Methodenartikel

Uitbreiding van het begrip van de tumormicro-omgeving met behulp van massaspectrometrie Beeldvorming van formaline-vaste en paraffine-ingebedde weefselmonsters

DOI:

10.3791/64015

⸱

29 juni 2022

 ,  ,  , 
1Department of Translational Molecular Pathology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het tijdperk van kankerimmunotherapie is de interesse in het ophelderen van de micro-omgevingsdynamiek van tumoren opvallend toegenomen. Dit protocol beschrijft een massaspectrometrie beeldvormingstechniek met betrekking tot de kleurings- en beeldvormingsstappen, die een zeer gemultiplexte ruimtelijke analyse mogelijk maken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vooruitgang in immuungebaseerde therapieën heeft een revolutie teweeggebracht in de behandeling en het onderzoek van kanker. Dit heeft geleid tot een groeiende vraag naar de karakterisering van het tumorimmuunlandschap. Hoewel standaard immunohistochemie geschikt is voor het bestuderen van weefselarchitectuur, is het beperkt tot de analyse van een klein aantal markers. Omgekeerd kunnen technieken zoals flowcytometrie meerdere markers tegelijkertijd evalueren, hoewel informatie over weefselmorfologie verloren gaat. In de afgelopen jaren zijn multiplexstrategieën die fenotypische en ruimtelijke analyse integreren naar voren gekomen als uitgebreide benaderingen van de karakterisering van het tumorimmuunlandschap. Hierin bespreken we een innovatieve technologie die metaalgelabelde antilichamen en secundaire ionenmassaspectrometrie combineert, gericht op de technische stappen in de ontwikkeling en optimalisatie van de test, weefselvoorbereiding en beeldacquisitie en -verwerking. Vóór het kleuren moet een met metaal gelabeld antilichaampaneel worden ontwikkeld en geoptimaliseerd. Dit hi-plex beeldsysteem ondersteunt tot 40 met metaal gelabelde antilichamen in een enkele weefselsectie. Van belang is dat het risico op signaalinterferentie toeneemt met het aantal markers in het paneel. Na het ontwerp van het paneel moet bijzondere aandacht worden besteed aan de toewijzing van de metaalisotoop aan het antilichaam om deze interferentie te minimaliseren. Voorlopige paneltests worden uitgevoerd met behulp van een kleine subset antilichamen en vervolgens testen van het hele paneel in controleweefsels. Formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsecties worden verkregen en gemonteerd op goudgecoate dia's en verder gekleurd. De kleuring duurt 2 dagen en lijkt sterk op standaard immunohistochemische kleuring. Zodra monsters zijn gekleurd, worden ze in het beeldacquisitie-instrument geplaatst. Weergavevelden worden geselecteerd en afbeeldingen worden verkregen, geüpload en opgeslagen. De laatste fase is beeldvoorbereiding voor het filteren en verwijderen van interferentie met behulp van de beeldverwerkingssoftware van het systeem. Een nadeel van dit platform is het ontbreken van analytische software. De gegenereerde afbeeldingen worden echter ondersteund door verschillende computationele pathologiesoftware.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het belang van de talrijke celtypen rond klonale tumorpopulaties is een cruciaal element in de categorisering van carcinogenese. De interesse in het ophelderen van deze tumor micro-omgeving (TME) samenstelling en interacties is voortdurend toegenomen na de oprichting van immuungebaseerde therapie als onderdeel van het arsenaal voor kankerbehandeling. Daarom zijn de behandelingsstrategieën verschoven van een tumorcentrische benadering naar een TME-centrischebenadering 1.

Pogingen om de rol van immuuncellen in tumorsurveillance en kankerontwikkeling op te helderen, zijn de afgelopen jaren opvallend toegenomen 2,3. In medisch onderzoek ontstond een overvloed aan methoden, waaronder op cytometrie gebaseerde methoden en singleplex- en multiplex beeldvormingstechnologieën, als onderdeel van deze poging om de unieke interacties van meerdere elementen van TME's te ontcijferen.

