Methodenartikel

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om microbiële kolonisatie en infectie in caenorhabditis elegans darmen te visualiseren

4.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63980

⸱

27 juli 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University, 2School of Biological Sciences, University of California, San Diego

In dit artikel

Samenvatting

Intestinale microben, waaronder extracellulaire bacteriën en intracellulaire pathogenen zoals het Orsay-virus en microsporidia (schimmels), worden vaak geassocieerd met wilde Caenorhabditis-nematoden . Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren en kwantificeren van microben die C. elegans-nematoden koloniseren en / of infecteren, en voor het meten van de pathogenenbelasting na gecontroleerde infecties in het laboratorium.

Samenvatting

De darmen van wilde Caenorhabditis-nematoden worden bewoond door een verscheidenheid aan micro-organismen, waaronder darmmicrobioombacteriën en pathogenen, zoals microsporidia en virussen. Vanwege de overeenkomsten tussen Caenorhabditis elegans en darmcellen van zoogdieren, evenals de kracht van het C. elegans-systeem , is deze gastheer naar voren gekomen als een modelsysteem om de interacties tussen gastheer en darmmicrobe in vivo te bestuderen. Hoewel het mogelijk is om sommige aspecten van deze interacties te observeren met bright-field microscopie, is het moeilijk om microben nauwkeurig te classificeren en de mate van kolonisatie of infectie te karakteriseren zonder nauwkeurigere hulpmiddelen. RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) kan worden gebruikt als een hulpmiddel om microben in nematoden uit het wild te identificeren en te visualiseren of om infectie experimenteel te karakteriseren en te kwantificeren in nematoden die zijn geïnfecteerd met microben in het laboratorium. FISH-sondes, die het zeer overvloedige ribosomale RNA met kleine subeenheden labelen, produceren een helder signaal voor bacteriën en microsporidische cellen. Sondes die zijn ontworpen om zich te richten op geconserveerde gebieden van ribosomaal RNA die veel soorten gemeen hebben, kunnen een breed scala aan microben detecteren, terwijl het richten op divergente gebieden van het ribosomale RNA nuttig is voor smallere detectie. Op dezelfde manier kunnen sondes worden ontworpen om viraal RNA te labelen. Een protocol voor RNA FISH-kleuring met paraformaldehyde (PFA) of acetonfixatie wordt gepresenteerd. PFA-fixatie is ideaal voor nematoden geassocieerd met bacteriën, microsporidia en virussen, terwijl acetonfixatie noodzakelijk is voor de visualisatie van microsporida-sporen. Dieren werden eerst gewassen en gefixeerd in paraformaldehyde of aceton. Na fixatie werden FISH-sondes geïncubeerd met monsters om de hybridisatie van sondes naar het gewenste doel mogelijk te maken. De dieren werden opnieuw gewassen en vervolgens onderzocht op microscoopglaasjes of met behulp van geautomatiseerde benaderingen. Over het algemeen maakt dit FISH-protocol detectie, identificatie en kwantificering mogelijk van de microben die de C . elegans-darm bewonen , inclusief microben waarvoor geen genetische hulpmiddelen beschikbaar zijn.

Inleiding

Caenorhabditis elegans is naar voren gekomen als een krachtig modelsysteem om aangeboren immuniteit en gastheer-microbe interacties in de intestinale epitheelcellen te bestuderen 1,2. Vanwege het hebben van een transparant lichaam en slechts 20 darmcellen, vertegenwoordigt C. elegans een handig systeem voor het monitoren van de processen van microbiële intestinale kolonisatie en infectie in de context van een intact organisme. Nematode darmcellen delen meerdere morfologische en functionele overeenkomsten met darmepitheelcellen van zoogdieren, waardoor ze een verhandelbaar in vivo model zijn voor dissectie van processen die microbioomkolonisatie en pathogene infectie regelen 3,4,5,6.

Wilde C. elegans voeden zich met een verscheidenheid aan microben die de darm koloniseren en infecteren, en bemonstering van deze nematoden heeft geresulteerd in de ontdekking van virussen, eukaryoten (schimmels, oomyceten) en bacteriën die van nature associëren met deze gastheer 7,8,9,10. Het Orsay-virus werd gevonden in de darm en is momenteel het enige bekende natuurlijke virus van C. elegans9. Microsporidia zijn schimmelgerelateerde obligate intracellulaire pathogenen die de meest voorkomende infectie zijn bij in het wild gevangen Caenorhabditis, waarbij verschillende soorten zijn ontdekt die C. elegans en verwante nematoden infecteren 8,11. Veel bacteriën worden vaak aangetroffen in het darmlumen van in het wild gevangen C. elegans en verschillende soorten zijn vastgesteld als een natuurlijk model voor het C. elegans microbioom (CeMbio)6,12,13,14. Het ontdekken en karakteriseren van microben die van nature C. elegans koloniseren en / of infecteren, is essentieel voor het begrijpen van de genetische mechanismen die deze gastheer-microbe-interacties regelen, evenals het visualiseren van nieuwe microbiële processen die alleen voorkomen in de context van een intact gastheerdier.

Na bemonstering worden wilde nematoden gescreend via differentiële interferentiecontrast (DIC) microscopie om te zoeken naar fenotypen die wijzen op infectie of kolonisatie. Veranderingen in het stereotiepe gegranuleerde uiterlijk van de darmcellen kunnen bijvoorbeeld worden geassocieerd met de aanwezigheid van een intracellulaire parasietinfectie8. In het bijzonder zijn het verlies van de darmkorrels en de verminderde cytosolische viscositeit tekenen van virale infectie, terwijl de reorganisatie van darmkorrels in 'groeven' kan wijzen op infectie met microsporidia in het geslacht Nematocida 8,9. Omdat er een grote verscheidenheid aan microben aanwezig is in wilde C. elegans-monsters, kan het moeilijk zijn om onderscheid te maken tussen microben door middel van DIC-microscopie. Informatie over de ruimtelijke verdeling van microben binnen de gastheer kan ook moeilijk te detecteren zijn vanwege de kleine omvang van veel microben15. Bovendien is het kweken van bepaalde microben van belang in vitro niet altijd mogelijk, wat leidt tot problemen bij detectie en / of kwantificering.

