Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64063

⸱

16 juni 2022

 ,  ,  , 
1Randall Centre for Cell and Molecular Biophysics, School of Basic and Medical Biosciences, King’s College London

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Optische helderheid is een groot voordeel voor celbiologisch en fysiologisch werk bij zebravissen. Robuuste methoden voor het meten van celgroei bij individuele dieren worden beschreven die nieuwe inzichten mogelijk maken in hoe de groei van skeletspieren en naburige weefsels worden geïntegreerd met de groei van het hele lichaam.

Samenvatting

Een aantal methoden kan worden gebruikt om individuele cellen in het hele lichaam van levende embryonale, larvale of juveniele zebravissen te visualiseren. We laten zien dat levende vissen met fluorescerend gemarkeerde plasmamembranen kunnen worden gescand in een confocale laserscanmicroscoop om het volume spierweefsel en het aantal aanwezige spiervezels te bepalen. Efficiënte benaderingen voor het meten van het aantal en de grootte van cellen bij levende dieren in de loop van de tijd worden beschreven en gevalideerd tegen moeilijkere segmentatiemethoden. Er worden methoden beschreven die de controle van spierele elektrische en dus contractiele activiteit mogelijk maken. Verlies van skeletspiercontractiele activiteit verminderde de spiergroei sterk. Bij larven wordt een protocol beschreven dat herintroductie van patroongevoede elektrisch opgewekte contractiele activiteit mogelijk maakt. De beschreven methoden minimaliseren het effect van interindividuele variabiliteit en maken analyse mogelijk van het effect van elektrische, genetische, medicamenteuze of omgevingsstimuli op een verscheidenheid aan cellulaire en fysiologische groeiparameters in de context van het levende organisme. Langdurige follow-up van de gemeten effecten van een gedefinieerde interventie in het vroege leven op individuen kan vervolgens worden uitgevoerd.

Inleiding

Gereguleerde weefselgroei, bestaande uit toename van het aantal cellen (hyperplasie) en /of celgrootte (hypertrofie), is een cruciale factor in ontwikkeling, regeneratie en ecologische en evolutionaire aanpassing. Ondanks de enorme vooruitgang in moleculair genetisch begrip van zowel cel- als ontwikkelingsbiologie in de afgelopen decennia, staat het mechanistische begrip van de regulatie van weefsel en orgaangrootte nog in de kinderschoenen. Een reden voor deze lacune in kennis is de moeilijkheid om weefselgroei in levende organismen te kwantificeren met de nodige ruimtelijke en temporele nauwkeurigheid.

Verschillende aspecten van de groei van hele organismen kunnen herhaaldelijk in de loop van de tijd worden gemeten, waarbij groeicurven voor elk individu 1,2,3,4,5 worden onthuld. Steeds geavanceerdere scanmethoden, zoals dubbele röntgenabsorptie (DXA), computertomografie (CT) en magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), maken het mogelijk de groei van hele organen en andere lichaamsregio's (bijvoorbeeld individueel geïdentificeerde skeletspieren) bij afzonderlijke individuen, zowel menselijke als in modelorganismen, te volgen 6,7,8,9,10 . Deze methoden hebben echter nog niet de resolutie om individuele cellen te onthullen en dus zijn de verbanden tussen cellulair gedrag en groei op weefselniveau moeilijk te onderscheiden. Om dergelijke verbanden te leggen, hebben traditionele studies vaak vertrouwd op cohorten van vergelijkbare individuele dieren, waarvan er een paar op opeenvolgende tijdstippen worden geofferd en vervolgens in cytologisch detail worden geanalyseerd. Dergelijke benaderingen vereisen het gemiddelde van de waargenomen veranderingen over groepen van (bij voorkeur vergelijkbare, maar niettemin variabele) individuen en lijden dus aan een gebrek aan temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor het moeilijk is om gecorreleerde gebeurtenissen op cellulair niveau te vinden die wijzen op oorzaak en gevolg.