Baanbrekende methoden zoals flowcytometrie (uitgevonden in de jaren 1960), fluorescentie-geactiveerde celsortering en massacytometrie zijn voornamelijk gericht op het identificeren en kwantificeren van TME-componenten4. Hoewel op cytometrie gebaseerde kwantitatieve technieken fenotypering van het immuunlandschap mogelijk maken, is het bepalen van de cellulaire ruimtelijke verdeling onmogelijk. Omgekeerd behouden methoden zoals standaard singleplex immunohistochemie de weefselarchitectuur en stellen onderzoekers in staat om cellulaire distributie te analyseren, hoewel een verminderd aantal doelen in een enkele weefselsectie een beperking van deze methoden is 5,6. In de afgelopen jaren zijn multiplexed imaging-technologieën voor eencellige resolutie zoals multiplex immunofluorescentie, barcoding fluorescentie beeldvorming en imaging massaspectrometrie naar voren gekomen als uitgebreide strategieën voor het verkrijgen van informatie over gelijktijdige markerkleuring met behulp van dezelfde weefselsectie7.

Hier presenteren we een technologie die metaalgelabelde antilichamen en secundaire ionenmassaspectrometrie koppelt en kwantificering van de resolutie van één cel, markerco-expressie (fenotypering) en ruimtelijke analyse mogelijk maakt met behulp van formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) en vers bevroren (FF) weefselmonsters 8,9. FFPE-monsters zijn de meest gebruikte materialen voor weefselarchiveringsmonsters en vormen een gemakkelijker beschikbare bron voor multiplexed beeldvormingstechnologieën dan vers ingevroren monsters10. Bovendien biedt deze technologie de mogelijkheid om maanden later opnieuw beelden op te vragen. Hierin bespreken we onze kleurings- en beeldverwerkingsprotocollen met behulp van FFPE-weefselmonsters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weefselmonsters werden verkregen voor onderzoeksdoeleinden in overeenstemming met de Institutional Review Board van het MD Anderson Cancer Center van de Universiteit van Texas, en monsters werden verder gedeïdentificeerd.

1. Selectie van antilichamen

  1. Definieer de onderzoeksvragen om de best beschikbare antilichaamklonen te kiezen. Gebruik de Human Protein Atlas, gepubliceerd onderzoek en websites van antilichaamfabrikanten als onderzoeksbronnen.
    OPMERKING: De selectie van adequate controles van menselijk weefsel en dezelfde menselijke weefselcontroles die in de verschillende stappen moeten worden gekleurd, is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de markers correct, op de juiste plaats en in het juiste cellulaire compartiment worden gekleurd. Een kleine weefselmicroarray (TMA) inclusief normaal weefsel en neoplastische weefsels wordt altijd aanbevolen voor kleuringsvalidatie.
  2. Gebruik alleen dragervrije antilichamen om het paneel te ontwerpen.
    OPMERKING: Het gebruik van dragervrije antilichaamformuleringen is vereist als er geen commercieel dragerschapsvrij antilichaam beschikbaar is; zuiveringskits kunnen worden gebruikt om het antilichaam aan te passen aan de juiste formulering. Van eiwitadditieven zoals runderserumalbumine is bekend dat ze de conjugatiecapaciteit verminderen.
  3. Test en titreer elk antilichaam met behulp van standaardchromogene immunohistochemie om het subcellulaire patroon van de expressie van een marker te bepalen; membraan-, cytoplasmatische of nucleaire kleuring; en expressie in specifieke cellen in controleweefsels.
    OPMERKING: Elk antilichaam moet echter worden getest in pH 6-citraat en pH 9 ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en of het paneel zal worden gekleurd met pH 6-citraat of pH 9 EDTA moet worden bepaald. Het gebruik van pH 9 EDTA wordt aanbevolen om goede signalen te verkrijgen, vooral bij het werken met deze methodologie.
  4. Kies de optimale kleuringsconcentratie volgens het expressiepatroon in positieve controles.
  5. Wijs elk antilichaam toe aan een van de beschikbare metaalisotopen volgens de immunohistochemische marker abundantie, subcellulaire lokalisatie en cellulaire co-expressie met de andere doelen.
  6. Kleur het antilichaam met het overeenkomstige toegewezen metaal en vergelijk met de expressie in hetzelfde controleweefsel dat eerder werd gebruikt.
    OPMERKING: Antilichaammetaalconjugatie begint met antilichaamvoorbereiding, reductie en daaropvolgende conjugatie (aanvullend dossier 1). Elke met metaal geladen polymeerbuis is voldoende voor het labelen van 100 μg van een antilichaam.

