Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Verrijking van van astrocyten afgeleide extracellulaire blaasjes uit menselijk plasma

3.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64107

⸱

3 augustus 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sant Pau Memory Unit, Department of Neurology, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Biomedical Research Institute Sant Pau, Universitat Autònoma de Barcelona, 2Center of Biomedical Investigation Network for Neurodegenerative Diseases (CIBERNED), 3Movement Disorders Unit, Department of Neurology, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, 4Department of Endocrinology and Nutrition, Hospital Clínic de Barcelona, August Pi i Sunyer Biomedical Research Institute - IDIBAPS, 5Spanish Biomedical Research Network in Physiopathology of Obesity and Nutrition (CIBEROBN)

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de verrijking van van astrocyten afgeleide extracellulaire blaasjes (ADEV's) uit menselijk plasma. Het is gebaseerd op de scheiding van EV's door polymeerprecipitatie, gevolgd door op ACSA-1 gebaseerde immunocapture van ADEV's. Analyse van ADEV's kan aanwijzingen bieden voor het bestuderen van veranderingen in ontstekingsroutes van levende patiënten, niet-invasief door vloeibare biopsie.

Samenvatting

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn biologische nanodeeltjes die door alle cellen worden uitgescheiden voor cellulaire communicatie en eliminatie van afvalstoffen. Ze nemen deel aan een breed scala aan functies door in te werken op en hun ladingen over te brengen naar andere cellen in fysiologische en pathologische omstandigheden. Gezien hun aanwezigheid in biovloeistoffen, vormen EV's een uitstekende bron voor het bestuderen van ziekteprocessen en kunnen ze worden beschouwd als een vloeibare biopsie voor het ontdekken van biomarkers. Een aantrekkelijk aspect van EV-analyse is dat ze kunnen worden geselecteerd op basis van markers van hun cel van herkomst, waardoor de omgeving van een specifiek weefsel in hun lading wordt weerspiegeld. Een van de grootste handicaps van EV-isolatiemethoden is echter het gebrek aan methodologische consensus en gestandaardiseerde protocollen. Astrocyten zijn gliacellen met een essentiële rol in de hersenen. Bij neurodegeneratieve ziekten kan de reactiviteit van astrocyten leiden tot veranderde EV-lading en afwijkende cellulaire communicatie, waardoor ziekteprogressie wordt vergemakkelijkt/verbeterd. Analyse van astrocyt-EV's kan dus leiden tot de ontdekking van biomarkers en potentiële ziektedoelen. Dit protocol beschrijft een 2-staps methode voor verrijking van astrocyt-afgeleide EV's (ADEV's) uit menselijk plasma. Ten eerste worden EV's verrijkt uit gedefibrineerd plasma via precipitatie op basis van polymeren. Dit wordt gevolgd door verrijking van ADEV's door middel van ACSA-1-gebaseerde immunocapture met magnetische microkralen, waarbij geresuspendeerde EV's worden geladen op een kolom die in een magnetisch veld is geplaatst. Magnetisch gelabelde ACSA-1+ EV's worden in de kolom vastgehouden, terwijl andere EV's erdoorheen stromen. Zodra de kolom uit de magneet is verwijderd, worden ADEV's geëlueerd en zijn ze klaar voor opslag en analyse. Om de verrijking van astrocytmarkers te valideren, kan gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) of andere specifieke astrocytische markers van intracellulaire oorsprong worden gemeten in het eluaat en worden vergeleken met de doorstroom. Dit protocol stelt een eenvoudige, tijdbesparende methode voor om ADEV's uit plasma te verrijken die kan worden gebruikt als een platform om astrocyt-relevante markers te onderzoeken.