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) biedt een methode om microben fluorescerend te labelen door gebruik te maken van fluorescerende sondes die binden aan het RNA van de kleine ribosomale subeenheid (SSU) in vaste cellen. Als analyse van morfologische kenmerken een bepaalde klasse microben suggereert, kunnen FISH-sondes worden gebruikt die zich richten op specifieke of brede klassen van dergelijke microben. EUB338 wordt bijvoorbeeld beschouwd als een universele sonde voor de bacteriële SSU en wordt vaak gebruikt om een breed scala aan bacteriën te detecteren16. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van enkelstrengs DNA-sondes die zijn geëtiketteerd met een fluorofoor en specifiek zijn ontworpen om complementair te zijn aan de doel-SSU van de microbe van belang, hoewel er eerder ontworpen sondes beschikbaar zijn16. Het belangrijkste voordeel van het richten op de SSU van microben is de relatief grote overvloed van dit RNA, dat meestal 80% -90% van alle RNA in de cel omvat, wat leidt tot kleuring met een zeer hoge signaal-ruisverhouding17. Sondes kunnen ook worden ontworpen om zich te richten op RNA om virussen te detecteren, zoals het Orsay-virus 9,18, die vaak aanwezig zijn in zeer hoge kopieën in geïnfecteerde cellen als het virus zich actief repliceert.

Afhankelijk van de resultaten met bekende sondes, kan het nodig zijn om verdere sequentie-informatie te verkrijgen om meer specifieke sondes te ontwerpen voor soortbevestiging in situ. Een veel voorkomende aanpak is om universele primers te gebruiken tegen geconserveerde gebieden van de SSU (16S voor bacteriën en 18S voor eukaryoten) om (via PCR) regio's te versterken die meer uiteenlopen8. Met behulp van deze sequentie-informatie kunnen sondes met meer soortspecificiteit worden ontworpen. Deze FISH-sondes kunnen vervolgens de identificatie van microben op een cultuuronafhankelijke manier mogelijk maken8. Bovendien kan RNA FISH inzicht geven in unieke morfologische kolonisatie- en infectiekenmerken, waaronder filamentatie- of weefsellokalisatiepatronen19,20. Verschillende gekleurde FISH-sondes kunnen tegelijkertijd worden gebruikt, wat visueel onderscheid mogelijk maakt tussen microben in wilde nematodenmonsters, evenals observatie van microbe-microbe-dynamiek in een gastheer 15,20. Bovendien kan RNA FISH-kleuring worden toegepast op gastheer-pathogeeninteractiestudies waarbij infectie en kolonisatie van een bekende soort eenvoudig handmatig of via geautomatiseerde benaderingen kunnen worden gekwantificeerd om inzicht te geven in de pathogene belasting, bijvoorbeeld bij het vergelijken van C. elegans-mutanten die de weerstand tegen infectie hebben verhoogd of verlaagd21.

Protocol

OPMERKING: Nematoden kunnen worden gefixeerd met paraformaldehyde-oplossing (PFA) of aceton. PFA zorgt voor een betere visualisatie van morfologie dan aceton en kan signalen behouden van transgeen groen fluorescerend eiwit (GFP), dat wordt vernietigd door aceton. Acetonfixatie is echter noodzakelijk om microsporidische sporen te permeabiliseren om deze levensfase te kunnen labelen. Bovendien kan aceton handiger zijn dan PFA omdat het minder giftig is en monsters enkele dagen in aceton in een vriezer van -20 °C kunnen worden bewaard zonder dat het fixatiemiddel hoeft te worden verwijderd. Hieronder staan twee afzonderlijke protocollen, waarbij PFA-oplossing of aceton als fixatief wordt gebruikt. Voor een visualisatie van de protocolstappen, zie Figuur 1.