2. Antilichaam paneel ontwerp

  1. Maak kleine partijen antilichaamkleuring. Test maximaal vijf markers in een cocktail.
    OPMERKING: Het testen van antilichamen die al zijn geconjugeerd en geanalyseerd met behulp van immunohistochemie in batches vergemakkelijkt de vroege identificatie van kanaalinterferenties en biedt de mogelijkheid om de antilichamen te reconjugeren met een ander metaal. Het biedt ook de mogelijkheid om adequate co-expressie van markers te evalueren.
  2. Kleur elke kleine batch met vier verschillende antilichaamconcentraties (0,05 μg/ml, 0,2 μg/ml, 1 μg/ml en 4,0 μg/ml).
    OPMERKING: Vergelijk verschillende titers en identificeer de antilichaamconcentratie die resulteert in de juiste locatie en hoogste expressie met minimale achtergrondkleuring (beste signaal-ruisverhouding).

3. FFPE weefselsectie

  1. Selecteer goudgecoate dia's (specifiek voor dit doel) en houd ze dicht bij de microtoom. Bereid de microtoom voor door een nieuw mes in de houder te steken. Stel de sectiedikte in op 4-5 μm.
  2. Zet FFPE-blokken op ijs voordat je gaat snijden. Bereid een weefselzwembad door gedestilleerd water of gedeïoniseerd water (diH2O) te verhitten tot 40-45 °C.
    OPMERKING: Het gebruik van diH2O of gedestilleerd water vermindert de kans op besmetting.
  3. Begin met secties. Plaats het weefselgedeelte met een pincet in het water en laat het platdrukken. Gebruik de dia's om weefselsecties uit het water te verwijderen.
  4. Plaats de dia's in een schuifrek en laat ze een nacht op kamertemperatuur drogen.

4. FFPE antilichaam kleuring

OPMERKING: Het kleuringsproces vindt plaats op twee afzonderlijke dagen.

LET OP: De oplossingen die in dit protocol worden gebruikt, zijn potentieel corrosief en vormen gevaren voor de huid en ogen. Het dragen van handschoenen, een laboratoriumjas en beschermende oog- en gezichtsapparatuur wordt geadviseerd en maakt deel uit van het bioveiligheidsbeleid van onze instelling.