Inleiding

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn een heterogene groep vliezige nanodeeltjes die door alle soorten cellen worden uitgescheiden en eiwitten, lipiden en nucleïnezuren vervoeren1. Microblaasjes (100-1000 nm), exosomen (30-100 nm) en apoptotische lichamen (1000-5000 nm) vormen de belangrijkste EV-typen, zoals onderscheiden door hun plaats van herkomst 2,3. EV's reguleren belangrijke fysiologische processen, zoals antigeenpresentatie en immuunresponsen4, receptorrecycling, metabolieteliminatie5 en cellulaire communicatie6. De regulatie van deze processen kan plaatsvinden door directe binding tussen eiwitten verrijkt in het EV-celmembraan en doelen in ontvangende cellen, en/of door de internalisatie en afgifte van hun lading in het cytoplasma van de ontvangende cel7. Hoewel EV's essentiële cellulaire functies vervullen, hebben ze vanuit een pathologisch perspectief steeds meer belangstelling gekregen op het gebied van kanker en neurologie. Verschillende onderzoeken hebben inderdaad aangetoond dat EV's kunnen helpen bij het bevorderen van tumorcelmigratie 8,9 of giftige eiwitaggregaten kunnen zaaien bij neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer10,11.

EV's kunnen worden geselecteerd en verrijkt uit biovloeistoffen op basis van celoppervlaktemarkers die verband houden met hun cel van herkomst, en zo de omgeving van een specifiek weefsel in hun lading weerspiegelen 12,13,14,15,16,17,18,19,20. Gezien hun aanwezigheid in bloed, hersenvocht (CSF), speeksel, urine en moedermelk, vormen EV's bovendien een uitstekend, niet-invasief hulpmiddel voor diagnose en kunnen ze worden beschouwd als een vloeibare biopsie voor het ontdekken van biomarkers. Dit is van bijzonder belang in de neurologie, gezien de moeilijkheden bij het bestuderen van hersenanalyten in andere toegankelijke vloeistoffen dan CSF.

Astrocyten hebben steeds meer belangstelling gekregen, omdat ze zich op het snijvlak van neurovasculaire communicatiebevinden 21. Onder fysiologische omstandigheden zijn ze verantwoordelijk voor het behoud van de bloed-hersenbarrière, de recycling van neurotransmitters, de toevoer van voedingsstoffen en groeifactoren naar neuronen en andere gliacellen 22,23,24 evenals neuro-immuunafweer, gezien hun metabolische plasticiteit van pro-inflammatoire naar ontstekingsremmende toestanden en vice versa 25,26,27. Een belangrijk mechanisme waarmee astrocyten hun regulerende functies vervullen, is door communicatie via EV's28,29. Reactieve astrocytose is een belangrijk kenmerk van verschillende neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer,30 meervoudige systeematrofie (MSA), progressieve supranucleaire verlamming (PSP)31 en amyotrofische laterale sclerose (ALS)32. Reactiviteit van astrocyten kan leiden tot veranderde EV-lading, afgifte van ontstekingsmediatoren en afwijkende cellulaire communicatie, waardoor de verspreiding van pathologie wordt vergemakkelijkt en neurodegeneratie wordt geleid10,11. Daarom is het bestuderen van van astrocyten afgeleide EV's (ADEV's) en veranderingen in hun lading een aantrekkelijke bron om neurodegeneratieve processen op een niet-invasieve manier te onderzoeken.

Momenteel bestaan er verschillende methodologieën voor de isolatie van EV's, elk met zijn bijbehorende voor- en nadelen33. Het is essentieel om te overwegen welke methode het meest geschikt is voor een specifiek gebruik, afhankelijk van de uiteindelijke toepassing van interesse. Op het gebied van neurologie, en meer specifiek in astrocytenstudies, is precipitatie op basis van polymeren gevolgd door immunocapture de meest gebruikte methode 12,18,19,20,34. Maar zelfs bij toepassing van dezelfde aanpak blijft er heterogeniteit bestaan tussen studies in de verschillende stappen die worden toegepast voor EV-isolatie. Daarom is er behoefte aan een duidelijke, stapsgewijze gestandaardiseerde methodologie om astrocyten EV-studies en de reproduceerbaarheid van het onderzoek te vergemakkelijken. Precipitatie op basis van polymeren vergemakkelijkt de screening van biomarkers, aangezien het een snelle, eenvoudige procedure is waarvoor geen complexe apparatuur nodig is, wat leidt tot een hoge opbrengst van EV's zonder hun biologische activiteit te beïnvloeden35.