1. FISH-kleuring met PFA-fixatie

  1. Bereid nematoden voor met bijbehorende microben
    1. Kweek nematoden met de gewenste microbe van belang op standaard Nematode Growth Media (NGM) platen gezaaid met de juiste voedselbron. Incubeer de aaltjes bij 20 °C tot de gewenste levensfase is bereikt.
    2. Voeg 2 ml M9 minimale zouten media (42 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8,6 mM NaCl, 19 mM NH4Cl) + 0,1% Tween 20 tot NGM-platen met de Caenorhabditis-stam die geïnfecteerd of gekoloniseerd is met de gewenste microbe die moet worden gevisualiseerd.
      OPMERKING: De toevoeging van reinigingsmiddel is om te voorkomen dat nematoden aan pipetten en microfugebuizen blijven plakken en om pellet L1-L2 stadium nematoden te helpen. 0,1% Triton-X kan worden gebruikt in plaats van Tween 20.
    3. Pipetteer de nematoden uit de platen met behulp van een glazen Pasteur-pipet en -bol en breng ze over in gemarkeerde microfugebuizen van 1,5 ml.
      OPMERKING: Glazen pipetten hebben de voorkeur omdat nematoden aan plastic pipetten kunnen kleven, maar de toevoeging van reinigingsmiddel (Tween 20 of Triton-X) kan dit probleem minimaliseren.
    4. Draai met behulp van een microcentrifuge de monsters met de gekoloniseerde of geïnfecteerde nematoden op 2.000 x g gedurende 60 s voor L1-dieren, of 500 x g voor 60 s voor L4 of volwassen dieren. Alle volgende centrifugatiestappen worden uitgevoerd met de geselecteerde snelheid.
    5. Verwijder het supernatant uit de microfugebuizen met behulp van een pipet. Vermijd het verstoren van de nematodenkorrel door het supernatant voorzichtig tot 100 μL boven de pellet te verwijderen. Dit kan worden geschat met behulp van gemarkeerde 1,5 ml microfuge-buizen.
  2. Was nematoden om externe verontreiniging te elimineren
    1. Voeg 1 ml 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) + 0,1% Tween 20 (PBS-T) toe aan microfugebuizen.
    2. Draai de monsters in een microcentrifuge met de juiste snelheid (zie stap 1.1.4). Verwijder met een pipet op 100 μL na alles van het supernatant. Dit kan worden geschat met behulp van gemarkeerde 1,5 ml microfuge-buizen.
    3. Herhaal de bovenstaande twee stappen 2-3x.
      OPMERKING: Drie totale wasbeurten zijn meestal voldoende; er kunnen echter extra wasbeurten worden uitgevoerd om overtollige externe verontreiniging te verwijderen.
  3. Fix nematoden met PFA
    1. Voeg in de zuurkast 33 μL van 16% PFA toe aan de microfugebuis die 100 μL supernatant bevat boven de nematodenpellet verkregen uit stap 1.2.3 voor een eindconcentratie van 4% PFA.
      LET OP: PFA is een carcinogeen. Contact met PFA kan leiden tot huidsensibilisatie en irritatie en oogbeschadiging. PFA geeft giftige dampen af die kunnen leiden tot irritatie van de luchtwegen of sensibilisatie. Werk bij het gebruik van PFA in een zuurkast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en raadpleeg voor gebruik de juiste veiligheidsinformatiebladen.
    2. Incubeer de monsters met de nematoden gekoloniseerd of geïnfecteerd met de microbe van belang gedurende 30-45 minuten bij kamertemperatuur. Bewaar de monsters na incubatie in 70% ethanol bij 4 °C totdat het protocol klaar is om te worden voortgezet.
      OPMERKING: Een kortere incubatietijd is beter voor het handhaven van het GFP-signaal in transgene stammen als gevolg van de afbraak van GFP door PFA in de loop van de tijd. Langere incubatietijden zorgen ervoor dat het fixatief beter kan doordringen in de monsters. Het is het beste om de incubatietijd empirisch te bepalen, afhankelijk van het monster.
  4. Verwijder de PFA-oplossing
    1. Draai de monsters in een microcentrifuge met de juiste snelheid (zie stap 1.1.4). Verwijder met een pipet zoveel mogelijk van het supernatant zonder de pellet te verstoren.
      LET OP: Het supernatant bevat PFA, dat giftig is. Gooi het supernatant weg en minstens de eerste twee wast als giftig afval in een zuurkast.
    2. Voeg 0,5 ml PBS-T toe aan de monsters in de microfugebuizen.
    3. Volg en herhaal stap 1.4.1 en 1.4.2 2-3x met PBS-T.
      OPMERKING: Het uitvoeren van meer wasbeurten zal helpen het achtergrondsignaal te verminderen. In totaal worden minstens vier wasbeurten aanbevolen.
    4. Na de laatste wasbeurt draait u de monsters af en verwijdert u het supernatant, waarbij u de pellet ongestoord laat.
  5. Hybridisatiebuffer (HB) voorbereiden en de aaltjes wassen
    1. Bereid 1 ml HB (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 0,01% SDS) per monster.
      OPMERKING: HB moet voor elk gebruik vers worden bereid om neerslag te voorkomen. Een algemene buffer (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) kan echter van tevoren worden gemaakt en bij kamertemperatuur worden bewaard totdat HB nodig is. Bereid voor gebruik 1 ml per monster van de algemene buffer en voeg SDS toe aan een eindconcentratie van 0,01%.
    2. Voeg 800 μL HB toe aan de microfugebuizen die de nematodenkorrel bevatten. Pelleteer de monsters in de microcentrifuge (zie stap 1.1.4). Verwijder het supernatant zonder de pellet te storen.
  6. Hybridiseer de FISH-sonde tot de gewenste doelvolgorde
    1. Meng 100 μL per monster bereid HB met de gewenste FISH-sonde tot een eindconcentratie van 5-10 ng/μL sonde.
      OPMERKING: FISH-sondes zijn 15-23-mer oligo's, antisense tegen de SSU van de microbe van belang, en gelabeld met een gekleurde fluorofoor bevestigd aan het 5 'of 3' uiteinde (zie tabel 1 voor sondes die hier worden gebruikt). Over het algemeen worden stock FISH-sondes opgeslagen bij 1 mg / ml.
    2. Voeg 100 μL HB met FISH-sonde toe aan elk monster. Meng door de buizen voorzichtig te vegen of om te keren.
      OPMERKING: Verschillende gekleurde FISH-sondes kunnen tegelijkertijd worden toegevoegd om meerdere fluorescerende signalen in hetzelfde monster te visualiseren (zie figuur 1B).
    3. Incubeer de monsters een nacht (6-24 uur) in een droog bad bij 46-54 °C of een thermische menger bij 46-54 °C bij 1.200 tpm.
      OPMERKING: Incubatie bij 46-48 °C wordt meestal gebruikt voor hybridisatie. Het kan echter nodig zijn om deze temperatuur aan te passen, afhankelijk van de smelttemperatuur van de FISH-sonde. Over het algemeen ligt de hybridisatietemperatuur 4 °C onder de smelttemperatuur.
  7. Verwijder de FISH-sonde en was nematoden
    1. Bereid 3 ml wasbuffer (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01% SDS) per monster.
      OPMERKING: WB moet voor elk gebruik vers worden bereid om neerslag te voorkomen. Een algemene buffer (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) kan echter van tevoren worden gemaakt en bij kamertemperatuur worden bewaard totdat de wasbuffer nodig is. Bereid vóór gebruik 3 ml per monster van de algemene buffer en voeg EDTA toe aan een eindconcentratie van 5 mM en SDS aan een eindconcentratie van 0,01%.
    2. Centrifugeer de monsters met de juiste snelheid (zie stap 1.1.4). Verwijder de HB met een pipet, terwijl u voorzichtig bent om de nematodenpellet ongestoord te laten.
    3. Voeg 1 ml bereide WB toe aan elk monster.
    4. Centrifugeer de monsters met de juiste snelheid (zie stap 1.1.4). Verwijder de WB met een pipet, terwijl u voorzichtig bent om de pellet ongestoord te laten.
    5. Voeg 1 ml bereide WB toe aan elk monster.
    6. Incubeer de monsters gedurende 1 uur bij 48-56 °C in een droog bad (of thermische menger bij 48-56 °C bij 1200 tpm). Als u in een droog bad broedt, keert u de buizen voorzichtig om de 15-20 minuten.
      OPMERKING: Over het algemeen wordt 48 °C gebruikt als standaard wastemperatuur; het kan echter nodig zijn om deze temperatuur aan te passen als er een hoog achtergrondsignaal is. De wastemperatuur is vaak 2 °C hoger dan de hybridisatietemperatuur. De incubatietijd in WB kan worden verkort tot 30 minuten om de achtergrond verder te verminderen, waarna stap 1.7.4 en 1.7.5 moeten worden herhaald. Dit moet worden gevolgd door één (voor bacteriën) of twee (voor microsporidia sporoplasmata) incubatietijd van 30 minuten bij 48 °C.
    7. Centrifugeer de monsters met de juiste snelheid (zie stap 1.1.4). Verwijder met een pipet de wasbuffer, terwijl u voorzichtig bent om de pellet ongestoord te laten.
    8. Voeg 100-500 μL PBS-T toe aan elk van de monsters. Op dit punt kunnen de monsters maximaal een week in PBS-T bij 4 °C worden bewaard totdat het protocol klaar is om te worden voortgezet.
  8. Monteer de aaltjes
    1. Centrifugeer de monsters met de juiste snelheid (zie stap 1.1.4). Verwijder zoveel mogelijk PBS-T zonder de aaltjeskorrel te storen.
    2. (Optioneel) Voeg 20 μL antivetmontagemedium met DAPI (Table of Materials) toe aan de monsters.
    3. Laad een pipettor van 20 μL met een pipetpunt van 200 μL en gebruik een schaar om de punt van de pipet af te knippen zodat grotere nematoden kunnen worden gepipetteerd.
    4. Breng met de gesneden pipetpunt 5-10 μL van de pellet over op een microscoopglaasje. Dek af met een 22 x 22 coverslip. Om de dia's op te bergen, sluit u de randen van de coverslip af met nagellak en bewaart u ze in een donkere doos op 4 °C totdat ze klaar zijn voor verder gebruik.