Studies op ongewervelde modelorganismen, aanvankelijk in C. elegans en D. melanogaster, hebben deze problemen omzeild door optische microscopie te ontwikkelen om cellulaire resolutie te bereiken en nauwkeurig de groei in de loop van de tijd te meten bij individuele individuen. Dergelijke studies hebben opvallend invariant cellijngedrag onthuld in de groei van deze kleine modelorganismen 11,12,13,14,15,16,17. Veel dieren, waaronder alle gewervelde dieren, hebben echter onbepaalde cellijnlijnen en beheersen weefselgroei door mysterieuze feedbackprocessen die dienen om het genetisch gecodeerde groeiprogramma om te zetten in een functioneel driedimensionaal organisme met al zijn samenstellende weefsels en organen die qua grootte op de juiste manier zijn afgestemd. Om deze complexe groeiprocessen te begrijpen, is het wenselijk om hele weefsels of organen in de loop van de tijd in afzonderlijke individuen in beeld te brengen die experimenteel kunnen worden gemanipuleerd door genetische, farmacologische of andere interventies op een tijdstip naar keuze en het effect vervolgens geanalyseerd.

Elke gewervelde skeletspier heeft een gedefinieerde grootte, vorm en functie, en goed gekarakteriseerde interacties met aangrenzende weefsels, zoals bot, pees en zenuwen. Sommige spieren zijn klein, liggen net onder de huid en zijn daarom goede kandidaten voor hoge resolutie beeldvormingsstudies. Net als de meeste organen groeit elke spier gedurende het embryonale, postnatale en juveniele leven, voordat het een stabiele volwassen grootte bereikt. Spieren hebben echter ook een uniek vermogen om van grootte te veranderen tijdens het volwassen leven, afhankelijk van gebruik en voeding18, en deze eigenschap heeft een grote invloed op de conditie van het organisme, sportprestaties en onafhankelijk leven. Verlies van spiermassa en functie op oudere leeftijd, sarcopenie, is een kwestie van toenemende zorg voor samenlevingen die worden geconfronteerd met een vergrijzende bevolkingvan 19,20,21.

Wij en anderen hebben ons gericht op de groei van gedefinieerde blokken skeletspierweefsel in het segmentaal herhalende lichaam van zebravislarven, als een schijnbaar gesloten systeem met enkele honderden cellen waarin weefselgroei, onderhoud en reparatie kunnen worden waargenomen en gemanipuleerd 22,23,24,25,26. Hoewel enig kwantitatief werk eerder is gemeld 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, is er geen gedetailleerde en gevalideerde methode beschikbaar voor het meten van spiergroei in cellulair detail in individuele gewervelde organismen in de loop van de tijd. Hier wordt een efficiënt protocol beschreven voor het uitvoeren van dergelijke herhaalde metingen, samen met validatie, en een voorbeeld van het gebruik ervan om veranderingen in zowel hypertrofische als hyperplastische groei te analyseren als reactie op veranderde elektrische activiteit wordt gegeven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Al het beschreven onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen en onder geschikte licenties van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken in overeenstemming met de Animal (Scientific Procedures) Act 1986 en daaropvolgende wijzigingen. Embryo's/larven moeten bij 28,5 °C worden grootgebracht totdat de gastrulatie is voltooid, maar mogen dan bij 22-31 °C worden gehouden om de ontwikkelingssnelheid te beheersen. Vissen kunnen bij kamertemperatuur worden gescand of gestimuleerd.

1. Verdoof zebravislarven

  1. Kruis geschikte fluorescerende reporter volwassen vissen zoals Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg referentie36 of Tg(α-actine:mCherry-CAAX)pc22Tg referentie37 en verzamel embryo's zoals beschreven38.
  2. Op het moment van keuze, zoals 2 dagen na de bevruchting (dpf), verdoof embryo's kort met behulp van Tricaine-bevattend vismedium (viswater of E3-medium) en screen op EGFP of mCherry onder een fluorescentiemicroscoop, zoals een Leica MZ16F. Als men veel embryo's heeft, selecteer dan die met het helderste signaal. Breng embryo's onmiddellijk na screening terug naar normaal vismedium.

