Onderling verbonden macroporeuze 3D-steigers van Microgel-staven

Samenvatting

Microgelstaven met complementaire reactieve groepen worden geproduceerd via microfluïdica met het vermogen om in waterige oplossing met elkaar te verbinden. De anisometrische microgels binden en verbinden zich tot stabiele constructies met grotere poriën in vergelijking met op bolvormige systemen gebaseerde systemen. Microgels gemodificeerd met GRGDS-PC vormen macroporeuze 3D-constructies die kunnen worden gebruikt voor celkweek.

Samenvatting

Een tweecomponentensysteem van gefunctionaliseerde microgels uit microfluïdica maakt snelle koppeling in 3D-macroporeuze constructies in waterige oplossingen mogelijk zonder verdere additieven. Continue gefoto-geïnitieerde on-chip gelation maakt variatie van de microgel-beeldverhouding mogelijk, die de eigenschappen van de bouwsteen voor de verkregen constructies bepaalt. Glycidylmethacrylaat (GMA) of 2-aminoethylmethacrylaat (AMA) monomeren worden gecopolymeriseerd in het microgelnetwerk op basis van polyethyleenglycol (PEG) sterpolymeren om epoxy- of aminefunctionaliteit te bereiken. Een focusoliestroom wordt in de microfluïdische uitlaatstructuur geïntroduceerd om een continue verzameling van de gefunctionaliseerde microgelstaven te garanderen. Op basis van een recente publicatie resulteren op microgelstaaf gebaseerde constructies in grotere poriën van enkele honderden micrometers en tegelijkertijd tot een algehele hogere stabiliteit van de steiger in vergelijking met een bolvormig model. Op deze manier is het mogelijk om constructies met een hoger volume te produceren met een vrijer volume en tegelijkertijd de benodigde hoeveelheid materiaal te verminderen. De onderling verbonden macroporeuze steigers kunnen worden opgepakt en vervoerd zonder schade of desintegratie. Amine- en epoxygroepen die niet betrokken zijn bij het onderling verbinden blijven actief en kunnen onafhankelijk worden gebruikt voor post-modificatie. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode voor de fabricage van microgelstaven om macroporeuze onderling verbonden steigers te vormen die kunnen worden gebruikt voor volgende celexperimenten.

Inleiding

Om complex gedrag van coöperatieve cellen in 3D-constructies te bestuderen, moeten steigerplatforms consistente prestaties in reproduceerbaarheid vertonen, een geschikte geometrie hebben voor celmigratie en tegelijkertijd een zekere flexibiliteit bieden in termen van parameterverandering om hun invloed op het levende weefsel te onderzoeken¹. In de afgelopen jaren heeft het concept van macroporeuze gegloeide deeltjes (MAP), voor het eerst beschreven door Segura et al., zich ontwikkeld tot een efficiënt en veelzijdig platform voor 3D-steigerproductie². De op maat gemaakte samenstelling van de microgels, die de bouwstenen zijn van de uiteindelijke 3D-steiger, definieert eigenschappen zoals de stijfheid van het construct, de selectieve chemische reactiviteit van het gelnetwerk en de uiteindelijke poriegrootte van de steiger 2,3,4,5,6. Cellijmpeptiden als aanwijzingen voor scaffold-celinteracties worden opgenomen in het polymeernetwerk van de microgels om celaanhechting mogelijk te maken en kunnen worden gevarieerd om hun specifieke effecten op cellen in cultuur te onderzoeken. De 3D-steigers worden gestabiliseerd door de gegloeide injecteerbare microgels onderling te koppelen als gevolg van covalente of supramoleculaire bindingen, wat resulteert in robuuste en gedefinieerde constructies voor celkweek 2,3,5,7,8.

Microfluïdica heeft zich gevestigd als een van de meest nauwkeurige en aanpasbare methoden voor de bereiding van gedefinieerde granulaire hydrogels⁹. De mogelijkheid om grotere hoeveelheden van de vereiste bouwstenen in een continu proces te produceren met behoud van hun chemische, mechanische en fysische monodispersiteit draagt aanzienlijk bij aan de geschiktheid van dit proces. Bovendien kunnen de grootte en vorm van de geproduceerde microgels worden gemanipuleerd door verschillende methoden zoals batch-emulsies, microfluïdica, lithografie, elektrodynamisch spuiten of mechanische fragmentatie, die de geometrie van de bouwstenen bepalen en dus de 3D-structuur van de uiteindelijke steiger ^1,10.