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde, eenvoudige methode in twee stappen voor de verrijking van ADEV's uit humaan plasma. Het is gebaseerd op een op polymeren gebaseerde precipitatie van de totale EV-fractie, gevolgd door een immunocapture van astrocyt-EV's. Gezien de belangrijke functies van astrocyten, kan analyse van ADEV's licht werpen op de ontdekking van biomarkers en hersenontstekingsroutes die op een niet-invasieve manier kunnen worden bestudeerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het onderzoek dat in dit protocol wordt beschreven, is uitgevoerd met menselijke plasmamonsters van gezonde volwassen donoren van beide geslachten (leeftijdscategorie 65,9-81,3 jaar, 45,5% vrouwen), van het Sant Pau Initiative on Neurodegeneration (SPIN) cohort, Barcelona, Spanje36. Deelnemers gaven geïnformeerde toestemming. De studie is uitgevoerd volgens de internationale ethische richtlijnen voor medisch onderzoek die zijn opgenomen in de verklaring van Helsinki en de Spaanse wet. De Sant Pau Research Ethics Committee (CEIC) heeft het protocol voor het verzamelen en opslaan van menselijke plasmamonsters van het SPIN-cohort beoordeeld en goedgekeurd (#16/2013).

1. Verrijking van astrocyten EV's uit menselijk plasma

OPMERKING: Dit protocol omvat het gebruik van menselijke plasmamonsters. Alle details over reagentia en laboratoriummateriaal die in dit protocol worden gebruikt, zijn opgenomen in de materiaaltabel. Voor deze procedure is geen speciale apparatuur vereist, maar raadpleeg de veiligheidsoverwegingen van elk reagens, zoals gespecificeerd door elke fabrikant afzonderlijk.