2. Montage vis voor confocale scanning

  1. Schakel het confocale laserscansysteem en lasers in om het systeem gedurende 30-60 minuten te laten stabiliseren.
    OPMERKING: Hier gebruikten we een Zeiss LSM 5 Exciter-microscoop met rechtopstaande materiaalstandaard (die de werkafstand verbetert) uitgerust met een 20x / 1,0 W waterdompelingsobject.
  2. Bereid 1% low melting agarose (LMA) en bewaar in een warmteblok van 37 °C voor herhaald gebruik in een buis van 1,5 ml. Om hitteschok te voorkomen, verwijdert u de LMA-aliquot uit het warmteblok en laat u deze afkoelen tot net boven de instelling voordat u deze op de larve aanbrengt, test u tegen de huid om de juiste temperatuur te beoordelen, zoals bij het beoordelen van de temperatuur van babyvoedingsmelk.
  3. Selecteer vissen die moeten worden gemonteerd en verdoof elke vis tijdelijk om de beurt met Tricaine (0,6 mM in vismedium).
  4. Neem een petrischaaltje met een diameter van 60 mm dat is bedekt met een laag van 1% agarose en plaats het op het podium van een ontleedmicroscoop.
  5. Breng de larve met een 1 ml plastic Pasteur pipet over op de 60 mm gecoate petrischaal en verwijder zoveel mogelijk overgebracht medium. Plaats vervolgens, nog steeds met behulp van de Pasteur pipet, 5 tot 10 druppels LMA op de vis en positioneer snel horizontaal in lateraal zicht met een tang (of een vuurgepolijste naald van fijn glas) voordat de LMA uitzet. Voor optimale beeldvorming is het wenselijk om de larve dicht bij het bovenoppervlak van de LMA te plaatsen.
    1. Als alternatief, met behulp van een 1 ml plastic Pasteur-pipet, verzamel de larve met zo min mogelijk vismedium en breng de larve over in de aliquot van gekoelde LMA. Laat de larve 5 s zinken om volledig omringd te worden door LMA. Haal vervolgens de larve op en breng deze in een druppel LMA over op de met agarose gecoate petrischaal. Oriënteer en positioneer de larve snel zoals hierboven beschreven.
  6. Oriënteer de larve met zowel zijn anteroposterior als dorsoventrale assen binnen 10° van het horizontale vlak (zie de opmerking "Over fout en de correctie ervan", punt 4.6 hieronder).
    1. Als de larve niet correct horizontaal in de buurt van het oppervlak van de agarose-druppel is gemonteerd, verwijder en herinfundeer dan opnieuw. Larven kunnen gemakkelijk worden opgehaald door voorzichtige zuigkracht met behulp van een microfijne 1 ml plastic Pasteur-pipet en LMA kan voorzichtig worden verwijderd met Kimwipes. Oefening baart echt kunst in de montageprocedure; breng een middag door met het inbedden van enkele onbelangrijke larven voordat je dit op een echt experiment probeert.
      OPMERKING: Over microscoopontwerp: Veel laboratoria gebruiken omgekeerde confocale microscopen voor beeldvorming via een coverslip. We hebben ontdekt dat het herhaaldelijk insluiten en verwijderen van vissen die in agarose onder een deklip worden gehouden voor observatie in een omgekeerde microscoop leidt tot een groter verlies van monsters tijdens herhaald scannen dan in de beschreven procedure met een rechtopstaande microscoop. Om deze reden wordt het gebruik van een rechtopstaand systeem aanbevolen, indien beschikbaar. Niettemin is een sleutel tot gegevens van hoge kwaliteit de juiste selectie en het gebruik van objectieve en scanparameters, een onderwerp dat te groot is om hier te bespreken.

