gen catB10 en het rifampicineresistentiegen rphB- werd ook gedetecteerd in het metagenomisch DNA. Met behulp van de protocollen die in deze studie zijn besproken, hebben we de aanwezigheid van watergedragen MAR-bacteriën met verschillende AR-fenotypische en genotypische eigenschappen bevestigd. Zo kan hele metagenomische DNA-analyse worden gebruikt als een aanvullende techniek voor conventionele op cultuur gebaseerde technieken om de algehele AR-status van een waterlichaam te bepalen.

Inleiding

Antimicrobiële resistentie (AMR) is geïdentificeerd als een van de meest urgente wereldwijde problemen. De snelle ontwikkeling van AMR en de wereldwijde verspreiding ervan vormen een van de grootste bedreigingen voor de menselijke gezondheid en de wereldeconomie in termen van de gezondheidskosten die ermee gepaard gaan1. Het overmatig gebruik en misbruik van antibiotica hebben geleid tot een toename van AR. Dit is benadrukt door de COVID-19-pandemie, waarbij de behandeling van geassocieerde secundaire infecties in veel gevallen enorm werd aangetast als gevolg van AMR bij de getroffen patiënten2. Naast het directe gebruik/misbruik van antibiotica door mensen, zijn het overmatig gebruik en misbruik van antibiotica in de landbouw en de veehouderij en hun ongepaste lozing in het milieu, met inbegrip van waterlichamen, een grote zorg3. De opkomst van nieuwe resistentiekenmerken en multidrugresistentie bij bacteriën benadrukt dringend de behoefte aan een beter begrip van de factoren die leiden tot de ontwikkeling van AR en de verspreiding ervan. Meerdere antibioticaresistente bacteriën, die vaak meerdere AR-genen (ARG's) dragen op mobiele genetische elementen zoals plasmiden, kunnen deze resistentiegenen overbrengen naar niet-resistente micro-organismen, waaronder potentiële menselijke pathogenen, wat leidt tot de opkomst van superbacteriën die onbehandelbaar zijn met zelfs laatste redmiddel antibiotica4. Deze meerdere antibioticaresistente bacteriën, indien aanwezig in waterecosystemen, kunnen rechtstreeks de menselijke darm binnendringen via de consumptie van besmet voedsel op waterbasis, zoals vissen, krabben en weekdieren. Eerdere studies hebben aangetoond dat de verspreiding van AR-bacteriën in natuurlijk voorkomende watersystemen ook andere watervoorraden kan bereiken, waaronder drinkwater, en dus in de menselijke voedselketen kan terechtkomen 5,6,7.

Het doel van deze studie is om een uitgebreid protocol te bieden met behulp van een combinatie van op cultuur gebaseerde en niet-op cultuur gebaseerde (hele metagenomische analyse) technieken om volledige informatie te verkrijgen over de totale bacteriële diversiteit en de totale pool van verschillende ARGs aanwezig in een waterlichaam in Mumbai, India. Conventioneel zijn op cultuur gebaseerde technieken gebruikt om de bacteriële diversiteit in waterlichamen te bestuderen. Aangezien kweekbare micro-organismen slechts een klein percentage van de totale microbiota in elke niche uitmaken, moeten verschillende op cultuur gebaseerde en cultuuronafhankelijke technieken tegelijkertijd worden gebruikt om een beter begrip te krijgen van de algehele status van bacteriële diversiteit en de verschillende resistente eigenschappen die in elk monster voorkomen. Een van die robuuste en betrouwbare cultuuronafhankelijke technieken is hele metagenomische DNA-analyse. Deze high-throughput methode is met succes gebruikt in verschillende studies over bacteriële diversiteit of de functionele annotaties van verschillende ARGs 8,9. Deze techniek gebruikt het metagenoom (het totale genetische materiaal in een monster) als uitgangsmateriaal voor verschillende analyses en is dus cultuuronafhankelijk. De protocollen in deze studie kunnen worden gebruikt voor hele metagenomische DNA-analyse om informatie te verkrijgen over de totale bacteriële diversiteit en verschillende ARGs (resistoom) in watermonsters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Monsterverzameling en -verwerking

  1. Monsterverzameling
    1. Verzamel het juiste volume van het watermonster in steriele monstercontainer(s) en zorg ervoor dat niet meer dan 3/4 van de recipiënt is gevuld.
    2. Transporteer de monsters zo snel mogelijk na het verzamelen onder aseptische omstandigheden naar het laboratorium en verwerk ze onmiddellijk.
  2. Monsterverwerking
    1. Filter het watermonster aseptisch door een steriele mousselinedoek om eventuele deeltjes te verwijderen.
    2. Voer passende seriële verdunningen van het gefilterde water uit voor verdere analyse.