2. FISH-kleuring met acetonfixatie

  1. Bereid nematoden voor met bijbehorende microben zoals beschreven in stap 1.1.
  2. Was nematoden om externe verontreiniging te elimineren zoals beschreven in stap 1.2.
  3. Fix nematoden met aceton
    1. Verwijder supernatant zonder de pellet te verstoren en voeg 1 ml aceton van laboratoriumkwaliteit toe aan het monster.
      LET OP: Aceton is een licht ontvlambare vloeistof en damp. Hoewel het zonder recept kan worden gekocht als nagellakremover, is het belangrijk om te onthouden dat aceton ernstige oogirritatie veroorzaakt en slaperigheid of duizeligheid kan veroorzaken.
    2. Incubeer de monsters die nematoden bevatten die gekoloniseerd of geïnfecteerd zijn met de microbe van belang gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na incubatie kunnen de monsters maximaal 2 weken in aceton bij -20 °C worden bewaard totdat het protocol klaar is om te worden voortgezet.
      OPMERKING: Gebruik dit protocol niet met transgene C. elegans-stammen die GFP (of de allelische gemuteerde vormen) tot expressie brengen als het gewenst is om de fluorescentie te behouden, omdat aceton dit signaal vernietigt.
  4. Verwijder de aceton
    1. Draai de monsters in een microcentrifuge met de juiste snelheid (zie stap 1.1.4). Verwijder met een pipet het supernatant zonder de pellet te storen.
      LET OP: Het supernatant bevat aceton. Gooi het supernatant weg en minstens de eerste twee wast als giftig afval in een zuurkast.
    2. Voeg 0,5 ml PBS-T toe aan de monsters in de microfugebuizen.
    3. Volg en herhaal stap 2.4.1 en 2.4.2 2-4x met PBS-T.
      OPMERKING: Het uitvoeren van meer wasbeurten zal helpen het achtergrondsignaal te verminderen. Het wordt aanbevolen om in totaal vier wasbeurten uit te voeren.
    4. Na de laatste wasbeurt draait u de monsters af en verwijdert u het supernatant, zodat de pellet ongestoord blijft.
  5. Bereid hybridisatiebuffer (HB) voor en was de aaltjes zoals beschreven in stap 1.5.
  6. Hybridiseer de FISH-sonde tot de gewenste doelsequentie zoals beschreven in stap 1.6.
  7. Fish-sonde verwijderen en aaltjes wassen
    1. Bereid 1,1 ml wasbuffer (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01% SDS) per monster.
      OPMERKING: WB moet voor elk gebruik vers worden bereid om neerslag te voorkomen. Een algemene buffer (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) kan echter van tevoren worden gemaakt en bij kamertemperatuur worden bewaard totdat een wasbuffer nodig is. Bereid vóór gebruik 1,1 ml per monster van de algemene buffer en voeg EDTA toe aan een eindconcentratie van 5 mM en SDS aan een eindconcentratie van 0,01%.
    2. Centrifugeer de monsters met de juiste snelheid (zie 1.1.4). Verwijder de HB met een pipet, terwijl u voorzichtig bent om de nematodenpellet ongestoord te laten.
    3. Voeg 100 μL bereide WB toe aan elk monster.
    4. Centrifugeer de monsters met de juiste snelheid (zie 1.1.4). Verwijder de WB met een pipet, terwijl u voorzichtig bent om de pellet ongestoord te laten.
    5. Voeg 1 ml bereide WB toe aan elk monster.
    6. Incubeer de monsters gedurende 1 uur bij 48-56 °C in een droog bad (of thermische menger bij 48-56 °C bij 1.200 tpm). Als u in een droog bad broedt, keert u de buizen voorzichtig om de 15-20 minuten.
      OPMERKING: Over het algemeen wordt 48 °C gebruikt als standaard wastemperatuur; het kan echter nodig zijn om deze temperatuur aan te passen als er een hoog achtergrondsignaal is. De wastemperatuur is vaak 2 °C hoger dan de hybridisatietemperatuur.
    7. Centrifugeer de monsters met de juiste snelheid (zie stap 1.1.4). Verwijder met een pipet de wasbuffer, terwijl u voorzichtig bent om de pellet ongestoord te laten.
    8. Voeg 100-500 μL PBS-T toe aan elk van de monsters. Op dit punt kunnen de monsters maximaal een week in PBS-T bij 4 °C worden bewaard totdat het protocol klaar is om te worden voortgezet.
  8. Monteer de aaltjes zoals beschreven in stap 1.8.