Onlangs is het concept van macroporeuze 3D-steigers die zijn samengesteld uit gefunctionaliseerde microgelstaven die snel met elkaar verbonden zijn in waterige oplossingen zonder verdere additieven gemeld¹¹. De anisotropie van microgelstaven resulteerde in hogere porositeiten en porieverdelingen met grotere poriegroottes in vergelijking met het gebruik van bolvormige microgels in deze studie¹¹. Op deze manier creëert minder materiaal grotere poriën met een verscheidenheid aan verschillende poriegeometrieën met behoud van de stabiliteit van de 3D-steiger. Het systeem bestaat uit twee soorten microgelstaven met complementaire primaire amine- en epoxyfunctiegroepen die binnen de onderling verbonden reactie worden verbruikt wanneer ze met elkaar in contact komen. De functionele groepen die niet deelnemen aan het interlinkingproces blijven actief en kunnen worden gebruikt voor selectieve postmodificatie met cellijmpeptiden of andere bioactieve factoren. Fibroblastcellen hechten, verspreiden en vermenigvuldigen zich wanneer ze in de 3D-steigers worden gekweekt, eerst op het microgeloppervlak groeien en de meeste macroporiën na 5 dagen vullen. Een voorlopige co-kweekstudie van menselijke fibroblasten en menselijke navelstreng endotheelcellen (HUVECs) toonde veelbelovende resultaten voor de vorming van vaatachtige structuren binnen de onderling verbonden 3D-steigers¹¹.

Protocol

1. Benodigd materiaal en preparaten voor microfluïdica

1. Gebruik voor de beschreven microfluïdische procedure 1 ml en 5 ml glazen spuiten en spuitpompen. On-chip druppelvorming wordt waargenomen via een omgekeerde microscoop uitgerust met een hogesnelheidscamera.
2. Maak het microfluïdische chipontwerp (figuur 1B) met behulp van computerondersteunde ontwerpsoftware en produceer een hoofdsjabloon zoals al gemeld¹².
3. Bereik gecontroleerde UV-bestraling met behulp van een zelfgeconstrueerde UV-LED (λ = 365 nm, spotdiameter ~ 4,7 mm) die bestralingssterkte biedt bij 957 mW / cm² door een 0,13 mm dik dekglas.
   LET OP: Houd rekening met mogelijke lokale warmteontwikkeling door de UV-LED tijdens de bestraling. Als dit het geval is, zorg dan voor voldoende koeling door externe luchtstroom.

2. Productie van microfluïdische apparaten

OPMERKING: De productie van microfluïdische apparaten is gebaseerd op een eerdere publicatie¹³.

1. Bereid 20 g van een mengsel van polydimethylsiloxaan (PDMS) van 10:1 (in massa) en uithardingsmiddel. Meng krachtig gedurende 3 min.
2. Meng 60 mg Olie Rood O in 2,0 g tolueen. Voeg 50 μL Olie Rood O in tolueenoplossing toe aan het PDMS-mengsel. Meng tot er een homogene kleurverdeling is om ongewenste lichtverstrooiing te verminderen en de spotgrootte gefocust te houden tijdens de gelatatie op de chip.
3. Verwijder de belletjes door het mengsel in een exsiccator te plaatsen die is uitgerust met een vacuümpomp.
4. Giet het PDMS-mengsel in de hoofdsjabloon tot een hoogte van 5-5,5 mm en ontgas opnieuw.
5. Laat de PDMS 18 uur bij kamertemperatuur uitharden om diazokleurstofafbraak te voorkomen.
6. Knip de PDMS-structuur uit en pons inlaat- en uitlaatgaten in de structuur met behulp van een lijnkernbemonsteringstool (0,77 mm binnendiameter, 1,07 mm buitendiameter).
7. Was het PDMS en bedek glas met isopropanol en gedeïoniseerd water herhaaldelijk 5x en verwijder vervolgens de vloeistof via lucht onder druk of stikstofstroom na elke wasstap.
8. Behandel het droge glas en PDMS samen in een plasmaoven op 0,2 mbar, met een zuurstofstroom van 20 ml / min gedurende 60 s bij 100 W, en sluit rechtstreeks aan om het glas en PDMS samen te binden om het microfluïdische apparaat te vormen.
   OPMERKING: Vermijd het buigen van de PDMS-structuur tijdens het bindingsproces om vervorming van de kanaalstructuur te minimaliseren.
9. Om de kanalen van de microfluïdische chip hydrofoob te maken, plaatst u het apparaat samen met 50 μL trichloor-(1H,1 H,2 H,2 H-perfluoroctyl)-silaan 's nachts in een exsiccator onder vacuüm (sluit de verbinding met de pomp na het verlagen van de dampdruk). Spoel de buitenkant van het apparaat af met fluorkoolwaterstof.
   LET OP: Voer deze stappen uit in een zuurkast en vermijd elk contact met het perfluorale silaan. Gebruik een glazen vacuümdesiccator afgedicht met vet. Reinig de exsiccator grondig voordat u deze voor andere doeleinden gebruikt.