2. Schatting van de totale bacteriële belasting en het aantal antibioticaresistente bacteriën

  1. Bepaling van de totale bacteriële belasting
    1. Suspensie 18,12 g R2A Agar, gemodificeerd poeder in 1.000 ml dubbel gedestilleerd water en los het mengsel op door verhitting. Autoclaaf het opgeloste mengsel bij 121 °C, 15 psi gedurende 20 minuten. Bereid R2A Agar, Gemodificeerde platen voor door de juiste hoeveelheid van het geautoclaveerde mengsel in steriele petriplaten te gieten (voeg bijvoorbeeld ongeveer 20 ml geautoclaveerd steriel medium toe aan een steriele petriplaat van 90 mm).
    2. Verdeel gelijkmatig 100 μL van de juiste verdunningen van het gefilterde watermonster op de R2A Agar, gemodificeerde plaat zodra het medium stolt. Voer het experiment in tweevoud uit.
    3. Incubeer alle bovenstaande platen bij 35-37 °C gedurende 48 uur (varieer de temperatuur en incubatietijd afhankelijk van de media die voor isolatie worden gebruikt).
    4. Druk de totale bacteriële belasting uit in termen van kolonievormende eenheden per milliliter (CFU/ml) met behulp van vergelijking (1):
      figure-protocol-1(1)
  2. Bepaling van het aantal AR-bacteriën
    1. Volg de stappen 2.1.1-2.1.4. Gebruik echter in plaats van R2A Agar, gemodificeerde platen, R2A Agar, gemodificeerde platen afzonderlijk aangevuld met vijf verschillende antibiotica, namelijk cefotaxime (3 μg / ml), ciprofloxacine (0,5 μg / ml), erytromycine (20 μg / ml), kanamycine (15 μg / ml) en vancomycine (3 μg / ml).
    2. Voeg de antibiotica afzonderlijk toe in buisjes met 20 ml steriel gesmolten R2A Agar, Gemodificeerd (met de temperatuur van de gesmolten R2A Agar, Gewijzigd bij ≤40 °C) om de uiteindelijke antibioticaconcentratie zoals vermeld in stap 2.2.1 te bereiken.
    3. Draai voor gelijkmatig mengen en giet op steriele petriplaten voordat de agar stolt. Voer het experiment in tweevoud uit.
    4. Incubeer alle bovenstaande platen bij 35-37 °C gedurende 48 uur (bij gebruik van een ander medium kunnen de temperatuur en incubatietijd variëren).
    5. Voor kwaliteitscontrole en het controleren van de werkzaamheid van de antibiotica, verspreidt u 100 μL bacteriële suspensies van de Escherichia coli ATCC 25922 en Staphylococcus aureus ATCC 29213 stammen op hun respectieve antibioticabevattende R2A Agar, gemodificeerde platen (zorg ervoor dat de dichtheid van de verse cultuur die wordt gebruikt voor de inenting OD = 0,5 bij 600 nm is).
    6. Bepaal het antibioticaresistente aantal bacteriën in termen van CFU/ml zoals beschreven in stap 2.1.4.
  3. Glycerolvoorraden van de isolaten
    1. Selecteer morfologisch verschillende AR-kolonies.
    2. Suspensie een enkele geïsoleerde kolonie in 2 ml steriele Luria-Bertani-bouillon die het respectieve antibioticum bevat (bijv. Als een kolonie is geselecteerd uit een plaat met cefotaxime, ent u de kolonie vanaf stap 2.3.1 in steriele Luria-Bertani-bouillon die cefotaxime bevat in de respectieve concentratie).
    3. Incubeer de geënte buizen bij 37 °C bij 80 tpm totdat de OD600 0,5 bereikt.
    4. Bereid glycerolvoorraden van de isolaten door 750 μL van de kweeksuspensie uit stap 2.3.3 te mengen in 250 μL steriele 100% glycerol onder aseptische omstandigheden.
    5. Bewaar de glycerolvoorraden bij −80 °C tot verdere analyse.
      OPMERKING: Voor de heropleving van de culturen uit de glycerolbestanden, ontdooi de glycerolvoorraden bij 4 °C. Ent een lusvol van deze bouillon in 2 ml steriele Luria-Bertani-bouillon met het betreffende antibioticum en laat groeien.