Resultaten

Voor het analyseren van microbioombacteriën werden specifieke en universele FISH-sondes tot bacteriële 16S gebruikt op in het wild geïsoleerde dieren. Wilde Caenorhabditis tropicalis stam (JU1848) werd bemonsterd uit het Nouragues bos in de buurt van een kleine rivier in Frans-Guyana van rottende palmboomvruchten22. Onder de differentiële interferentiecontrast (DIC) microscoop bleek deze nematodenstam gekoloniseerd te zijn met een bacterie die zich richtinggevend lijkt te hechten aan het darmepitheel (figuur 2A). JU1848 werd vervolgens selectief gereinigd om andere microbiële verontreinigingen te elimineren en te verrijken voor de gewenste aanhangende bacterie23. Met behulp van de universele PCR-methode werd de bacterie geïdentificeerd als een nieuwe soort in de Alphaproteobacteria-klasse. Een FISH-sonde gelabeld met Cal Fluor Red 610 werd vervolgens specifiek ontworpen voor de 16S-rRNA-sequentie van deze bacterie om fluorescerende visualisatie van kolonisatie binnen C. tropicalis mogelijk te maken (figuur 2B). Een universele 16S rRNA FISH-sonde die in staat is om vele soorten bacteriën (EUB338) te binden, werd gelabeld met 6-carboxyfluorescine (FAM) en werd ook aan dit monster toegevoegd. De groene en rode fluorescerende signalen overlappen elkaar volledig, wat suggereert dat de meeste bacteriën die de darmen koloniseren de aanhangende Alphaproteobacteria-bacterie zijn. Deze dieren werden gefixeerd in PFA voordat ze kleurden.

Voor het analyseren van experimentele infectie in het laboratorium met intracellulaire pathogenen van bekende identiteit, werden Orsay-virus- en microsporidian-specifieke FISH-sondes gebruikt op C. elegans met een wildtype achtergrond. Het Orsay-virus is een positief-streng RNA-virus uit de Nodaviridae-familie en de enige natuurlijke virale ziekteverwekker die wordt aangetroffen in C. elegans. Het bipartiete RNA-genoom van het Orsay-virus bestaat uit RNA1- en RNA2-segmenten en er zijn FISH-sondes ontwikkeld die zich op beide segmenten richten (figuur 3A, B) 9,18. In de darm wordt viraal RNA waargenomen door RIG-I homoloog DRH-124, dat nodig is voor activering van het transcriptionele verdedigingsprogramma genaamd de Intracellular Pathogen Response (IPR)25,26,27. De transcriptie van antivirale IPR-genen wordt ten minste gedeeltelijk gecontroleerd door de ZIP-1 transcriptiefactor21. Hier wordt de expressie van ZIP-1::GFP gelokaliseerd gezien in de darmkernen van cellen die positieve ORsay-virus FISH-kleuring in het cytoplasma vertonen (figuur 3A)21. Meerdere dieren gekleurd met Orsay-specifieke FISH worden getoond om de sterkte van dit signaal aan te geven voor eenvoudige kwantificering (figuur 3B). De in figuur 3A,B getoonde dieren werden gefixeerd in PFA.

De microsporidische parasiet genaamd Nematocida parisii, wat nematodendoder uit Parijs betekent, is een obligate intracellulaire ziekteverwekker van de darm. Verschillende FISH-sondes die 18S-rRNA van N. parisii labelen, zijn gebruikt, waaronder fluorescerend gelabelde MicroA- en MicroB-sondes. Meerdere dieren gekleurd met MicroB FISH worden getoond om de sterkte van dit signaal aan te geven voor eenvoudige kwantificering (figuur 3C). Bovendien is C. elegans geïnfecteerd door andere nauw verwante microsporidia. Co-infectie van N2 met N. parisii en de verwante N. ausubeli kan worden onderscheiden met behulp van dit FISH-protocol door soortspecifieke FISH-sondes te ontwerpen die met elkaar concurreren voor binding aan een divergent gebied op het 18S-rRNA (figuur 3D) 28. In dit voorbeeld heeft de N. parisii FISH-sonde een perfecte base-pairing met het N. parisii 18S rRNA, maar een 7 bp mismatch met N. ausubeli 18S rRNA. Het omgekeerde geldt voor de N. ausubeli-sonde. Als zodanig zal elke soortspecifieke FISH-sonde concurreren voor binding aan de verwante soort 18S ten opzichte van de niet-verwante soort. Bovendien zorgt het gebruik van DAPI om kernen te kleuren voor een betere lokalisatie van de infectie in de context van het hele dier, vooral voor de darm met grote, gemakkelijk identificeerbare kernen. Figuur 3C,D bevat dieren die in PFA zijn gefixeerd. Latere infecties met N. parisii resulteren in de ontwikkeling van meronts tot sporen. Om N. parisii-sporen te visualiseren, moeten de dieren in aceton worden gefixeerd omdat het de sporenwand beter binnendringt dan PFA (figuur 3E, F)8. De resulterende FISH-kleuring toont de kleine en grote staafvormige structuren, die waarschijnlijk overeenkomen met N. parisii-sporen, die zijn gekleurd met N. parisii-specifieke sondes in rood.