  1. Reagensbereiding (dag 1)
    1. Verdun 50 ml 20x Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween (TBS-T) tot 950 ml diH2O om 1 l TBS-T te maken.
    2. Verdun 8 ml tris-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) tot 72 ml diH2O om een 1x warmte-geïnduceerde epitoopterugwinning (HIER) oplossing te maken.
    3. Verdun donkey serum in 1x TBS-T tot een eindconcentratie van 5% om een blokkerende buffer te maken. Bewaar de oplossing bij 4 °C totdat deze klaar is voor gebruik.
  2. HIER voorbereiding: Voorbehandeling (PT) module
    LET OP: Draag chemische beschermende handschoenen bij het hanteren van reagentia of onderdelen die zijn ondergedompeld in reagentia die in de PT-module worden gebruikt.
    1. Verdun 140 ml 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot 1.260 ml diH2O om 1,4 l 1x PBS te maken. U kunt ook zeven PBS-tabletten verdunnen tot 1,4 l diH2O.
    2. Vul een tank met 1,4 L PBS en plaats de voorbereide schuifkamercontainer met 100 ml 1x HIER-oplossing in de tank.
    3. Verwarm de tank in een PT-module voor op 75 °C.
  3. Overtollige paraffine verwijdering
    1. Bak glaasjes op 70 °C minstens 20 min in een oven.
      OPMERKING: Sommige tissues of secties hebben mogelijk langere baktijden nodig. De aanbevolen baktijd voor hersenweefsel of een TMA is 1 uur. Dit kan worden verlengd tot 16 uur ('s nachts) of volgens laboratoriumervaring.
    2. Plaats gebakken dia's in een diahouder en voer de volgende wasstappen uit op een shaker onder een zuurkast. Was de dia's in de volgende oplossing: Xyleen 2x voor 30 s (metaalvrij), 100% alcohol 2x voor 30 s (metaalvrij), 95% alcohol 2x voor 30 s (metaalvrij), 80% alcohol voor 30 s (metaalvrij), 70% alcohol voor 30 s (metaalvrij) en diH2O 2x voor 30 s (metaalvrij).
    3. Bewaar de dia's in een verse diH2O-container totdat ze klaar zijn voor het ophalen van antigeen.
      OPMERKING: De dia's mogen niet worden gedroogd tot het einde van de procedure.
  4. Antigeen ophalen
    1. Plaats de dia's in een voorverwarmde schuifkamer met 1x HIER-buffer in de PT-module. Plaats het deksel op de tank. Sluit en sluit het deksel.
    2. Druk op de menuknop op de PT-module om het hoofdmenu te openen en druk op de knop Setup-cyclus (tijd en temperatuur) om een aangepast programma te maken.
    3. Laat de PT-module gedurende 40 minuten op 97 °C draaien. Daarna koelt de PT-module automatisch af tot 65 °C.
    4. Verwijder de dia's uit de PT-module zodra de temperatuur van 65 °C is bereikt. Houd de dia's 30 min op kamertemperatuur.
      OPMERKING: De PT-module gaat pas open als de temperatuur afkoelt tot 65 °C. Raak tijdens dit proces het gouden oppervlak van de dia's niet aan en gebruik altijd handschoenen.
  5. Antilichaam blokkeren
    1. Zet een shaker op 70 toeren.
    2. Was de dia's door ze 5 min 2x in 1x TBS-T te dopen.
    3. Trek met behulp van een hydrofobe barrièrepen een rand rond het weefselgedeelte op ten minste 1 mm afstand van de schuifranden en laat deze 15-30 s drogen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de penvloeistof het weefselgedeelte raakt om weefselinterferentie met de kleuring te voorkomen. Druk de pen niet te hard in tijdens het tekenen van de barrière om mogelijke lekken te voorkomen. Voor optimale kleurings- en beeldacquisitieresultaten worden de weefselsecties in het midden van de met goud beklede dia's geplaatst in een frame dat niet groter is dan 15 mm x 30 mm om voldoende ruimte te bieden om de barrière te tekenen zonder het weefsel of de geleidepunten aan de buitenrand van de dia aan te raken.
    4. Als u eventuele penresten wilt verwijderen, dompelt u de dia's in TBS-T.