3. Confocale scanning

  1. Wanneer LMA is ingesteld, overspoelt u het gerecht met ongeveer 10 ml Tricaine-bevattend vismedium. Als u van plan bent om confocale stapels te vangen, laat de gemonteerde vis dan minstens 10 minuten rusten voordat u overgaat tot scannen, omdat er enige agarose zwelling optreedt.
  2. Laad de monsterschaal in het stadium van het confocale systeem, lokaliseer de larve en concentreer u op de gewenste somiet. Somite 17 kan worden gekozen vanwege het gemak van lokalisatie in de buurt van de anale opening en het gemak van beeldvorming. Controleer door somites van anterior te tellen.
    OPMERKING: De eerste somiet is vergroeid achter het oor en heeft geen voorste rand, maar kan gemakkelijk worden waargenomen met dwarsgestreepte spiervezels.
  3. Stel in alsof je een Z-stack wilt vangen door de bovenkant (d.w.z. net boven de huid) en de onderkant (d.w.z. net onder het notochord) te definiëren, zodat de hele somiet wordt opgenomen, zelfs als de vis enigszins scheef is gemonteerd). Zowel de linker- als de rechterkant kunnen naar wens worden vastgelegd. Dit zorgt ervoor dat alle snelle YZ-scans de gewenste regio('s) vastleggen.
  4. Leg een XY-afbeelding als volgt vast. Oriënteer het scangebied ten opzichte van de vis, zoals de confocale software toestaat. Plaats de vis met de anteroposterior-as evenwijdig aan de afgebeelde X-as en de dorsoventrale as parallel aan de Y-as met somiet 17 in het midden van het veld zoals weergegeven in aanvullend bestand 1. Focus op een middenvlak in het bovenste myotoom waarin de hele epaxiale en hypaxiale somiethelften samen met de verticale en horizontale myosepta zichtbaar zijn en een XY-beeld met hoge resolutie vastleggen. Vergeet niet om de afbeelding een naam te geven en op te slaan.
  5. Leg een of meer YZ-afbeeldingen als volgt vast. In de representatieve resultaten (hieronder) wordt de nauwkeurigheid van 2-delige en 4-delige methoden vergeleken. In de 2-slice benadering worden enkele XY - en YZ-scans gebruikt. In de 4-slice benadering worden drie YZ-scans gemiddeld om een nauwkeuriger schatting van het myotoomvolume te geven. Indien vereist door de confocale software, heroriënteert u het scanveld.
    1. Teken een precies dorsale tot ventrale lijn over de gekozen somiet loodrecht op de anteroposterior-as van de vis op een geselecteerde anteroposteriorpositie. Voer een Z-stack lijnscan uit.
    2. Herhaal de YZ-lijnscan drie keer op gedefinieerde anteroposteriorposities langs het geselecteerde myotoom om YZa, YZm en YZp vast te leggen. De representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 2A. Geef deze afbeeldingen een naam en sla deze op samen met de bijbehorende XY-afbeelding .
      OPMERKING: Bij selectie van YZ-vlakken : Het myotoom is V-vormig en de vorm verandert tijdens de groei. Om de meest nauwkeurige beoordeling van myotoom 17 volume te verkrijgen met de 4-slice methode, plaatst u YZa op de voorste punt van het myotoom, YZp op de achterste uiteinden van het myotoom op dorsale en ventrale uitersten, en YZm halverwege tussen YZa en YZp. Ervan uitgaande dat de somiet gelijkmatig taps toeloopt, zal het gemiddelde van de metingen van elke YZ-sectie het myotoom als geheel vertegenwoordigen. Voor de 2-delige methode moet de enkele YZ-scan worden geplaatst aan het achterste uiteinde van het horizontale myoseptum, dat ruwweg overeenkomt met het anteroposterior centrum van het myotoom van belang (zoals YZm). Als alternatief kan een set van drie YZ-secties worden genomen op de voorste, middelste en achterste van het horizontale myoseptum, maar, zoals hieronder weergegeven, zal een dergelijke meting het myotoomvolume iets over- of onderschatten (voor respectievelijk rostrale en caudale somiten als gevolg van myotome tapering). Fundamenteel is consistentie in de positionering van YZ-plakvlak (en) tussen vissen en experimenten de sleutel tot reproduceerbaarheid.