figure-results-1
Figuur 1: Visuele weergave van het FISH-protocol. Gemaakt met Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: FISH-kleuring van wilde C. tropicalis JU1848-stam gekoloniseerd met aanhechtende bacteriën in de darmen. (A) Nomarski-afbeelding met duizenden dunne bacillenbacteriën (bac) die zich richtinggevend binden aan de darm (in) van JU1848, waardoor een haarachtig fenotype in het lumen (lu) ontstaat. Dit figuurpaneel is een bewerking van Morgan, E. et al. (2021)23. (B) FISH-kleuring van JU1848, gefixeerd in PFA, met behulp van een rood gelabelde sonde (b002_16S_A-CF610) ontworpen om de 16S rRNA-sequentie van de aanhangende bacterie (boven) en een groen gelabelde universele FISH-sonde (EUB338-FAM) te richten die is ontworpen om de 16S bacteriën (onder) te targeten. DAPI-kleuring van gastheerkernen wordt in blauw weergegeven. Zie tabel 1 voor sondesequenties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: FISH-kleuring van C. elegans geïnfecteerd met intracellulaire pathogenen. (A,B) FISH-kleuring van C. elegans die ZIP-1::GFP tot expressie brengen en geïnfecteerd met het Orsay-virus, die werden gefixeerd met PFA voordat ze werden gekleurd om het GFP-signaal te behouden. Orsay 1 Red en Orsay 2 Red probes werden gebruikt voor pathogene kleuring. (A) Het samengestelde beeld bestaat uit samengevoegde rode en groene fluorescerende kanalen. Nucleaire ZIP-1::GFP-expressie wordt geïnduceerd bij Orsay-virusinfectie en wordt in het groen weergegeven. Autofluorescentie uit de darmkorrels wordt weergegeven in geel en aangegeven met gele pijlen. Stippellijnen schetsen het lichaam van de nematoden. Schaalbalk = 25 μm. (B) Het samengestelde beeld bestaat uit samengevoegde rode fluorescerende en DIC-kanalen. Schaalbalk = 200 μm. (C,D) FISH-kleuring van wild-type C. elegans geïnfecteerd met microsporidia die in PFA waren gefixeerd. (C) FISH-kleuring van met N. parisii besmette en in PFA gefixeerde wildtype C. elegans. MicroB-CF610 sonde werd gebruikt voor pathogene kleuring. Het samengestelde beeld bestaat uit samengevoegde rode fluorescerende en DIC-kanalen. Schaalbalk = 100 μm. (D) FISH-kleuring van wild-type C. elegans co-geïnfecteerd met N. parisii en N. ausubeli in de darm. De twee pathogenen werden samen gekleurd met behulp van een paar specifieke FISH-sondes die concurreren om binding aan hetzelfde gebied van het 18S-rRNA. N. parisii werd gekleurd met MicroF-CF610 (rood) en N. ausubeli werd gekleurd met MicroSp1A-FAM (groen). DAPI-kleuring van gastheerkernen wordt gezien in blauw. Schaalbalk = 25 μm. (E) FISH-kleuring met aceton-fixed wild-type C. elegans besmet met N. parisii sporen. MicroA-CF610 (rood) werd gebruikt voor kleuring (rood). Schaalbalk = 15 μm. (F) Nomarski-afbeelding met N. parisii-sporen gezien in (E). Schaalbalk = 15 μm. In (E) en (F) worden de kleine en grote staafvormige structuren gelabeld met respectievelijk kleine en grote pijlen die overeenkomen met N. parisii-sporen. Zie tabel 1 voor sondesequenties. De afbeelding in (A) is aangepast van Lažetić, V. et al. (2022)21. Afbeeldingen getoond in (B) en (C) zijn aangepast van Reddy, K. C. et al. (2019)26. Afbeeldingen getoond in (E) en (F) zijn aangepast van Troemel, E. R. et al. (2008)8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam van de sondeProbe specificiteitSonde fluorofoorProbe-sequentie
EUB338-FAMBacteriële 16S (universeel)5' 6-fluoresceïne (FAM)GCTGCCTCCCGTAGGAGT
b002_16S_A-CF610Alfaproteobacteriën 16SCal Fluor Rood 610 (CF610)TGTACCGACCCTTAACGTTC
Orsay1 RoodOrsay virus RNA1Cal Fluor Rood 610 (CF610)GACATATGTGATGCCGAGAC
Orsay2 RoodOrsay virus RNA2Cal Fluor Rood 610 (CF610)GTAGTGTCATTGTAGGCAGC
MicroA-CF610Nematocida Parisii 18SCal Fluor Rood 610 (CF610)CTCTGTCCATCCTCGGCAA
MicroB-CF610Nematocida Parisii 18SCal Fluor Rood 610 (CF610)CTCTCGGCACTCCTTCCTG
MicroF-CF610Nematocida Parisii 18SCal Fluor Rood 610 (CF610)AGACAAATCAGTCCACGAATT
MicroSp1A-FAMNematocida ausubeli 18S5' 6-fluoresceïne (FAM)CAGGTCACCCCACGTGCT

Tabel 1: Lijst van FISH-sondesequenties. Alle FISH-sondes werden commercieel gekocht met de fluorofoor bevestigd aan het 5'-uiteinde (via aangepaste oligonucleotidesynthese; zie Tabel van materialen) en de oligonucleotiden werden gezuiverd door reverse-phase HPLC.

Discussie

Wilde C. elegans worden van nature geassocieerd met een verscheidenheid aan microben. Onderzoekers kunnen RNA FISH gebruiken om deze microben te detecteren en te identificeren en inzicht te krijgen in hun lokalisatie in de context van een heel dier. Microben met wenselijke of interessante fenotypen kunnen via deze methode worden geïdentificeerd en vervolgens worden geïsoleerd voor verdere karakterisering en sequencing. De overvloed aan talrijke bacteriële isolaten van wilde C. elegans kan ook worden gekwantificeerd via RNA FISH29. Door gebruik te maken van het hier beschreven protocol, is het ook mogelijk om bekende micro-organismen in hun gastheren te observeren en meer te weten te komen over hun interacties. Belangrijk is dat het Orsay-virus en microsporidia obligate parasieten zijn en niet onafhankelijk van de gastheer kunnen worden gekweekt, dus FISH is de standaard visualisatietool. Kolonisatie of infectie kan ook worden gekwantificeerd via RNA FISH met behulp van nematoden gekweekt op platen bezaaid met een gewenste culturable bacteriën van belang. Naast het kleuren van micro-organismen in de darm van C. elegans, kan dit protocol worden gebruikt voor andere nematodenstammen zoals C. tropicalis of Oscheius tipulae19,23.