3. Identificatie van kweekbare bacteriën door 16S rRNA-gensequencing

  1. Voorbereiding van DNA-sjabloon uit de isolaten voor PCR
    OPMERKING: Het beschreven protocol voor de voorbereiding van DNA-sjabloon voor PCR voor de isolatie van ruw DNA uit de bacteriën wordt gegeven door Carlson et al.10.
    1. Gebruik een steriele tandenstoker en neem een enkele, geïsoleerde, zuivere kolonie van het isolaat dat op een petriplaat groeit. Suspensie de bacteriekolonie in 100 μL steriel dubbel gedestilleerd water in een steriele microcentrifugebuis en kook gedurende 10 minuten.
    2. Centrifugeer de suspensie bij 10.000 × g gedurende 2 minuten om het vuil te pelleteren en breng het supernatant over naar een verse steriele microcentrifugebuis voor gebruik als de ruwe DNA-sjabloon.
  2. Gerichte PCR-amplificatie van het V3-gebied van het 16S-rRNA-gen en sequencing
    1. Bereid 40 μL van het reactiemengsel in een PCR-buis voor PCR-amplificatie, zoals vermeld in tabel 1.
      OPMERKING: Het DNA-preparaat moet worden uitgevoerd op een ijsblok terwijl de kans op besmetting wordt geminimaliseerd (draag handschoenen tijdens het hanteren van de reagentia en reinig het werkoppervlak grondig met 70% ethanol).
    2. Plaats de buis in het thermische blok en voer het juiste programma uit in de PCR thermische cycler. Zie tabel 2 voor de gestandaardiseerde PCR-cyclusomstandigheden en de primerinformatie voor de amplificatie van de V3-regio's van de 16S-rRNA-genen.
    3. Voor het oplossen van de amplicons en visualisatie, voer agarose gel elektroforese (AGE) uit. Meng 10 μL van het versterkte PCR-product en 2 μL 6x gellaadbuffer (tabel 3) en laad dit mengsel in putjes op 1,5% agarosegel (los 1,5 g agarosepoeder op in 100 ml 1x TAE-buffer [tabel 3]) met 5 μL ethidiumbromide (EtBr) tot een eindconcentratie van 0,5 μg/ml EtBr in 100 ml van de agarosegel.
      LET OP: EtBr is een krachtige kankerverwekkende stof. Handschoenen moeten te allen tijde worden gedragen tijdens het hanteren van EtBr en gels die EtBr bevatten.
    4. Voeg DNA-ladder toe voor de schatting van de grootte van de amplicons.
    5. Voer elektroforese van de gel uit in een TAE-tankbuffer bij 80-100 V.
    6. Zodra de trackingkleurstof 3/4 van de gel loopt, stopt u de elektroforese en visualiseert u de ampliconbanden onder een UV-transilluminator.
    7. Gebruik het PCR-product (amplicon) voor 16S rRNA-gensequencing om het isolaat te identificeren.
    8. Kwantificeer het amplicon door het te onderwerpen aan spectrofotometrische analyse met behulp van vergelijking (2).
      figure-protocol-2(2)
    9. Om de zuiverheid van het DNA te controleren, berekent u de verhouding van A260 / A280.
      OPMERKING: Idealiter moet dit aantal hoger zijn dan 1,5 en bij voorkeur tussen 1,8 en 2,0.
    10. Om de isolaten te identificeren, vergelijkt u de sequenties die worden verkregen met sequentiedatabases met behulp van een geschikte zoekfunctie voor uitlijning.