4. Analyse

  1. Omdat het myotoom langs de vis op een graduele manier van grootte verandert, werk dan altijd met hetzelfde somiet in vergelijkende studies.
  2. Om het myotoomvolume te meten en te berekenen, gebruikt u de confocale software (zoals de .lsm-bestanden die zijn gemaakt met Zeiss ZEN-microscoopsoftware) of open-source universele beeldanalysesoftware, zoals Fiji / ImageJ.
    OPMERKING: Als u bestandsindelingen wijzigt, zorg er dan voor dat de Z-stapgrootte correct wordt overgedragen, omdat niet alle software propriëtaire confocale bestandsindelingen correct kan lezen. Als u bijvoorbeeld een ZEN-lijnscanafbeelding in Fiji wilt importeren, gebruikt u eerst de opdracht Bestand/exporteren om te exporteren zoals .tif in het venster Afbeelding met volledige resolutie - indeling met één vliegtuig en importeert u vervolgens in Fiji. Hoewel YZ scan.lsm direct in Fiji kan worden geopend, worden de resulterende YZ-afbeeldingen over het algemeen gecomprimeerd in de Z-dimensie vanwege een onjuiste evaluatie van de Z-stapgrootte.
  3. Analyse met ZEN
    1. Open eerst de XY scan.lsm-bestanden in ZEN. Ga naar het tabblad Afbeeldingen en selecteer het gereedschap Lijn. Teken een lijn tussen de twee verticale myosepta van somiet 17 over de gehele myotoomlengte (evenwijdig aan de anteroposterior-as van de vis). Vink het vakje M aan om de waarden van de meting weer te geven (Lengte = 89,71 μm, zie Aanvullend bestand 2).
    2. Open de YZ scan.lsm-bestanden. Selecteer op het tabblad Afbeeldingen het gereedschap Geslotenzier . Teken rond de omtrek van het myotoom. Eenmaal voltooid, vinkt u het M-vakje aan, dit zou de waarde van de meting onthullen (Gebied = 11980,01 μm2, zie Aanvullend bestand 3).
    3. Noteer de waarden van elke meting handmatig in een spreadsheet. Gemiddelde van de CSA-metingen zoals vereist. Volume van het myotoom kan worden berekend als Volume = Myotoomlengte x CSA, d.w.z. 89,71 μm x 11980,01 μm2 = 1,075 x 106 μm3.
  4. Analyse met Fiji/ImageJ
    1. Open de XY scan.lsm-bestanden in Fiji/ImageJ. Controleer of XY-afbeeldingen die direct in Fiji zijn geopend, correct zijn gekalibreerd in schaal, zoals ze zouden moeten zijn.
    2. Selecteer het gereedschap Rechte lijn in de pictogrammen. Teken een lijn over de lengte van somiet 17 zoals beschreven in stap 4.3.1. Stel meetparameters in door naar Analyseren te gaan, selecteer vervolgens Metingen instellen... en vink de volgende vakjes Gebied en Weergavelabel aan. Als u wilt meten, drukt u op de sneltoets M of gaat u naar het menu Analyseren en selecteert u Meten. Een resulterend pop-upvenster bevat alle meetwaarden (d.w.z. Lengte = 90,023 μm; zie Aanvullend bestand 4). De resultaten kunnen worden opgeslagen in de vorm van .csv en worden geopend in Microsoft Excel of iets dergelijks voor latere analyse.
    3. Als u CSA op de YZ-afbeeldingen wilt meten, opent u YZ-afbeeldingen in .tif indeling zoals beschreven in stap 4.2.
    4. Kalibreer de YZ -.tif afbeeldingen omdat ze niet worden gekalibreerd wanneer ze worden geëxporteerd. Parameters voor de kalibratie kunnen in ZEN worden verkregen door naar de Info van de geselecteerde afbeeldingen te gaan: noteer de waarden Scaling X (0,489 μm) en Scaling Z (0,890 μm; zie Supplemental File 5). Vervolgens, terwijl de afbeeldingen open zijn in Fiji, gaat u naar Afbeelding en selecteert u Eigenschappen .... Invoer 0,489 μm voor de pixelbreedte en pixelhoogte en 0,890 μm voor de Voxel-diepte. Schakel het selectievakje Globaal in om de kalibratie universeel toe te passen als herhaalde meting van YZ-afbeeldingen wordt verwacht (zie Aanvullend bestand 6).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat alle YZ-afbeeldingen zijn vastgelegd met dezelfde scanparameters; start Fiji/ImageJ opnieuw op of wijzig de kalibratiewaarden als een nieuwe kalibratieset vereist is.