  1. Monsterafname en opslag
    1. Verzamel bloed in lavendel EDTA vacutainerbuisjes, volgens gestandaardiseerde protocollen voor het verzamelen van plasma36,37. Centrifugeer bij 2000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C binnen 30-120 minuten na afname voor plasmascheiding. Scheid het plasma, de bovenste heldere vloeistof die als supernatant verschijnt, in aliquots van 500 μL.
    2. Om celresten te verwijderen, centrifugeert u de aliquots gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op 3000 x g . Herstel het bovendrijvende. Bewaar het plasma bij -80 °C tot analyse. Zoals gebruikelijk is bij analyses van biovloeistoffen, moeten de monsters vóór opslag worden gedoseerd en meer dan drie vries-dooicycli worden vermeden.
  2. Totale EV-verrijking
    OPMERKING: Alle gebruikte reagentia moeten worden gefilterd door een filter van 0.22 μm.
    1. Ontdooi 500 μL plasmamonsters. Voeg trombine toe in een verhouding van 1:100 om stollingsfactoren te verwijderen. Meng drie keer door inversie en laat het 5 minuten op kamertemperatuur staan.
    2. Voltooi het volume tot 1 ml met Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS): DPBS + 3x geconcentreerde proteaseremmercocktail (verdund van 10x proteaseremmer cocktailbouillon). Meng door inversie.
    3. Centrifugeer de monsters gedurende 20 minuten bij 6000 x g bij 4 °C. Herstel het bovendrijvende. Vul het volume aan met DBPS-werkoplossing om 1 ml te bereiken.
    4. Voeg 252 μL van de EV-precipitatieoplossing toe en meng door inversie driemaal. Incubeer gedurende 60 minuten bij 4 °C.
    5. Centrifugeer de monsters bij 1500 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C om de totale EV-fractie (pellet) neer te slaan. Verzamel 1 ml van de supernatant. Label de fractie als EV-verarmd plasma om te gebruiken als negatieve controle van EV-verrijkingsmarkers (geen EV's) en bewaar bij -80 °C.
    6. Centrifugeer de resterende pellet 5 minuten bij 1500 x g bij 4 °C. Gooi de resterende supernatant weg. Resuspendeer de pellet in 500 μL ultrapuur water met geconcentreerde protease en fosfataseremmers (eindconcentratie 3x, verdund uit een voorraad van 100x, zie Materiaaltabel).
    7. Pipetteer krachtig op en neer om de pellet los te maken en schuimvorming te voorkomen; Draai en schud op een roterende buisschudder gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur tot volledige resuspend. Zorg voor volledige resuspensie van de pellets, aangezien dit een cruciale stap is voor de volgende stap voor het vangen van het immuunsysteem.
  3. Immunocapture van ADEV's
    OPMERKING: ADEV's dragen astrocytmarkeringen. De geselecteerde marker voor ADEV-verrijking via immunocapture is GLAST. GLAST, wat staat voor glutamaat-aspartaattransporter (UniProtKB-P43003), is de meest voorkomende glutamaattransporter die voornamelijk tot expressie wordt gebracht door astrocyten in het cerebellum en de cerebrale neocortex38. Het anti-GLAST (ACSA-1, astrocyt cell surface antigene-1) antilichaam is specifiek voor een extracellulair epitoop van GLAST en is ontwikkeld voor de identificatie van astrocyten. Het is het meest gebruikte doelwit voor de immunovangst van ADEV's uit menselijk plasma 12,20,34.
    1. Voeg 10 μl anti-GLAST (ACSA-1) gebiotinyleerd antilichaam toe aan elk monster dat het totale EV-preparaat bevat. Meng goed en voorzichtig. Incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C op een roterende buisschudder.
    2. Voeg 10 μL magnetische microbeads toe geconjugeerd aan monoklonale anti-biotine antilichamen (muis IgG1). Meng goed en voorzichtig. Incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C op een roterende buisschudder.
    3. Plaats een microkolom in het magnetische veld van een MACS-scheider. Bereid de kolom voor door deze te spoelen met 500 μL PBS-0,5% runderserumalbumine (BSA). Gooi de doorstroom weg.
    4. Laad de EV/ACSA-1/microbead-ophanging op de kolom. Duw bij deze stap niet met de zuiger. Verzamel de doorstroom. Label dit als niet-astrocytische EV's (geen ADEV's) en bewaar het indien nodig als controle.
    5. Was de kolom twee keer met 500 μL PBS-0,5% BSA. Gooi de doorstroom weg.
    6. Verwijder de kolom uit de magnetische scheider en plaats deze in een opvangbuis van 1.5 ml met een lage hechting. Pipetteer 500 μL PBS-0,5% BSA op de kolom. Duw stevig met een zuiger in de kolom en vang het eluaat op.
    7. Label als ACSA-1+ EV's (ADEV's). Bewaar niet-gelyseerde EV's bij -20 °C voor korte perioden of bij -80 °C voor langere perioden (>6 maanden).
      OPMERKING: Anti-ACSA-1-antilichamen binden aan het GLAST-1/EAAT-1-epitoop. Magnetische microbeads binden zich met affiniteit aan het anti-ACSA-1-EV-complex. MACS-microkolommen bevatten een geoptimaliseerde matrix om een sterk magnetisch veld te genereren wanneer ze in een magneet worden geplaatst, wat nodig is om de gelabelde ADEV's te behouden.
      Voor een schematische weergave van de ADEV-verrijkingsprocedure, zie figuur 1.
  4. Lysis van EV's
    OPMERKING: EV's moeten volledig worden gelyseerd voor de detectie van intravesiculaire markers. Het gebruik van twee opeenvolgende methoden, zoals chemisch gevolgd door mechanische lysis, wordt aanbevolen.
    1. Voer een chemische lysis van EV's uit door eiwitextractiereagens (zie materiaaltabel) toe te voegen in een verhouding van 100 μL monster per 150 μL extractiereagens. Voeg 100x protease- en fosfataseremmers toe om een 1x eindconcentratie te bereiken. Draai krachtig en laat 15 minuten op kamertemperatuur staan.
    2. Voer een mechanische lysis uit door middel van een procedure in twee stappen: laat de chemisch gelyseerde EV-oplossing twee keer door een spuit lopen (G29-naald). Sonificeer de monsters vervolgens gedurende 45 s in een ultrasoon koudwaterbad. Vries de gelyseerde EV's in bij -80 °C.
    3. Ontdooi de monsters gedurende 5 minuten bij 37 °C. Vries opnieuw in bij -80 °C voor de opslag van gelyseerde EV's. Ontdooi opnieuw gedurende 5 minuten bij 37 °C vóór de analyse.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematische weergave van de tweestapsprocedure voor de verrijking van van astrocyten afgeleide EV's. In de eerste stap worden EV's verrijkt uit gedefibreerd menselijk plasma door op polymeren gebaseerde precipitatie- en centrifugatiestappen. Na totale EV-resuspensie worden astrocyt-EV's vervolgens geselecteerd door immunocapture met gebiotinyleerde anti-GLAST (ACSA-1) antilichamen en anti-biotine magnetische microbeads. Afkortingen: ACSA-1 = astrocyt celoppervlak antigeen-1; ADEV's = van astrocyten afgeleide extracellulaire blaasjes; DPBS = Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing; EV's = extracellulaire blaasjes; GLAST = glutamaat-aspartaattransporter; Geen ADEV's = niet-astrocytaire extracellulaire blaasjes; Geen EV's = geen extracellulaire blaasjes (EV-verarmd plasma); PIC = cocktail van proteaseremmers; RT = kamertemperatuur. Figuur gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Validatie van het protocol