3. Oplossingsvoorbereiding voor microfluïdica

1. Meng voor de continue oliefase paraffineolie en hexadecaan (1:1 v/v) en voeg 8% (g/g) van een niet-ionische oppervlakteactieve stof toe. Vul één glazen spuit van 1 ml (eerste olie, figuur 1) en één glazen spuit van 5 ml (tweede olie, figuur 1).
2. Bereid de prepolymeeroplossingen voor de dispersiefase in injectieflacons van bruin glas om foto-initiatorafbraak en onbedoelde gelatatie te voorkomen.
   1. Prepolymeeroplossing voor aminecomponenten die GRGDS-PC bevat
      1. Weeg voor een oplossing van 300 μL 33,3 mg ster-polyethyleenglycolacrylaat (sPEG-AC) en 3,03 mg lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP) af.
      2. Los 18,74 mg 2-aminoethylmethacrylaathydrochloride (AMA) op in 1,5 ml gedeïoniseerd water en laat de oplossing door een spuitfilter (poriegrootte van 0,20 μm) lopen.
         OPMERKING: AMA is hygroscopisch en moet worden weggegooid zodra de vaste stof klontjes in de opslagcontainer vormt.
      3. Bereid steriele 36 mM GRGDS-PC aliquots in water en bewaar bij −20 °C tot gebruik.
      4. Gebruik 291,7 μL van de AMA-oplossing om sPEG-AC en LAP op te lossen en voeg 8,3 μL van de GRGDS-PC-oplossing toe. Neem de oplossing op met een glazen spuit van 1 ml en bescherm tegen licht met aluminiumfolie.
   2. Epoxy component prepolymeer oplossing
      1. Weeg voor een oplossing van 300 μL 33,3 mg ster-polyethyleenglycol-acrylaat (sPEG-AC), 3,03 mg LAP en los op in 300 μL gedeïoniseerd water. Voeg 2,4 mg glycidylmethacrylaat (GMA) toe.
         OPMERKING: Krachtig schudden versnelt het oplossen van GMA. Neem de oplossing op met een glazen spuit van 1 ml en bescherm tegen licht met aluminiumfolie.