    5. Als u de CSA van de gekalibreerde YZ-afbeeldingen wilt meten, selecteert u het gereedschap Polygoonselecties in de pictogrammen. Teken rond de omtrek van de somiet en druk op M om de waarden van de meting weer te geven (Area = 11980.395 μm2; zie Supplemental File 7). Volume van het myotoom kan worden berekend als Volume = Myotoomlengte x CSA, d.w.z. 90,023 μm x 11980,395 μm2 = 1,079 x 106 μm3.
    6. Herhaal de metingen op de andere XY - en YZ-afbeeldingen . Het wordt aanbevolen om dezelfde software te gebruiken voor alle metingen binnen een experimentele reeks voor consistentie. De volumeschatting van elke software is vergelijkbaar, maar niet identiek vanwege de verschillende tekengereedschappen, d.w.z. ZEN = 1,074 × 106 μm3 en Fiji / ImageJ = 1,079 × 106 μm3. De groei van het myotoom tussen twee tijdspunten (d.w.z. 3 tot 4 dpf) kan worden berekend als: (Volume 4 dpf - Volume 3 dpf)/ Volume 3 dpf × 100%.
      OPMERKING: Over fout en de correctie ervan. Tijdens het monteren moet de vis worden georiënteerd met zijn sagittale vlak (d.w.z. de anteroposterior en dorsoventrale assen) zo dicht mogelijk bij horizontaal, om respectievelijk gier en rol te voorkomen. Dit komt omdat zowel de myotome lengte L gemeten uit de XY-scan als de CSA gemeten met een YZ-scan worden overschat als de vis gier (rotatie rond de dorsoventrale as) vertoont als gevolg van schuine anteroposterior montage. Pitch of roll tijdens de montage mogen geen invloed hebben op de metingen na het scannen zoals beschreven in rubriek 3. Niettemin vermindert dorsoventrale rotatie (rol) de beeldkwaliteit. Eenvoudige trigonometrie toont aan dat tot 10° gier 3% fout in volumemeting zal geven, zoals gemeten L en CSA elke toename in verhouding tot (cosq)-1, waarbij q de hoek is weg van anteroposterior horizontaal (gier). 15° en 20° korting geven respectievelijk 7% en 13% overschattingen van het volume.
      Omdat het notochord cilindrisch is, kan opname van het hele notochord in de YZ-scan worden gebruikt om de hoek en omvang van obliquiteit te berekenen uit de oriëntatie en grootte van de grote en kleine assen en daardoor de gemeten L en CSA te corrigeren om de nauwkeurigheid te maximaliseren. Gecorrigeerde CSA = Gemeten CSA x Notochord mineur as/Notochord majeur as. Gecorrigeerd l = gemeten L x notochord kleine as/notochord as in microscoop Z richting.
      Een verdere overweging maakt een aanvullende correctie van L. mogelijk. Naarmate het myotoom groeit, scheef het in het coronale vlak (normaal voor de dorsoventrale as) zodat het mediale myotoom iets anterieur is ten opzichte van het laterale myotoom. Gezien vanaf het dorsaal vormen de verticale myosepta aan de linker- en rechterkant een brede chevron die naar voren wijst. Als de gier laag is, heeft deze morfologie geen invloed op de meting van L. Maar als de geeuw significant is, wordt trigonometrische correctie een uitdaging en een betere benadering is om True L direct te meten door de XYZ-coördinaten te schatten van de twee punten waar de voorste en achterste verticale myosepta het notochord ontmoeten bij het horizontale myoseptum. Eenvoudige trigonometrie maakt het mogelijk om true L van deze coördinaten te berekenen als L = SQRT[(X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2 + (Z2 - Z1)2]. Zwakke punten van deze laatste benadering zijn dat a) de selectie van de punten kan variëren met de operator en b) er geen visueel verslag van de gekozen punten wordt bewaard. Deze overweging heeft geen invloed op csa-correctie.