  1. Karakterisering van de totale EV-fractie voorafgaand aan immunocapture
    1. Gebruik gelyseerde totale EV's (geresuspendeerde pellet na polymeerprecipitatie) en verdunde plasmamonsters voor de analyse van Western blot. Vul de monsters aan met 4x Laemmli monsterbuffer (5 μL voor 15 μL monster), kook gedurende 10 minuten op 90 °C en laad op 10% vlekvrije acrylamidegels.
    2. Voer SDS-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) uit in Tris/Glycine/SDS-buffer bij 80 V gedurende 30 min, gevolgd door 200 V gedurende 40 min. Verwijder na de SDS-PAGE de gel van de glasplaten en visualiseer het totale eiwitgehalte na een UV-excitatie van 1 minuut.
    3. Breng de eiwitten van de gel over naar een methanol-geactiveerd 0,2 μm PVDF-membraan via een halfdroog systeem bij 25 V, 2,5 A gedurende 10 minuten (zie Materiaaltabel voor details over apparatuur). Blokkeer na de overdracht het membraan gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in de blokkeerbuffer en incubeer vervolgens een nacht bij 4 °C met de primaire antilichamen tegen Alix (1:1000), CD9 (1:1000) of Calnexin (1:1000); zie Materiaaltabel voor details.
    4. Was het membraan driemaal gedurende 10 minuten in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (TBST) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met een secundair antilichaam tegen konijnen HRP verdund bij 1:7500 in blokkeerbuffer. Was het membraan in TBST vier keer gedurende 10 minuten. Voer alle wasbeurten en incubatiestappen uit met zacht schudden van het membraan op een bankschommelstoel.
    5. Meng in een verhouding van 1:1 de chemiluminescerende oplossing met de peroxidebuffer en incubeer de membranen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Belicht en verkrijg banden met behulp van een chemiluminescentiebeeldvormingssysteem (zie Materiaaltabel voor details).
  2. Validatie van de verrijking van astrocyt-specifieke merkers in ADEV-fractie
    OPMERKING: Gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) is het belangrijkste intermediaire filamenteiwit in astrocytaire cellen en een essentieel onderdeel van hun cytoskelet tijdens de ontwikkeling. GFAP kan worden gedetecteerd in hersenweefsel en biovloeistoffen, omdat het een bekende astrocytmarker is39. Daarom werd deze marker gekwantificeerd met behulp van een commerciële biomarkerdetectietechnologie om de verrijking van astrocyt-afgeleide markers in de ADEV-fractie aan te tonen. Deze biomarkertechnologie is een ultragevoelige techniek die het mogelijk maakt om afzonderlijke eiwitmoleculen te meten met een gevoeligheid die tot 1.000 keer groter is dan conventionele immunoasays. Deze techniek is gebaseerd op het gebruik van paramagnetische microdeeltjes in combinatie met antilichamen die zijn ontworpen om te binden aan specifieke doelen40,41 (zie Tabel met materialen).
    1. Gebruik gelyseerde EV-monsters voor de analyse van biomarkers. Om de verrijking van astrocytmarkers te testen, vergelijkt u GFAP-niveaus in het eluaat (ADEV's) versus de doorstroom (geen ADEV's) met behulp van een commerciële ultragevoelige immunoassay.
    2. Verdun de monsters in een verhouding van 1:4 (25 μl EV's + 75 μl analysebuffer), bereid de kalibratoren voor en voer de test uit in de detectieapparatuur voor biomarkers, zoals gespecificeerd in de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). De monsters kunnen direct op de plaat worden verdund.
    3. Test de monsters en kalibratoren in tweevoud. Het kwantificeringsbereik voor de GFAP-test was 1,37-1000 pg/ml. Gebruik het software-analyseplatform van de fabrikant om GFAP-concentraties te berekenen op basis van de kalibratiecurve.
    4. Om de variatiecoëfficiënt (CV) van het protocol voor de verrijking van astrocytmarkers te schatten, meet u de GFAP-niveaus in ADEV-preparaten verkregen uit identieke replicaten van gepoolde menselijke plasmamonsters en berekent u de CV als standaarddeviatie/gemiddelde x 100. In dit protocol werd de CV berekend met behulp van N = 10 identieke plasmamonsters.
  3. Validatie van de verrijking van EV-markers in ADEV-fractie