4. Detectie van antibioticaresistentie in de isolaten met behulp van antibioticagevoeligheidstests

OPMERKING: Dit protocol beschrijft de methode voor antibioticagevoeligheidstests (ASAT) door schijfdiffusie. De volgende antibioticaschijven werden gebruikt: cefotaxime (5 μg), ampicilline (10 μg), levofloxacine (5 μg), chlooramfenicol (30 μg), tigecycline (15 μg), ceftriaxon (30 μg), imipenem (10 μg), gentamicine (10 μg), neomycine (10 μg), trimethoprim (5 μg) en ciprofloxacine (5 μg).

  1. Bereiding van het entmateriaal voor de AST
    1. Ent op aseptische wijze een enkele, geïsoleerde, gezuiverde AR-kolonie in met behulp van een steriele lus in 2 ml van een steriel niet-selectief medium, zoals Luria-Bertani-bouillon (zonder antibioticum), en incubeer bij 37 °C bij 80 rpm 's nachts.
    2. Resuspenderen door 100-150 μL van de 's nachts gekweekte cultuur (ongeveer OD600 = 1,8-2,0) in 2 ml verse niet-selectieve Luria-Bertani bouillonmedium in te nemen en gedurende 2-4 uur incubeer (totdat de OD600 0,4-0,5 bereikt).
    3. Verdun deze vers gekweekte kweeksuspensie met steriele 0,85% zoutoplossing, zodat de dichtheid van de cultuur gelijk is aan de 0,5 McFarland-standaard (ongeveer OD600 = 0,1), wat ongeveer overeenkomt met 1-2 × 108 cellen / ml.
    4. Meng voorzichtig de bacteriële suspensie voor een gelijkmatige celverdeling.
    5. Gebruik de bovenstaande suspensie binnen 15 minuten na verdunning.
  2. Inenting van de agarplaten
    1. Bereid Mueller-Hinton Agar (MHA) platen voor het uitvoeren van de AST door 38 g MHA te mengen in 1.000 ml dubbel gedestilleerd water en los het mengsel op door verhitting. Autoclaaf het opgeloste mengsel bij 121 °C, 15 psi gedurende 15 min.
    2. Zorg ervoor dat de diepte van MHA in de platen 4 mm is (25 ml medium per plaat).
    3. Verwijder tegelijkertijd de antibioticaschijven uit de vriezer en verwarm ze tot kamertemperatuur.
      OPMERKING: De antibioticaschijven moeten geleidelijk worden ontdooid door de schijven in eerste instantie bij 4 °C en later bij kamertemperatuur te ontdooien om het mogelijke gevaar van condensatie op de schijven te verminderen, wat vervolgens de remzone (ZOI) kan beïnvloeden.
    4. Dompel onder aseptische omstandigheden een steriel wattenstaafje in het in stap 4.1 bereide entmateriaal en verwijder overtollige suspensie om overinenting van de platen te voorkomen.
    5. Verdeel de cultuur gelijkmatig over de platen, beginnend vanaf de bovenkant van de MHA-plaat en heen en weer gaand van rand naar rand. Draai de plaat 60° tijdens het vegen.
  3. Toepassing van de antibioticaschijven
    1. Breng met behulp van vlam-gesteriliseerde tangen aseptisch de antibioticaschijven over op de geënte MHA-platen en druk zachtjes op de schijven om volledig contact met de agar te garanderen.
      OPMERKING: Deze procedure moet worden uitgevoerd binnen 15 minuten na de inenting van de cultuur op de platen.
    2. Plaats het juiste aantal antibioticaschijven op de agarplaat door rekening te houden met het organisme, het gebruikte antibioticum en de grootte van de plaat om overlapping van de remzones te voorkomen.
      OPMERKING: Vier tot vijf schijven kunnen worden ondergebracht op een ronde plaat van 90 mm.
  4. Incubatie van de platen
    1. Binnen 15 minuten na het aanbrengen van de antibioticaschijven keert u de platen om en incubeert u bij 37 °C 's nachts.
  5. Interpretatie van de resultaten
    1. Meet de ZOI-diameter in millimeters (mm) en interpreteer volgens de breekpuntwaarden van EUCAST11. Zie de twee voorbeelden hieronder.
      1. Het breekpunt met de zonediameter (mm) voor een ciprofloxacine-antibioticaschijf (5 μg) voor Enterobacterales is S ≥ 25 en R < 22, wat betekent dat het als gevoelig (S) wordt beschouwd als ZOI 25 mm ≥, terwijl het resistent (R) is als ZOI 22 mm <. Als de ZOI-diameter tussen 22 en 25 valt, wordt het isolaat als intermediair (I) beschouwd.
      2. Het breekpunt met de zonediameter (mm) voor een chlooramfenicolantibioticumschijf (30 μg) voor Staphylococcus spp. is S ≥ 18 en R < 18, wat betekent dat het als gevoelig wordt beschouwd als ZOI 18 mm ≥, terwijl het resistent is als ZOI 18 mm <.
    2. Bepaal de multipele antibioticaresistentie (MAR) index door de verhouding te vinden van het aantal antibiotica waaraan het isolaat resistent is tot het totale aantal antibiotica waaraan het isolaat wordt blootgesteld.
      OPMERKING: Voor kwaliteitscontrole, E. coli ATCC 25922 en S. Aureus ATCC 29213 worden gebruikt als referentiestammen volgens het protocol zoals in stap 4.