5. Optionele methode: verwijder en introduceer spier elektrische activiteit opnieuw

  1. Maak een stimulatiekamer.
    1. Neem een putplaat van 6 x 35 mm, maak twee kleine openingen (<5 mm in diameter, 1 cm uit elkaar) aan elke kant van elke put (zie figuur 1) met behulp van een smalle soldeerbout.
      OPMERKING: Behandel de hete soldeerbout met zorg en werk indien gewenst in een zuurkast om inademing van damp te voorkomen.
    2. Rijg een paar zilveren of platina draden (~20 cm lang) door de openingen van elke put (zie figuur 1). Herbruikbaar lijmmateriaal (bijv. BluTack) kan in de buurt van de openingen worden aangebracht om de draden op hun plaats te houden en een scheiding van 1 cm tussen de draden te garanderen (zie figuur 1).
  2. Bij 3 dpf, splits de vis in drie condities: vismedium Control, Inactive en Inactive+Stim.
    1. Voor inactieve en inactieve+stimgroepen verdooft u larven 72 uur na de bevruchting (hpf) met Tricaine (0,6 mM).
      OPMERKING: Na referentie38 worden bevroren aliquots van tricaïnebouillon ontdooid en verdund (40 μL/ml vismedium, tot een eindconcentratie van 0,6 mM) voordat ze aan vis worden toegevoegd. Voeg tricaïne niet rechtstreeks toe aan het water met vis, omdat sommige vissen hoge doses kunnen krijgen. Tricaine-bouillon moet binnen een maand worden gebruikt en nooit opnieuw worden ingevroren.
    2. Voor het vismedium Controlevissen, laat ze onverdoofd.
  3. Bereid op geselecteerde tijdstippen na het begin van de blootstelling aan tricaïne (d.w.z. bij 80 pkf) de Inactive+Stim-groep voor op stimulatie.
    1. Bereid 60 ml 2% agarose (1,2 g agarosepoeder in 60 ml vismedium) en smelt volledig met behulp van de magnetron, koel af, voeg tricaine toe en giet 4 ml in elk putje van de stimulatiekamer (figuur 1).
    2. Voeg onmiddellijk op maat gemaakte 4-well kammen toe tussen de elektroden (gemaakt door kunststoffen (bijv. polypropyleen) van de gewenste afmetingen uit te snijden en aan elkaar te plakken met behulp van secondelijm; zie figuur 1). Wacht 10 minuten voordat de gel is uitgehard. Verwijder kammen voorzichtig om vier rechthoekige putten te maken.
    3. Vul elke put met tricaïnewater en plaats een enkele verdoofde Inactive+Stim-larve in elke put met behulp van een micropipette, met hun anteroposterior-as loodrecht op de elektroden (zie figuur 1).
    4. Controleer onder de ontleedende fluorescerende microscoop of elke vis volledig verdoofd is in elke put van de kamer.
  4. Sluit een instelbare elektrofysiologische patroongenererende stimulator aan op de kamer via een polariteitsregelaar, met behulp van krokodillenklemmen die zijn aangesloten op elk van de elektroden aan één kant van de kamer (zie figuur 1).
    OPMERKING: De polariteitsregelaar wordt gebruikt om de polariteit om de 5 s om te keren, om elektrolyse en corrosie van de elektroden te voorkomen.
  5. Stimuleer vissen. Bijvoorbeeld, 1s met een trein van 200, 20 V pulsen, met 0,5 ms pulsduur en 4,5 ms pulsscheiding, eenmaal per 5 s geeft een effectief herhaald-tetanisch contractieweerstandsregime.
  6. Controleer regelmatig onder de microscoop om te bevestigen dat de vissen worden gestimuleerd; het voorbeeld elektrische stimulus moet een zichtbare bilaterale samentrekking en lichte beweging induceren, eens in de 5 s.
  7. Voor een weerstands-/krachtregime, stimuleer de vis met een hoge frequentie gedurende een aanval van 5 minuten, drie keer, waarbij elke aanval wordt gescheiden door 5 minuten rust.
    OPMERKING: Terwijl vissen aan de ene kant van de kamer rusten, kunnen de krokodillenklemmen worden aangesloten op het elektrodenpaar aan de andere kant van de kamer en die extra vissen stimuleren.
  8. Verwijder na stimulatie voorzichtig vissen uit elke put door ze voorzichtig uit te spoelen met een plastic pipet en keer terug naar de broedmachine in vers tricaïnebevattend vismedium.
  9. Giet het tricainewater uit de kamer weg en gebruik een tang om rond te snijden en de agarose uit elke put te verwijderen. Spoel de putjes af met kraanwater en laat drogen.
    OPMERKING: Als u zilverdraadelektroden gebruikt, kan zich af en toe zilveroxide ophopen op het oppervlak van de draad na een stimulatie-experiment. Omdat zilveroxide minder geleidend is dan zilver, moet u, om de reproduceerbaarheid te behouden, zilveroxide voorzichtig van de draad wrijven met Kimwipes voordat u de opstelling opnieuw gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een snelle en nauwkeurige meting van het somietvolume
Een methode voor monstervoorbereiding, gegevensverzameling en volumetrische analyse die de snelle meting van spiergroei in zebravislarven mogelijk maakt, wordt beschreven. Spiergrootte kan worden gemeten bij levende dieren met behulp van vissen die op hun plasmamembranen zijn gelabeld met een membraangerichte GFP (β-actine: HRAS-EGFP) of mCherry (α-actine: mCherry-CAAX). Larven werden tijdelijk verdoofd met behulp van tricaïne, ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier rapporteren we een methode voor een nauwkeurige en efficiënte schatting van het spiervolume van levende zebravislarven in stadia of in genetische varianten waarin pigmentatie geen grote belemmering vormt voor beeldvorming en wanneer voorbijgaande anesthesie en / of immobilisatie goed wordt verdragen. Terwijl we laserscanning confocale microscopie hebben gebruikt, zijn de beschreven benaderingen van toepassing op draaiende schijf confocale of lichtbladmicroscopie en op elke andere methode die stapels afbeeldingen op ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs zijn diep schatplichtig aan de inspanningen van Hughes-lableden Drs Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin en Vladimir Snetkov voor de ontwikkeling van de beschreven protocollen, en aan Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau en Peter Currie voor het delen van plasmiden of zebravislijnen. SMH is een Medical Research Council (MRC) Scientist met Programme Grant G1001029, MR/N021231/1 en MR/W001381/1support. MA hield een MRC Doctoral Training Programme PhD Studentship van King's College London. Dit werk profiteerde van de goniometrische inbreng van David M. Robinson, geleerde, mentor en vriend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adhesive, Blu TackBostik--
Aerosol vacuum ---
AgaroseSigma-AldrichA9539-
Agarose, low gelling temperatureSigma-AldrichA9414Nadat het is gesmolten, houden op 37oC in een blokverwarming om in vloeibare vorm te blijven voor herhaald gebruik.