Het belangrijkste voordeel van het FISH-protocol is dat het een eenvoudige, snelle en robuuste methode biedt om microben geassocieerd met C. elegans te kleuren. Beelden geproduceerd door FISH-kleuring hebben een hoge signaal-ruisverhouding, die wordt bereikt door FISH-sondes te gebruiken die zich richten op het overvloedige RNA van de SSU in het monster. Omdat er meestal 30x of hogere niveaus van rRNA zijn dan rDNA, is het grootste deel van het signaal van FISH-kleuring met probes die zich richten op rRNA te wijten aan rRNA in plaats van rDNA30. Bovendien maakt RNA FISH het mogelijk om infectie of kolonisatie te zien binnen de context van het hele dier. Deze visualisatie wordt vergemakkelijkt door co-kleuring van gastheerkernen met DAPI en / of het gebruik van fluorescerend gemarkeerde stammen van C. elegans om de lokalisatie van infectie of kolonisatie in het monster beter te benadrukken. Microsporidian-specifieke FISH werd bijvoorbeeld gebruikt om het weefseltropisme van Nematocida-displodere te bepalen met behulp van een panel van C. elegans-stammen met GFP-expressie in verschillende weefsels20. Bovendien is dit protocol vatbaar voor veranderingen die onderzoekers in staat stellen om de ideale omstandigheden te bepalen die geschikt zijn voor hun specifieke behoeften (bijvoorbeeld het aanpassen van de fixatieperiode, het verhogen van de hybridisatietemperatuur).

Een cruciale stap in het FISH-protocol is het fixeren van de monsters. De incubatietijd na de toevoeging van het fixatiemiddel is noodzakelijk om het middel de tijd te geven om het monster te doordringen. Langere incubatietijden zijn niet ideaal voor monsters die transgene fluorescerende eiwitten bevatten als gevolg van eiwitafbraak door PFA in de loop van de tijd. Voor monsters die GFP bevatten, is het noodzakelijk om de optimale fixatietijd te bepalen om permeabilisatie mogelijk te maken, met behoud van het GFP-signaal.

FISH kan worden gebruikt om te kleuren voor bacteriën, virussen of microsporidia in C. elegans. Het beste type fixatief middel dat voor FISH wordt gebruikt, hangt echter af van de vereisten voor het monster en de stroomafwaartse behoeften. Dit protocol presenteert een PFA-oplossing als het primaire fixatieve middel om bacteriën en virussen te kleuren. PFA is echter niet voldoende voor de visualisatie van microsporidische sporen, omdat het de sporenwand niet kan binnendringen. Voor visualisatie van sporen moet in plaats daarvan aceton worden gebruikt. Hoewel PFA-fixatie efficiënt is voor FISH-etikettering van andere levensfasen van microsporidia, waaronder sporoplasmata, meronten en sporonts. Andere belangrijke verschillen worden gezien tussen acetonfixatie en PFA-fixatie; aceton is handiger omdat monsters na toevoeging snel in de vriezer kunnen worden bewaard, zonder dat het nodig is om te wassen. Aceton doodt echter snel elke bestaande GFP in een transgene gastheer. PFA heeft de voorkeur als fixatief als het belangrijk is om enkele fysiologische structuren in de gastheer te behouden, omdat aceton-gefixeerde dieren meer afgebroken lijken te zijn, waardoor identificatie van sommige weefsels moeilijker wordt. Omdat de monsters vast zijn, staat dit FISH-protocol geen live beeldvorming van gastheer-microbe-interacties in vivo toe. Een puls-chase infectietijdverloop gevolgd door FISH-kleuring van monsters op verschillende tijdstippen kan echter een zekere dynamiek van microbiële infectie zien 19,20,31.

Een andere cruciale stap in het protocol is het grondig wassen van de monsters voor en na hybridisatie. Vóór hybridisatie, bij het verzamelen van de wormen in de microfuge-buizen, kunnen overtollige bacteriën of andere microben van de NGM-platen met het wormmonster worden meegenomen. Drie wasbeurten met PBS-T zijn standaard; er kunnen echter meer wasbeurten nodig zijn om externe micro-organismen voldoende te elimineren, vooral bij gebruik van zwaar verontreinigde, in het wild geïsoleerde C. elegans. Bij het bekijken van de gemonteerde monsters na FISH, kan er een resterende FISH-sonde zijn die grote hoeveelheden signaal op de achtergrond van het monster produceert. De wastemperatuur en het aantal wasbeurten zijn belangrijk om de overtollige en niet-specifiek gebonden sonde te verwijderen. Om de achtergrondfluorescentie te verminderen, is het mogelijk om elke 30 minuten twee of drie wasbeurten uit te voeren met 1 ml WB, in plaats van één wasbeurt met 1 ml WB gedurende een uur. Verschillende FISH-sondes kunnen verschillende wastemperaturen vereisen. Meestal is de wastemperatuur 2 °C boven de hybridisatietemperatuur, maar dit kan worden verhoogd als er te veel achtergrondfluorescentie (hoog geluidsniveau) is.

Het FISH-protocol maakt gebruik van fluorescerende sondes die zijn ontworpen om zich te richten op soortspecifiek microbieel RNA, maar FISH-sondes kunnen worden ontworpen voor andere transcripties met hoge kopieën. Andere FISH-sondes kunnen verschillende smelttemperaturen hebben, dus incubatiestappen moeten mogelijk worden uitgevoerd bij een hogere of lagere temperatuur dan beschreven. FISH-kleuring kan de ruimtelijke verdeling van microbiële kolonisatie of infectie in de gastheer identificeren, waardoor de karakterisering van gastheer-microbe en microbe-microbe interacties mogelijk wordt. Een beperking is dat slechts een paar conventionele fluoroforen tegelijkertijd kunnen worden gebruikt, waardoor het aantal verschillende micro-organismen dat tegelijkertijd via FISH kan worden gedetecteerd, wordt verminderd. Dit beperkt het gebruik ervan voor complexe microbioomstudies in C. elegans. Multicolor rRNA-gerichte FISH maakt echter gebruik van sondes gelabeld met niet-canonieke fluoroforen die het aantal verschillende microbiële groepslabels kunnen verhogen15. Een andere beperking is dat het moeilijk is om onderscheid te maken tussen nauw verwante soorten, vooral bacteriën, die SSU-sequenties hebben die sterk op elkaar lijken. De extreme sequentieverschillen tussen microsporidiasoorten helpen echter om hun differentiatie met dit protocol te vergemakkelijken (figuur 3)32,33.