5. PCR-gebaseerde detectie van antibioticaresistentiegenen in de isolaten

  1. Gebruik een standaard PCR-protocol voor de identificatie van ARGs in de isolaten. Bereid het DNA-sjabloon voor met behulp van het protocol in stap 3.1.
    OPMERKING: De PCR-cyclusomstandigheden die in dit onderzoek werden gebruikt, waren 94 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 35 cycli van 94 °C gedurende 30 s, gloeien gedurende 30 s bij de juiste temperatuur (zoals gestandaardiseerd voor elke primerset), verlenging bij 72 °C gedurende 40 s en een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 minuten. Het reactiemengsel is beschreven in tabel 4. De lijst met ARG's, primers en gloeitemperaturen is weergegeven in tabel 5.
  2. Volg de stappen 3.2.3-3.10 om de zuiverheid van de amplicons op te lossen, te visualiseren en te controleren.

6. Volledige metagenomische DNA-analyse voor de identificatie van de totale bacteriële diversiteit en de detectie van ARG's in het metagenoom

  1. Extractie van het totale DNA (metagenoom) uit het watermonster
    1. Haal het metagenomisch DNA uit de gefilterde watermonsters.
      OPMERKING: In de huidige studie werd het metagenomische DNA (totaal DNA) geëxtraheerd uit de gefilterde watermonsters met behulp van de DNA-isolatiekit waarnaar wordt verwezen volgens het protocol van de fabrikant (zie de tabel met materialen).
    2. Controleer de kwaliteit van het DNA door 3 μL van het geëxtraheerde metagenomische DNA op een 0,8% agarose-gel te laden en laat de gel ongeveer 30 minuten op 80-110 V lopen.
    3. Controleer op de aanwezigheid van een enkele intacte band.
    4. Controleer de DNA-concentratie met behulp van een fluorometer.
  2. Bepaling van bacteriële diversiteit en detectie van ARG's met behulp van hele metagenomische DNA-sequencing
    1. Bibliotheekvoorbereiding en PCR-versterking:
      1. Bereid een paired-end sequencing-bibliotheek voor met behulp van de dna-bibliotheekvoorbereidingskit waarnaar wordt verwezen (zie de materiaaltabel).
      2. Bereid het DNA voor op adapterligatie door 200 ng DNA te nemen en het mechanisch in kleinere fragmenten te scheren, gevolgd door een continue stap van eindreparatie waarbij een "A" wordt toegevoegd aan de 3 'uiteinden.
      3. Afhankelijk van het platform dat wordt gebruikt voor sequencing, ligate specifieke adapters aan beide uiteinden van de DNA-fragmenten.
        OPMERKING: Sequenties die cruciaal zijn voor het binden van bibliotheken met dubbele streepjescode aan een stroomcel voor sequencing zijn aanwezig in deze adapters. Dit maakt PCR-versterking van de adapter-geligeerde fragmenten mogelijk en bindt de standaard sequencing primers.
      4. Om de kwaliteit en kwantiteit te controleren, analyseert u de versterkte bibliotheek met behulp van een zeer gevoelige DNA-chip volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Clustergeneratie en -volgorde:
      1. Laad de versterkte bibliotheek op het juiste sequencingplatform voor clustergeneratie en daaropvolgende sequencing.
        OPMERKING: De bibliotheekmoleculen binden aan de complementaire adapter oligo's op de gepaarde stroomcel. Tijdens de sequencing worden de voorwaartse strengen selectief gesplitst na de resynthese van de omgekeerde streng. Deze gekopieerde omgekeerde streng wordt vervolgens gesequenced vanaf het andere uiteinde van het fragment.
    3. Bioinformatische analyse:
      1. Genereer steigers uit de hoogwaardige gegevens met behulp van het juiste platform.
      2. Onderwerp deze steigers aan bioinformatica-analyse voor de taxonomische classificatie en identificatie van de ARGs.
        OPMERKING: De workflow voor de gehele metagenomische DNA-analyse voor de identificatie van de totale bacteriële diversiteit en de detectie van ARG's in het metagenoom is weergegeven in figuur 1. Een stroomschema van de volledige methodologie beschreven in het manuscript is weergegeven in figuur 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Totale bacteriële belasting en antibioticaresistente (AR) bacterietelling