BlokverwarmingCole-ParmerSBH130-
BODIPY FL C5-ceramideThermo ScientificD3521Te verdunnen in viswater en te gebruiken bij 5 µM voor overnachtingsbebroeiing.
Krokodillenklemmen en draden---
Fiji/imageJNational Institutes of Health, NIH--
Vismedium, Viswater--Circulerend systeemwater verzameld vanuit het viscentrum.
Vismedium, E3 medium--E3 wordt beschreven in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, en 0,33 mM MgSO4 in gedistilleerd water).
FluorescentiemicroscoopLeicaLeica MZ16FFluorescentiemicroscopen van andere soort worden ook verwacht om geschikt te zijn.
GlasnaaldWorld Precision Instruments, Inc.1B100-6Te vuurpolijsten om schade aan de embryo's tijdens manipulatie te voorkomen.
Gras stimulatorGrass InstrumentsS88Stimulators van andere soort worden ook verwacht om geschikt te zijn.
Kimwipes, Delicate Task WipersKimberly-Clark Professional13258179-
Laser scanning microscoop (LSM) ZeissZeiss LSM 5 Exciter
Zeiss LSM 880		LSM van andere soort worden ook verwacht om geschikt te zijn.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plateThermo Scientific140675-
Objectief, 20×/1.0W water-immersieZeiss--
Pasteur Pipette, Gegradueerd 1 mLStarlab GroupE1414-0100-
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mLStarlab GroupE1414-1100-
Petrischaal, 60 mmSigma-AldrichP5481-
Plasmid, CMV-CeruleanChristina L. Hammond (University of Bristol)pCS2+_cerulean_kanR plasmid geïnjecteerd bij 25-75 pg bij één-cel stadium.  Citatie: Bussman J, en Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plasmid, pCS-mCherry-CAAXHenry Roehl (University of Sheffield)-Voor in vitro transcriptie met behulp van de SP6 promotor (plasmiden met andere membraanlabelingmarkers kunnen worden gebruikt);
gesynthetiseerd gekapte mRNA om te worden geïnjecteerd bij 100-200 pg bij één-cel stadium.
Pulse Controller Hoefer Scientific InstrumentsPC750-
Solderbout---
TricaineSigma-AldrichE10521Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat/ MS-222; op te lossen in viswater en te gebruiken bij 0,6 mM.
VolocityPerkin Elmer/Quorum Technologies Inc--
Uurwerkerstangen, No. 5---
Draad, PlatinaGoodfellowPT005142/120,40 mm in diameter; een dure alternatief van zilver.
Draad, ZilverAcros Organics3177300100,25 mm in diameter (een reeks diameters, dwz. 0,25-0,5 mm, werd getest, wat vergelijkbare resultaten opleverde).
Zebravis, myog:H2B-mRFPDavid M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute)-ZFIN officiële naam: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citatie: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Zebravis, α-actin:mCherry-CAAXPeter D. Currrie (ARMI, Monash University)-ZFIN officiële naam: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citatie: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, en Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Zebravis, β-actin:HRAS-EGFP--ZFIN officiële naam: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Citatie: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, en Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
ZEN softwareZeiss--
```

Referenties

  1. Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
  2. Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
  3. Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162(2011).
  4. Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123(2016).
  5. Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10(2019).
  6. Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
  7. Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
  8. Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247(2019).
  9. Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028(2019).
  10. Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish - Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728(2021).
  11. Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
  12. Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
  13. Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  14. Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567(2016).
  15. Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676(2017).
  16. Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
  17. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731(2018).
  18. Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
  19. Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
  20. Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
  21. Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
  22. Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161(2015).
  23. Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
  24. Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
  25. Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232(2018).
  26. Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
  27. Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
  28. Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
  29. Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
  30. Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
  31. Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
  32. Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
  33. Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
  34. Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
  35. Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
  36. Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
  37. Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
  38. Westerfield, M. The Zebrafish Book - A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
  39. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  40. Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751(2014).
  41. Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
  42. Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
  43. Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
  44. Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
  45. Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
  46. Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
  47. Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391(2013).
  48. Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Zebravisspierconfocale microscopieelektrische stimulatiemeting van spiervezelslive imagingmyotoomvolumeactiviteitsafhankelijke groeifour slice-methodezebravislarven
Real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.