Over het algemeen beschrijft dit FISH-protocol een techniek om micro-organismen in C. elegans te detecteren. Het stelt onderzoekers in staat om een transparant en genetisch handelbaar modelsysteem te gebruiken om kolonisatie en infectie binnen de context van een intact dier te detecteren en te kwantificeren, en om uniek microbieel gedrag of morfologie binnen de gastheer te identificeren. Een preprint versie van dit manuscript werd geplaatst tijdens review34.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dank aan Dr. Marie-Anne Félix voor het verstrekken van wilde nematoden soorten. Dit werk werd ondersteund door NSF onder CAREER Grant 2143718 en California State University onder een CSUPERB New Investigator Award aan RJL, NIH onder R01 AG052622 en R01 GM114139 aan ERT, en door een American Heart Association Fellowship aan VL.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% SDSInvitrogenAM9822
AcetonFisher ScientificA-11-1
Antifade montageserum met DAPI (Vectashield)VectalabNC9524612
EDTAFisher ScientificS311-500
FISH-sondes (zie Tabel 1)LGC Biosearch TechnologiesFISH-sondes werden commercieel gekocht via aangepaste oligonucleotidesynthese
KClFisher ScientificP217
KH2PO4Fisher ScientificP-286
Na2HPO4Fisher ScientificS375-500
NaClFisher ScientificS-671
NH4ClFisher ScientificA-661
ParaformaldehydeElectron Microscopy Science50-980-487VOORZICHT: PFA is een carcinogeen. Dienovereenkomstig handelen
Thermische mixerEppendorf5384000020
Tris-baseFisher ScientificBP152
Triton X-100Fisher ScientificBP-151
Tween-20Fisher ScientificBP337-500

Referenties

  1. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).
  2. Balla, K. M., Troemel, E. R. Caenorhabditis elegans as a model for intracellular pathogen infection. Cellular Microbiology. 15 (8), 1313-1322 (2013).
  3. Dimov, I., Maduro, M. F. The C. elegans intestine: organogenesis, digestion, and physiology. Cell and Tissue Research. 377 (3), 383-396 (2019).
  4. Bossinger, O., Fukushige, T., Claeys, M., Borgonie, G., McGhee, J. D. The apical disposition of the Caenorhabditis elegans intestinal terminal web is maintained by LET-413. Developmental Biology. 268 (2), 448-456 (2004).
  5. Szumowski, S. C., Botts, M. R., Popovich, J. J., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. The small GTPase RAB-11 directs polarized exocytosis of the intracellular pathogen N. parisii for fecal-oral transmission from C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 8215-8220 (2014).
  6. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  7. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).
  8. Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6 (12), 2736-2752 (2008).
  9. Felix, M. A., et al. Natural and experimental infection of Caenorhabditis nematodes by novel viruses related to nodaviruses. PLoS Biology. 9 (1), 1000586(2011).
  10. Osman, G. A., et al. Natural infection of C. elegans by an oomycete reveals a new pathogen-specific immune response. Current Biology. 28 (4), 640-648 (2018).
  11. Zhang, G. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLOS Pathogens. 12 (12), 1006093(2016).
  12. Clark, L. C., Hodgkin, J. Commensals, probiotics and pathogens in the Caenorhabditis elegans model. Cell Microbiology. 16 (1), 27-38 (2014).
  13. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  14. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  15. Michael, L., Markus, S., Petra, P., Holger, D. A multicolor fluorescence in situ hybridization approach using an extended set of fluorophores to visualize microorganisms. Frontiers in Microbiology. 10, 1383(2019).
  16. Fuchs, B. M., et al. Flow cytometric analysis of the in situ accessibility of Escherichia coli 16S rRNA for fluorescently labeled oligonucleotide probes. Applied and Environmental Microbiology. 64 (12), 4973-4982 (1998).
  17. O'Neil, D., Glowatz, H., Schlumpberger, M. Ribosomal RNA depletion for efficient use of RNA-seq capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 4-19 (2013).
  18. Franz, C. J., et al. Santeuil and Le Blanc viruses primarily infect intestinal cells in Caenorhabditis nematodes. Virology. 448, 255-264 (2014).
  19. Tran, T. D., Ali, M. A., Lee, D., Luallen, R. J. Bacterial filamentation as a mechanism for cell-to-cell spread within an animal host. Nature Communications. 13 (1), 1-11 (2022).
  20. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLOS Pathogens. 12 (6), 1005724(2016).
  21. Lažetić, V., et al. et al The transcription factor ZIP-1 promotes resistance to intracellular infection in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 13 (1), 1-16 (2022).
  22. Félix, M. -A., et al. Species richness, distribution and genetic diversity of Caenorhabditis nematodes in a remote tropical rainforest. BMC Evolutionary Biology. 13 (1), 10(2013).
  23. Morgan, E., Longares, J. F., Félix, M. A., Luallen, R. J. Selective cleaning of wild Caenorhabditis nematodes to enrich for intestinal microbiome bacteria. Journal of Visualized Experiments. (174), e62937(2021).
  24. Sowa, J. N., et al. The Caenorhabditis elegans RIGI homolog DRH-1 mediates the intracellular pathogen response upon viral infection. Journal of Virology. 94 (2), 01173(2020).
  25. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLOS Pathogens. 10 (6), 1004200(2014).
  26. Reddy, K. C., et al. Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans. PLoS Pathogens. 15 (1), 1007528(2019).
  27. Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
  28. Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PloS One. 14 (4), 0216011(2019).
  29. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38(2016).
  30. Fu, R., Gong, J. Single cell analysis linking ribosomal (r)DNA and rRNA copy numbers to cell size and growth rate provides insights into molecular protistan ecology. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 64 (6), 885-896 (2017).
  31. Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
  32. Cuomo, C. A., et al. Microsporidian genome analysis reveals evolutionary strategies for obligate intracellular growth. Genome Research. 22 (12), 2478-2488 (2012).
  33. Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8 (1), 14023(2017).
  34. Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

RNA FISHdarmmicrobioomintestinale infectieparaformaldehydefixatieacetonfixatieFISH sondesinteracties tussen gastheer en microben
RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om microbiële kolonisatie en infectie in caenorhabditis elegans darmen te visualiseren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.