4. Productie en zuivering van gefunctionaliseerde microgelstaven van amine en epoxy

Figuur 1: Opstelling van de microfluïdische on-chip gelation assembly. (A) Vooraanzicht en schuin zicht van de componentopstelling tijdens microfluïdica. (B) Microfluïdisch chipontwerp dat wordt gebruikt voor on-chip gelation van microgelstaven. (1) PE-buis naar de eerste olie-inlaat. (2) Lichtbeschermde PE-buis naar de inlaat van de disperse fase. (3) PE-buis naar de tweede olie-inlaat. (4) PE-buis van de uitlaat naar de productverzamelingscontainer. (5) UV-lamp en bestralingslocatie op het rechte kanaal van 80 μm in de buurt van de uitlaat. (6) Microscoop objectief/observatiepositie. (7) Gekleurde PDMS-component van het microfluïdische apparaat. (8) Afdekglas dat aan het PDMS is verlijmd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Steek de naalden in de PE-buizen en verwijder het gas uit de spuit en de buis.
2. Steek een PE-buis in de uitlaat voor productverzameling.
3. Plaats alle glazen spuiten in de spuitpompen en steek elk uiteinde van de slang in de overeenkomstige inlaat (figuur 1).
   OPMERKING: Bescherm de prepolymeerbuis tegen licht via aluminiumfolie of een zwarte buis om onbedoelde gelatatie te voorkomen.
4. Richt de microscoop op de olie-waterdoorsnede.
5. Start de eerste oliespuitpomp (debiet = 100-200 μL/h) om het kanaal eerst met olie te vullen om bevochtiging van het kanaal door de dispersiefase te voorkomen.
6. Verlaag het eerste oliedebiet tot 30 μL/h en start de pomp van de prepolymeerspuit (debiet = 100-200 μL/h) totdat de gedispergeerde waterige fase bij de doorsnede kan worden waargenomen.
7. Stel het prepolymeerdebiet in op 30 μL/h en richt de microscoop op de uitlaat.
8. Start de tweede oliespuitpomp (debiet van 300 μL/h) en wacht tot het stroomregime stabiel is.
9. Plaats de uitlaatbuis in een opvangbak.
   OPMERKING: Plaats het uiteinde van de buis in het bovenste deel van de container om een drukverhoging als gevolg van de accumulatie van het product in de loop van de tijd te voorkomen.
10. Stel het UV-bestralingssysteem zo in dat de instralingssterkte in het bereik van 900-1000 mW/cm² ligt (gebruikte bestralingssterkte = 957 mW/cm²) en de bestralingsplek zich in het rechte kanaalgedeelte vóór de uitlaat bevindt (figuur 1B).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u niet in de buurt van de olie-waterdoorsnede bestraalt om te voorkomen dat het kanaal verstopt raakt. Voor extra bescherming, bedek de kanaalstructuren voorafgaand aan de bestralingsplek op de bovenkant van de eenheid.
11. Pas vóór UV-bestraling de stroomsnelheden van het prepolymeer en de eerste olie aan om de gewenste beeldverhouding in het bereik van 3,0 tot 4,5 te bereiken en stel de bestralingstijd van de gedispergeerde fase in op ~ 2,3 s, afhankelijk van de grootte van de bestralingsplek.
12. Start uv-bestraling en pas indien nodig de stroomsnelheden opnieuw aan volgens de vorige subsectie.
    OPMERKING: Observeer de productie aan het begin en controleer op stabiel stromingsgedrag in de uitlaat en de uniformiteit van de microgelstaven. De tweede oliestroom kan worden aangepast om het producttransport binnen de uitlaat te optimaliseren.
13. Wijzig de verzamelcontainer en noteer de begintijd en stroomsnelheden van de productverzameling.
    OPMERKING: Bescherm het product tegen stof. Stop met verzamelen voordat een spuit bijna leeg is.
14. Als u de verzameling wilt beëindigen, verwijdert u de verzamelcontainer en noteert u de tijd. Stop de bestraling en alle spuitpompen.
15. Was het product vervolgens 5x elk met n-hexaan, isopropanol en gedeïoniseerd water. Verwijder het supernatant na bezinking van de staaf.
    OPMERKING: Dispergeer het product na elke toevoeging van de oplossing zorgvuldig en wacht 10 minuten voordat u het oplosmiddel vervangt, rekening houdend met moleculaire diffusie. Vervang de isopropanol geleidelijk door water om te voorkomen dat de staven naar het oppervlak van de vloeistof drijven. Meerdere extra wasstappen met water verminderen de resterende isopropanolsporen.

5. Macroporeuze steigervorming

1. Bepaal het aantal microgelstaven per dispersievolume voor de epoxy- en amine-gefunctionaliseerde monsters.
2. Pas het aantal gefunctionaliseerde epoxy- en aminemonsters door verdunning of concentratie aan tot een vergelijkbare waarde tussen 1.000-5.000 staafjes/100 μL.
   OPMERKING: Gebruik een centrifuge van ~ 2.000 x g gedurende 5-10 s om de sedimentatie van de microgelstaven te versnellen. Als het aantal staven per dispersievolume laag is, kan staaf-interlinking resulteren in kleinere staafclusters in plaats van één stabiele constructie. Als het aantal staven per dispersievolume hoog is, komt de mengkwaliteit van de twee componenten in het gedrang.
3. Breng de eerste component (~ 1.200 staafjes) dispersie over in een conische transparante injectieflacon van 1,5 ml of 2 ml.
4. Voeg de tweede component op een gecontroleerde manier toe in een continue bewerking (100 μL pipet). Meng na toevoeging de inhoud direct met behulp van de pipet om vloeistof op te nemen en voeg deze opnieuw toe. De onderling verbonden structuur vormt zich binnen enkele seconden tijdens het mengen.
   OPMERKING: Als er meerdere clusters ontstaan in plaats van één coherente structuur, controleer dan opnieuw het aantal microgelstaven per volume of zorg voor een meer gecontroleerde menging van de twee componenten.

6. Cellijm na modificatie

1. Bereken het theoretische aantal epoxygroepen in de onderling verbonden structuur op basis van de stroomsnelheid van de gedispergeerde polymeerfase, het aantal microgels dat gedurende een bepaalde tijd is verzameld en de verdunningsfactor van de microgeldispersie die wordt gebruikt voor de vorming van steigers.
   OPMERKING: Benader het theoretische aantal epoxygroepen per steiger met de volgende vergelijking.
   
   
   n_th: Theoretische hoeveelheid stof
   c_GMA: GMA-concentratie in prepolymeeroplossing
   V: Debiet van prepolymeeroplossing
2. Voeg GRGDS-PC-oplossing toe aan de onderling verbonden structuur om alle resterende epoxygroepen te wijzigen met het cellijmpeptide met een vrije amine en thiol (n [theoretische epoxygroepen]/n[GRGDS-PC] = 1). Laat een nacht op kamertemperatuur staan.
3. Verwijder de niet-gereageerde moleculen door te wassen met gedeïoniseerd water en het supernatant te verwijderen.