    1. Om de verrijking van EV-markers te valideren, meet u de Alix- en CD81-niveaus met ELISA (zie Materiaaltabel) in gelyseerde onverdunde EV-monsters, volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Test monsters en kalibratoren in tweevoud.
    2. Lees de platen af bij 450 nm en 570 nm met behulp van een microplaatlezer. Gebruik een lineaire kalibratiecurve om Alix- en CD81-concentraties te berekenen. Het kwantificeringsbereik voor de Alix-test was 47-3000 pg/ml en voor CD81 was het 0,156-10 ng/ml.
  4. Karakterisering van de grootte en morfologie van ADEV's
    1. Analyse van het volgen van nanodeeltjes
      1. Gebruik nanoparticle tracking analysis (NTA) om de deeltjesconcentratie en grootteverdeling van verse niet-gelyseerde EV-preparaten te meten.
      2. Verdun verse, niet-gelyseerde ADEV-suspensies (10 μL) met gefilterde PBS volgens het detectiebereik van het instrument (20-100 deeltjes/frame), met behulp van de meegeleverde software, neem drie video's van 60 s op met de volgende instellingen: spuitdebiet bij 30 a.u., cameraniveau bij 13 en de detectiedrempel bij 5. Corrigeer de deeltjesconcentraties voor het volume van het invoermonster, het volume EV-resuspensie en de verdunning die nodig zijn voor de NTA-meting.
        OPMERKING: Het wordt aanbevolen om vooraf een monster te visualiseren dat de EV-voertuigoplossing bevat om het matrixeffect en de zuiverheid van het medium waarin EV's worden geresuspendeerd te verifiëren.
    2. Cryo-elektronenmicroscopie
      1. Gebruik cryo-elektronenmicroscopie (Cryo-EM) om de aanwezigheid en morfologie van Ev's in verse, niet-gelyseerde ADEV-suspensies (4 μL) te bevestigen. Verglaas de monsters met behulp van een in de handel verzinkte vriezer op holle koolstofroosters met de volgende instellingen: 3.9 μL monster, wachttijd 10 s, vlektijd 2 s.
      2. Dompel onder in vloeibare ethaan-stikstof in een cryo-werkstation. Breng de roosters over naar een cryoholder die op -179 °C wordt gehouden voor transmissie-elektronenmicroscoopanalyse. Onderzoek de EV's met een transmissie-elektronenmicroscoop die werkt op een versnellende spanning van 200 kV en uitgerust is met een CCD-camera. Maak microfoto's met behulp van software.
  5. Analyse van co-precipitatie van lipoproteïnen
    1. Bepaal menselijke ApoB-spiegels in onverdund plasma, gelyseerde totale EV-monsters en gelyseerde ADEV-monsters met een immunoturbidimetrische test met behulp van een commerciële kit die is aangepast voor een commerciële autoanalyzer (zie Materiaaltabel voor meer details).
  6. Analyse van ontstekingsmarkers in ADEV's
    1. Gebruik een op kralen gebaseerde test (zie materiaaltabel) om de concentratie van 25 ontstekingsmarkers te kwantificeren: eotaxine, IFN Alpha2, IFN Gamma, IL-1 Alpha, IL-1 Beta, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-15, IL-17A, IL-17E/IL-25, IL-17F, IL-18, IP-10, MCP-1, MCP-3, MDC, MIP-1 Alpha, MIP-1 Beta, TGF Alpha, TNF Alpha, TNF Beta.
    2. Gebruik gelyseerde onverdunde EV-preparaten (25 μl) en incubeer de monsters met de korrels een nacht bij 4°C, volgens de instructies van de fabrikant. Was de plaat, incubeer met 25 μL detectie-antilichamen en incubeer gedurende 1 uur met agitatie bij kamertemperatuur.
    3. Voeg 25 μL Streptavidin-PE toe aan elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 150 μl schedevloeistof toe en incubeer gedurende 5 minuten onder roeren. Lees het plaatje af op de plaatlezer die aan het systeem is bevestigd.
      OPMERKING: Deze techniek is gebaseerd op immunoassays met behulp van antilichamen die zich binden aan het oppervlak van fluorescerend gecoate magnetische microbeads. Deze technologie codeert microsferen intern op kleur met verschillende kleurstoffen. Elk type microsfeer is gecoat met een specifiek vangstantilichaam, zodat meerdere geconjugeerde kralen de analyten vangen die in monsters zijn ingebed, waardoor de kwantitatieve multiplexdetectie van tientallen analyten tegelijk mogelijk is. Het systeem maakt gebruik van het op kralen gebaseerde multiplexed immunoassay-platform voor signaaldetectie43.