De inventarisatie van de totale bacteriële belasting werd uitgevoerd door 10−4 tot 10−6 maal verdunningen van de watermonsters te verspreiden op R2A Agar, gemodificeerd medium. Voor de inventarisatie van het aantal AR-bacteriën werden 10−3 tot 10−6-6-voudige verdunningen verspreid op mediaplaten die antibiotica bevatten (figuur 3). De totale en AR-bacterie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De monsterverzameling en -verwerking spelen een belangrijke rol en kunnen van invloed zijn op de resultaten en interpretatie van het onderzoek. Om variabiliteit in de monsters uit te sluiten, is het daarom belangrijk om monsters uit te voeren op meerdere locaties van het zoetwaterlichaam dat wordt bestudeerd. Het handhaven van de juiste aseptische omgevingsomstandigheden bij het hanteren van dergelijke monsters kan besmetting voorkomen. Om veranderingen in de bacteriële samenstelling te voorkomen die van invloed kunnen z...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiële subsidies van het Department of Science and Technology-Promotion of University Research and Scientific Excellence (DST-PURSE) Scheme van de Universiteit van Mumbai. Devika Ghadigaonkar werkte als Project Fellow onder de regeling. De technische hulp van Harshali Shinde, Senior Research Fellow onder het Department of Science and Technology-Science and Engineering Research Board (DST-SERB) Projectnummer: CRG/2018/003624, wordt erkend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 bp DNA ladderHimediaMBT049-50LNVoor schatting van de grootte van de amplicons
2x PCR Taq mastermixHiMediaMBT061-50RVoor het maken van PCR reactiemengsel
37 °C IncubatorGS-192, Gayatri ScientificNAVoor het incuberen van bacteriën
6x Gel Loading BufferHiMediaML015-1MLLading en tracking kleurstof die helpt om het DNA-monster te wegen en de voortgang van elektroforese te volgen
Agarose poederHimediaMB229-50GVoor het oplossen van amplicons tijdens Agarose Gel Electroforese (AGE)
Ampicilline antibioticum schijfHiMediaSD002Voor het uitvoeren van AST
AutoclaafEquitronNAVereist voor sterilisatie van media, glazen platen, testbuizen, enz.
Bioanalyzer 2100Agilent TechnologiesNAOm de kwaliteit en kwantiteit van de geamplificeerde bibliotheek te controleren
Biosafety B2 CabinetIMSETIMSET BSC-Class II Type B2Gebruikt voor microbiologisch werk zoals bacteriecultuur, AST enz.
Cefotaxime antibioticum schijfHiMediaSD295E-5VLVoor het uitvoeren van AST
Cefotaxime antibioticum poederHiMediaTC352-5GVoor de bereiding van antibioticum stockoplossing vereist tijdens isolatie van antibioticumresistente bacteriën
Ceftriaxon antibioticum schijfHiMediaSD065Voor het uitvoeren van AST
Centrifuge MinispinEppendorfMinispin Plus-5453Gebruikt om het puin te pellen tijdens ruwe DNA-voorbereiding
Chloramfenicol antibioticum schijfHiMediaSD006-5x50DSVoor het uitvoeren van AST
Ciprofloxacine antibioticum schijfHiMediaSD060-5x50DSVoor het uitvoeren van AST
Ciprofloxacine antibioticum poederHiMediaTC447-5GVoor de bereiding van antibioticum stockoplossing vereist tijdens isolatie van antibioticumresistente bacteriën
ColorimeterQuestNAVoor het controleren van de OD van cultuursuspensies
Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) databasefunctionele annotatie van ARG's; https://card.mcmaster.ca/
Cooling Shaker IncubatorBTL41 Allied ScientificNAVoor het incuberen van media platen voor het kweken van bacteriën
Deep Freezer (-40 °C) HaierDW40L, Haier BiomedicalsVoor het bewaren van glycerol stocks
DNA Library Prep KitNEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for IlluminaNAPaired-end sequencing bibliotheekvoorbereiding
EDTAHiMediaGRM1195-100GVoor de bereiding van Gel running buffer voor Agarose Gel Electroforese (AGE)
Elektroforese ApparatuurTechResource15 cm gel casting trayVoor het maken van de agarose gel  en het uitvoeren van elektroforese 