    5. In een vochtkamer bij kamertemperatuur incubeer het weefselgedeelte met 100-200 μL blokkerende buffer gedurende 20 minuten. Laat het weefsel incuberen in de blokkerende buffer totdat een antilichaam master mix klaar is.
  6. Voorbereiding van het antilichaampaneel
    OPMERKING: Het uiteindelijke volume van de cocktail van het antilichaampaneel varieert afhankelijk van het geschatte oppervlak van de weefselsectie. Om een gebied van 20 mm x 20 mm te bedekken, bereidt u 100-200 μL van de cocktail.
    Doe het volgende om een antilichaampaneelcocktail van metaalisotoop-geconjugeerde antilichamen te bereiden:
    1. Bevestig het uiteindelijke volume van de cocktail dat gelijk is aan het antilichaamcocktailvolume dat aan het blokkerende buffervolume is toegevoegd.
    2. Bevestig de specificaties voor alle antilichamen, verdunningen en/of antilichaamconcentraties in een spreadsheet voor het project.
    3. Draai alle antilichaambevattende buisjes af op 10.000 x g gedurende 5 minuten. Voeg individuele antilichamen toe aan de blokkerende buffer en meng heel goed. Verstoor de onderkant van de antilichaambuis niet bij het pipetteren ervan.
    4. Filter het antilichaampaneel door een centrifugaal filterapparaat van 0,1 μm met 100 μL blokkeringsbuffer vooraf te bevochtigen. Draai het filter gedurende 2 minuten op 10.000 x g en verwijder de blokkerende bufferdoorstroming met een pipet.
    5. Breng het antilichaampaneel over in een spinkolom en draai het filter gedurende 2 minuten op 10.000 x g . Gooi de spinkolom weg en gebruik de doorstroom als het gefilterde antilichaampaneel.
      OPMERKING: Voer de kleuring onmiddellijk na het maken van de cocktail uit om metaaluitwisseling te voorkomen. Als opslag van de antilichaamcocktail voor een langere tijd nodig is, kan deze worden onderworpen aan lyofilisatie.
  7. Antilichaamkleuring
    1. Verwijder voorzichtig de blokkerende buffer van de dia's door elke dia op zijn kant te kantelen en zachtjes op de randen tegen een taakwisser te tikken.
    2. Plaats de dia's in een vochtkamer en voeg 100-200 μL antilichaammastermengsel toe aan het weefsel (vermijd contact met weefsel en het ontstaan van luchtbellen).
    3. Voeg positieve en negatieve controledia's toe aan de kleuringsbatch.
    4. Incubeer de dia's bij 4 °C 's nachts (14-16 uur).
  8. Reagensbereiding (dag 2)
    1. Verdun 100 ml 10x laag-barium PBS, pH 7,4, in 900 ml diH2O om 1x PBS te maken.
    2. Bereid 350 ml van een werkvoorraadoplossing van 2% glutaaraldehyde in pbs met een laag bariumgehalte (340 ml laag-barium PBS + 10 ml glutaraldehyde).
      OPMERKING: Voer de verdunning uit onder een kap. Glutaaraldehyde is een zeer viskeuze vloeistof. Gebruik een pipet van 1 ml en voeg elke keer 1 ml laag-barium PBS toe aan de glutaaraldehydebuis totdat deze vloeibaar genoeg wordt om uit de buis te gieten.
    3. Verdun 10x Tris, pH 8,5, in 900 ml diH20 om 1x Tris te maken.
  9. Fixatie en uitdroging
    1. Verwijder de antilichaammastermix van elke dia door de dia op zijn kant te kantelen en zachtjes op de rand tegen een taakwisser te tikken.
    2. Was de dia's met lichte tot matige agitatie in de volgende buffers: 1x TBS-T, 3x maal gedurende 5 minuten elk (metaalvrij); gefilterd 2% glutaaraldehyde gedurende 5 minuten; gefilterd 1x tris, pH 8,5, 3x voor 30 s; gefilterd diH2O 2x voor 30 s; 70% alcohol gedurende 30 s (metaalvrij); 80% alcohol gedurende 30 s (metaalvrij); 95% alcohol gedurende 30 s (metaalvrij); en 100% alcohol gedurende 30 s (metaalvrij).
    3. Tik zachtjes op de rand van elke schuif tegen een taakwisser om overtollige alcohol te verwijderen en resterende alcohol te laten verdampen bij kamertemperatuur (~ 5-10 min).
    4. Droog dia's in een exsiccator gedurende ten minste 1 uur voorafgaand aan het verkrijgen van afbeeldingen of bewaar de dia's in een vacuümkamer voor langdurige opslag.