7. Sterilisatie en overdracht naar celkweekmedia

1. Verlaag het waterniveau om de onderling verbonden steiger onder te dompelen.
2. Open de injectieflacon en bestraal met UV-licht van λ = 250-300 nm. Sluit de injectieflacon en breng de injectieflacon over op een schone bank. Was 1x met steriel water.
3. Vervang het water in de injectieflacon door celkweekmedia en laat gedurende 5 minuten equilibratie toe. Herhaal dit met verse celkweekmedia 2x.
4. Breng de macroporeuze steiger over in een celkweekputplaat voor het experiment door een spatel te gieten of te gebruiken.

  

Resultaten

Figuur 2: Macroporeuze crosslinked scaffold structuur. (A) 3D projectie van een 500 μm confocale microscopie Z-stack van de onderling verbonden macroporeuze steiger. Schaalbalk vertegenwoordigt 500 μm. (B) Onderling verbonden steiger bestaande uit ~ 10.000 microgelstaven op een afdekglas dat rechtstreeks uit water i...

Discussie

Een van de kritieke stappen in dit protocol is de kwaliteit van het 2-aminoethylmethacrylaat (AMA) dat wordt gebruikt als comonomeer voor primaire aminefunctionalisatie. De AMA moet een fijnkorrelig en bij voorkeur kleurloos poeder zijn dat wordt afgeleverd in een gasdichte bruine glazen container. Men moet het gebruik van groenachtig en klonterig materiaal vermijden, omdat het de gelation-reactie aanzienlijk schaadt en de reproduceerbaarheid van de resultaten negatief beïnvloedt. In het geval van slechte gelatatie en on...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ABIL EM 90	Evonik	144243-53-8	niet-ionogene oppervlakteactieve stof
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride	TCI Chemicals	A3413	>98,0%(T)(HPLC)
8-Arm PEG-acrylate 20 kDa	Biochempeg Scientific Inc.	A88009-20K	≥ 95 %
AutoCAD 2019	Autodesk		computerondersteund ontwerp (CAD) software; modellering van microfluïdische ontwerpen
CHROMAFIL MV A-20/25 spuitfilter	CHROMAFILCarl Roth GmbH+Co.KG	XH49.1	poriëngrootte 0,20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV)
Dekglas	Marienfeld-Superior		type Nr. 1
EMS Swiss line kernbemonsteringsgereedschap 0,75 mm	Electron Microscopy Sciences		0,77 mm binnendiameter, 1,07 mm buitendiameter
Ethanol absolut	VWR Chemicals
FL3-U3-13Y3M 150 FPS serie hogesnelheidscamera	FLIR Systems
Fluoresceïneamine isomeer I	Sigma-Aldrich	201626
Fluoresceïne isothiocyanate	Thermo Fisher Scientific	46424
25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm naalden	BD Microlance 3
Glycidyl methacrylate	Sigma-Aldrich	779342	≥97,0% (GC)
GRGDS-PC	CPC Scientific	FIBN-015A
Hamilton 1000 Series Gastight spuiten	Thermo Fisher Scientific	10772361/10500052	PFTE Luer-Lock
Hexaan	Sigma-Aldrich	1,04,367
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat	Sigma-Aldrich	900889	≥95 %
Motic AE2000 trinocular microscoop	Ted Pella, Inc.	22443-12
Novec 7100	Sigma-Aldrich	SHH0002
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O9755
Paraffine	VWR Chemicals	24679320
Pavone Nanoindenter Platform	Optics11Life
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Polyethyleenbuis 0,38×1,09mm medisch	dropletex		ID 0,38 mm OD 1,09 mm
2-Propanol	Sigma-Aldrich	190764	ACS reagent, ≥99,5%
Protein LoBind buizen	Eppendorf	30108132
Pump 11 Pico Plus Elite programmeerbare spuitpomp	Harvard Apparatus
RPMI 1640 medium	Gibco	11530586
SYLGARD 184 siliconenkit	Dow SYLGARD	634165S
Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silaan	Sigma-Aldrich	448931
UVC LED sterilisatiebox	UVLED Optical Technology Co., Ltd.	9S SZH8-S2