3. Gegevensanalyse

  1. Statistische analyses uitvoeren met commerciële software. Beoordeel de normaliteit van de gegevens met de Shapiro-Wilk-test. Test vergelijkingen met twee groepen met de Mann-Whitney U-test en vergelijkingen met drie groepen met de Kruskal-Wallis-test en de post-hoccorrectie van Dunn. Stel de significantie in op p < 0,05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De isolatie van ADEV's uit plasma dat is verzameld bij gezonde donoren is met succes bereikt. Een op polymeren gebaseerde precipitatiemethode werd gebruikt om de totale EV-fractie te verkrijgen, gevolgd door een immunocapture met magnetische microbeads om ADEV's te verkrijgen.

Western blot-analyse van de totale EV-fractie voorafgaand aan de immuno-capture-stap wees op het ontbreken van calnexine (cellulaire besmettingsmarker) en de aanwezigheid van Alix en het...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

EV's hebben een sterke belangstelling gekregen voor biomedisch onderzoek vanwege hun diagnostische en therapeutische potentieel. Momenteel is een van de grootste handicaps met betrekking tot EV-isolatiemethoden het gebrek aan methodologische consensus en gestandaardiseerde protocollen. Deze studie biedt een gedetailleerd protocol voor de verrijking van astrocyten EV's uit menselijk plasma via precipitatie op basis van polymeren en BLAST-immunocapture.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Dr. Belbin meldde dat hij persoonlijke vergoedingen ontving van ADx NeuroSciences buiten het ingediende werk. Dr. Alcolea meldde dat hij persoonlijke vergoedingen ontving voor diensten van de adviesraad en/of sprekershonoraria van Fujirebio-Europe, Roche, Nurtricia, Krka Farmacéutica, Zambon S.A.U. en Esteve buiten het ingediende werk. Dr. Lleó heeft buiten het ingediende werk gediend als consultant of in adviesraden voor Fujirebio-Europe, Roche, Biogen, Grifols en Nutricia. Dr. Fortea meldde dat hij persoonlijke vergoedingen ontving voor diensten in de adviesraden, arbitragecommissies of sprekershonoraria van AC Immune, Novartis, Lundbeck, Roche, Fujirebio en Biogen buiten het ingediende werk. Drs. Alcolea, Belbin, LLeó en Fortea rapporteren dat ze een patent hebben voor markers van synaptopathie bij neurodegeneratieve ziekten (in licentie gegeven aan ADx, EPI8382175.0). Er werden geen andere onthullingen gemeld. Alle andere auteurs hebben niets anders te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag de hulp van Soraya Torres, Shaimaa El Bounasri El Bennadi en Oriol Sanchez Lopez bedanken voor het hanteren en voorbereiden van monsters. We willen ook graag de medewerking erkennen van José Amable Bernabé, van de ICTS "NANBIOSIS", eenheid 6 (Eenheid van CIBER in Bioingineering, Biomaterials & Nanomedicine) van het Barcelona Materials Science Institute, Marti de Cabo Jaume van de Elektronenmicroscopie Eenheid van de Universitat Autonoma de Barcelona, Dr. Marta Soler Castany en Lia Ros Blanco van het Flow Cytometry Platform van het Sant Pau Biomedical Research Institute (IIB-Sant Pau), evenals Dr. Joan Carles Escolà-Gil van de groep Pathofysiologie van lipidegerelateerde ziekten bij IIB-Sant Pau voor hulp bij respectievelijk de NTA-, cryo-EM-, Luminex- en ApoB-bepalingen.