5. Beeldacquisitie

  1. Dia-instelling
    OPMERKING: Voordat u met het instrument gaat scannen, moeten de dia's worden gedefinieerd en ingesteld met behulp van de webgebaseerde toepassing voor beeldbeheer volgens de onderstaande stappen.
    1. Klik op de diapagina in de webgebaseerde toepassing voor afbeeldingsbeheer op Accession New Slide en voer de gewenste details in (naam, dia-identificatie, locatie en beschrijving).
    2. Maak scansecties door op Sectie toevoegen te klikken. Vul de informatie voor elke sectie in (naam van het project, dianaam, blok en positie). Als u de nieuwe dia's/secties wilt opslaan, klikt u op Verzenden.
    3. Open op het tabblad Bronnen de deelvensterpagina en selecteer het deelvenster dat u wilt gebruiken. Voor nieuwe deelvensters klikt u op Nieuw deelvenster maken.
    4. Nadat u het paneel hebt geselecteerd, klikt u op Secties. Voeg de secties toe die in stap 2 zijn gemaakt. door op Sectietoewijzing bewerken te klikken. Opslaan door op Verzenden te klikken.
  2. Instrument setup
    OPMERKING: Dit instrument (zie Materiaaltabel) wordt bediend met behulp van een specifiek besturingssoftwareprogramma (zie Materiaaltabel).
    1. Log in op de besturingssoftware. Klik op Wake Up (Wakker ) als het instrument in de slaapstand staat.
      OPMERKING: Ten minste 1 uur voor de operatie wordt het opwarmen van het instrument aanbevolen, wat helpt bij de stabilisatie van de bundelfocus.
    2. Als u een dia wilt laden, klikt u op Exchange Sample en vervolgens op Continue om de deur te openen. Plaats de schuif in de laadsleuf met het monster naar boven gericht en het label aan de rechterkant. Klik op Doorgaan om de deur te sluiten.
      OPMERKING: Als de dia niet correct is geladen, verschijnt er een waarschuwingsgeluid en een melding om de dia aan te passen.
    3. Selecteer het project en selecteer vervolgens de dianaam voor het geladen voorbeeld.
    4. Visualiseer de panoramische afbeelding in het optische afbeeldingsvenster van de dia.
  3. Selectie en acquisitie van gezichtsveld (FOV)
    1. Klik op het menu Modus en selecteer SED (Secondary Electron Detector). Klik op het menu beeldmodus en kies QC −300 μm.
    2. Klik op Jog Stage om de FOV-locatie te regelen en klik vervolgens op de pijlen om te navigeren en de positie van de FOV te selecteren.
    3. Klik op FOV toevoegen, stel 400 μm x 400 μm in als veldgrootte en selecteer fijn als beeldmodus en 1 ms verblijftijd. Klik op Bevestigen.
      OPMERKING: De ingestelde verblijftijd is afhankelijk van de gewenste resolutie. De verblijftijd neemt toe naarmate de resolutie toeneemt. De aanschaftijd kan variëren afhankelijk van meerdere factoren, waaronder de inbraakperiode van de detector en de duur van de werking. Onze gemiddelde acquisitietijd voor één FOV is ongeveer 17 min. Gebruik het instrument non-stop gedurende maximaal 8 uur, waardoor ongeveer 28 FOV's kunnen worden gescand. De kwaliteit van de verkregen beelden neemt af na vele opeenvolgende uren gebruik.
    4. Nadat u een FOV-lijst hebt gemaakt, gaat u verder met beeldfocus en past u de stigmatie aan door de bundel naar een weefselgebied te verplaatsen dat niet in beeld wordt gebracht. Pas de parameters aan totdat een duidelijk centraal beeld is verkregen.
      OPMERKING: Om de beeldacquisitie te optimaliseren, is het ideaal om het weefselgedeelte gecentraliseerd op de dia te houden. Tijdens het scherpstellen kan een duidelijk beeld van alleen het centrale gebied worden verkregen. Als het weefselgedeelte te groot is, zijn de randen onscherp en wordt het beeld onscherp.
    5. Klik op Start Run. Verkregen afbeeldingen worden automatisch geüpload en opgeslagen in de webgebaseerde toepassing voor afbeeldingsbeheer.