Elektroforese Power pack met elektrodenGeneiNAVoor het uitvoeren van de AGE 
Erytromycine antibioticum schijfHiMediaSD222-5VLVoor het uitvoeren van AST
Erytromycine antibioticum poederHiMediaCMS528-1GVoor de bereiding van antibioticum stockoplossing vereist tijdens isolatie van antibioticumresistente bacteriën
Erytromycine antibioticum poederHiMediaTC024-5GVoor de bereiding van antibioticum stockoplossing vereist tijdens isolatie van antibioticumresistente bacteriën
Escherichia coli ATCC 25922    HiMedia0335X-1Gebruikt als controle bij het uitvoeren van AST
Ethidium BromideHiMediaMB071-1GIntercalerend middel en visualisatie van DNA na elektroforese onder Gel Documentatie Systeem
FluorometerQubit 2.0NAVoor het bepalen van de concentratie van geëxtraheerd metagenomisch DNA
Gel Documentatie SysteemBioRadGebruikt voor het visualiseren van PCR amplicons na elektroforese
Gentamicine antibioticum schijfHiMediaSD170-5x50DSVoor het uitvoeren van AST
Glacial AzijnzuurHiMediaAS119-500MLVoor de bereiding van Gel running buffer voor Agarose Gel Electroforese (AGE)
GlycerolHiMediaGRM1027-500MLVoor het maken van glycerol stocks
Imipenem antibioticum schijfHiMediaSD073Voor het uitvoeren van AST
Kaiju DatabaseNANAVoor taxonomische classificatie van reads; https://kaiju.binf.ku.dk/
Kanamycine antibioticum schijfHiMediaSD017-5x50DSVoor het uitvoeren van AST
Kanamycine antibioticum poederHiMediaMB105-5GVoor de bereiding van antibioticum stockoplossing vereist tijdens isolatie van antibioticumresistente bacteriën
Levofloxacine antibioticum schijfHiMediaSD216-5VLVoor het uitvoeren van AST
Luria Bertani bouillonHimediaM1245-500GVoor verrijking van culturen
McFarland StandardsHimediaR092-1NoOm de dichtheid van cultuursuspensie te vergelijken
Moleculaire biologie waterHiMediaTCL018-500MLVoor het maken van PCR reactiemengsel
Mueller-Hinton Agar (MHA) HiMediaM173-500GVoor het uitvoeren van Antibiotische Gevoeligheidstest (AST)
Neomycine antibioticum schijfHiMediaSD731-5x50DSVoor het uitvoeren van AST
PCR Gradient Thermal CyclerEppendorfMastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz Gebruikt voor het uitvoeren van PCR voor amplificatie van

Referenties

  1. Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
  2. Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139(2021).
  3. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
  4. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
  5. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
  6. Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
  7. Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180(2019).
  8. Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
  9. de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592(2021).
  10. Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
  11. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. , Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022).
  12. Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
  13. Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350(2015).
  14. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
  15. Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  16. Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
  17. Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  18. Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173(2013).
  19. Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062(2022).
  20. Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
  21. Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356(2014).
  22. Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
  23. Ciesielczuk, H. Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , Queen Mary University of London. PhD thesis (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Watergedragen bacteri nmetagenomische DNA analysekweekgebaseerde technieken16S rRNA sequencingantibioticagevoeligheidstestenmeervoudige antibioticaresistentiezoetwatermicrobiotab ta lactamasegenen

Gerelateerde artikelen