6. Beeldvoorbereiding

  1. Beeld isobare correctie
    OPMERKING: Het doel van isobare correctie is het verwijderen van spillover-signalen tussen kanalen als gevolg van de aanwezigheid van isotopen van gelijke of zeer vergelijkbare massa waarvan de verschillen in massa niet kunnen worden gedetecteerd met behulp van de massaanalysator.
    1. Klik in de webgebaseerde toepassing voor beeldbeheer op het groene downloadpictogram om de FVV's (TIFF-afbeeldingen) op te slaan.
    2. Download de meest recente versie van de beeldverwerkingssoftware (zie Materiaaltabel) die beschikbaar is op het tabblad Info in de webgebaseerde toepassing voor afbeeldingsbeheer en sla deze op in een bestand. Open het .zip archiefbestand en volg de installatiestappen. Open de software zodra de installatie is voltooid.
    3. Selecteer de map met de afbeeldingen die moeten worden gecorrigeerd door op het pictogram Bestand in het invoervenster van de beeldverwerkingssoftware te klikken. Er wordt een FOV-lijst geladen.
    4. Klik op het filterpictogram in het invoervenster om standaardcorrecties toe te passen. Visualiseer voor elk kanaal beelden die voor en na correctie zijn verkregen aan de rechterkant van het scherm.
    5. Klik op het diskettepictogram in het uitvoervenster om de gecorrigeerde afbeelding op te slaan.
  2. Beeldfiltering: Voronoi vlakvulling
    OPMERKING: Voronoi-vlakvullingsdiagrammen illustreren een verdeling van de ruimte met zaadpunten in Voronoi-cellen. Het doel is om de celdichtheid te schatten en celgrenzen te definiëren. Met behulp van de Voronoi-vlakvullingsberekening wordt een masker gegenereerd en toegepast op de oorspronkelijke afbeelding voor filtering.
    1. Klik op het tabblad Filteren en selecteer Voronoi Tesselation in het menu filterparameters.
    2. Selecteer in het invoervenster de afbeelding MassCorrected.tiff. Klik op het filterpictogram in het invoervenster.
    3. Klik op het diskettepictogram in het uitvoervenster om de gefilterde afbeelding op te slaan. De twee resulterende bestanden hebben de achtervoegsels -Filtered.tiff en -Filtered.json.
      OPMERKING: De afbeelding met de naam MassCorrected-Filtered.tiff kan vervolgens worden geüpload naar een softwareprogramma voor digitale analyse van derden of een open-source softwareprogramma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amandel- en longadenocarcinoom TMA-weefselsecties (5 mm dik) werden verkregen en op het midden van goudgecoate dia's geplaatst volgens de specificaties met betrekking tot weefselgrootte en veilige marges van de dia's. Vrije glasmarges van respectievelijk 5 mm en 10 mm tussen de rand van het weefsel en de laterale en inferieure randen van de glasglijbanen zijn nodig voor een optimale kleuring. De weefselsecties werden 's nachts in een oven gebakken voordat ze werden gekleurd om een goede hechting van het gedeelte aan de g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De uitgebreide opheldering van de complexe, ingewikkelde interacties tussen de meerdere componenten van een TME blijft een centrale doelstelling van kankeronderzoek. Fabrikanten hebben talloze multiplexed assays geïntroduceerd als onderdeel van deze inspanning, vooral in de afgelopen 5 jaar. Gemultiplexte ruimtelijke analyse is een veelzijdig en krachtig hulpmiddel dat de gelijktijdige categorisatie van verschillende doelen vergemakkelijkt met behoud van structurele morfologie in tumormonsters. Ruimtelijke analysetechnie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen Don Norwood van Editing Services, Research Medical Library bij MD Anderson voor het bewerken van dit artikel en het Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory bij de afdeling Translational Molecular Pathology bij MD Anderson. Deze publicatie is deels het resultaat van onderzoek dat werd gefaciliteerd door de wetenschappelijke en financiële steun voor het Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) verstrekt via de National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) aan het Md Anderson Cancer Center Cancer Immune Monitoring and Analysis Center (CIMAC) van de Universiteit van Texas.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100% Reagent AlcoholSigma-AldrichR8382
95% Reagent AlcoholSigma-AldrichR3404
80% Reagent AlcoholSigma-AldrichR3279
70% Reagent AlcoholSigma-AldrichR315
20X TBS-TIonpath567005
10X Low-Barium PBS pH 7.4Ionpath567004
10X Tris pH 8.5 Ionpath567003
4°C RefrigeratorThermoScientificREVCO
Aerosol Barrier Pipette Tips P10Olympus24-401
Aerosol Barrier Pipette Tips P20Olympus24-404
Aerosol Barrier Pipette Tips P200Olympus24-412
Aerosol Barrier Pipette Tips P1000Olympus24-430
Centrifugal Filter Ultrafree-MCFisher ScientificUFC30VV00
Deionized H2OIonpath567002
Donkey serumSigma-AldrichD9663
EasyDip Slide Staining Jar, GreenElectron Microscopy Sciences71385-G
EasyDip Slide Staining Jar, YellowElectron Microscopy Sciences71385-Y
EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), WhiteElectron Microscopy Sciences71388-01
EasyDip Stainless Steel HolderElectron Microscopy Sciences71388-50
Glutaraldehyde 70% EM GradeElectron Microscopy Sciences16360
Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9DakoS2367
Heat resistant slide chamberElectron Microscopy Sciences62705-01
Hydrophobic barrier penFisher50-550-221
MIBI/O softwareIonpathNA
MIBIcontrol softwareIonpathNA
MIBIslideIonpath567001
MIBIscopeIonpathNA
MicrocentrifugeEppendorf5415D
MicrotomeLeicaRM2135
Moisture Chamber (Humid Chamber)SimportM922-1
Phosphate Buffered Saline (PBS) TabletsFisher ScientificBP2944100
PT ModuleThermo ScientificA80400012
Rapid-Flow Sterile Disposable Filter UnitsFisher Scientific097403A
ShakerBioRockerS2025
Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm )MillQUFC30VV00
Slide ovenFisher Scientific6901
Vaccum Cabinet DesiccatorVWR30621-076
Task-whipeKimberly Clark34155
XyleneSigma-Aldrich534056-4L

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. Beyond the tumour microenvironment. International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).
  2. Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89(2020).
  3. Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
  4. Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
  5. Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
  6. Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466(2020).
  7. Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98(2021).
  8. Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
  9. Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
  10. Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
  11. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59(2020).
  12. Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
  13. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).
  14. Rad, H. S., et al. The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
  15. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
  16. Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tumor MicroenvironmentMass Spectrometry ImagingFormalin Fixed TissueParaffin Embedded TissueMultiplex ImagingMetal Labeled AntibodiesAntibody Panel OptimizationTissue CompartmentalizationCell SegmentationDigital Image Analysis

Gerelateerde artikelen