De auteurs erkennen de financiële steun van de Jérôme Lejeune Foundation (Project #1941 en #1913 aan MFI en MCI), Instituto de Salud Carlos III (PI20/01473 aan JF, PI20/01330 aan AL, PI18/00435 aan DA en INT19/00016 aan DA), het National Institute of Health (1R01AG056850-01A1, R21AG056974, en R01AG061566 aan JF), de Alzheimer's Association en Global Brain Health Institute (GBHI_ALZ-18-543740 aan MCI), de Vereniging voor Frontotemporale Degeneratie (Clinical Research Postdoctoral Fellowship, AFTD 2019-2021) naar ODI, en de Societat Catalana de Neurologia (Premi Beca Fundació SCN 2020 naar MCI). Dit werk werd ook ondersteund door het CIBERNED-programma (Programma 1, Ziekte van Alzheimer naar AL en SIGNAL-studie. SS is een ontvanger van een postdoctorale beurs "Juan de la Cierva-Incorporación" (IJC2019-038962-I) van de Agencia Estatal de Investigación, Ministerio de Ciencia e Innovación (Gobierno de España).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-Alix primair antilichaam voor Western blottingEMD MilliporeABC40
µMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-602De µMACS Separator wordt gebruikt in combinatie met µ Columns en MACS MicroBeads.
Anti-calnexin primair antilichaam voor Western blottingGenetexGTX109669
Anti-CD9 primair antilichaam voor Western blottingCell Signaling13174
Blocker BSA (10%) 200 mLThermo Fisher37525
Bransonic 1510E-MT Ultrasoon badBranson
COBAS 6000 autoanalyzerRoche DiagnosticsAnalyzer voor immunoturbidimetrische bepaling van ApoB; commerciële autoanalyzer
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free)Roche11873580001
Digital Micrograph 1.8 micrograafsoftware
Dulbecco's PBS Mg++, Ca++ vrij 500 mLThermo Fisher14190144
EveryBlot Blocking BufferBioRad12010020
Exoquick (exosoom precipitatie oplossing 5 mL) + Trombine System BioscienceEXOQ5TM-1ExoQuick 20 mL kan ook worden gekocht (EXOQ20A-1)
Gatan 895 USC 4000 camera
GeneGnome XRQ chemiluminescentie beeldvormingssysteemSyngene
Human CD81 antigeen (CD81) ELISA kitCusabioCSB-EL004960HU
Human Programmed cell death 6-interacting protein (PDCD6IP) ELISA kitCusabioCSB-EL017673HU
Immun-Blot PVDF MembraanBioRad1620177
JEOL 2011 transmissie elektronenmicroscoop JEOL LTDUitgerust met een CCD Gatan 895 USC 4000 camera (Gatan 626, Gatan, Pleasanton, USA)
Lavender EDTA BD Vacutainer K2E buisjesBecton Dickinson367525
Leica EM GP Leica Microsystemcommerciële plunge vriezer
Low binding microtubes 1,5 mLDeltalab4092.3NS
MACS µ Columns met zuigers Miltenyi Biotec130-110-905µ Columns met zuigers zijn speciaal ontworpen voor isolatie van exosomen uit lichaamsvloeistoffen
MACS MultistandMiltenyi Biotec130-042-303
MAGPIX plate readerLuminex Corporation80-073Luminex's xMAP multiplexing unit (Luminex xPonent v 4.3 software)
MicroBead Kit100 μL Anti-GLAST (ACSA-1)-Biotin, human, mouse, rat – kleine maat; 100 μL Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec130-095- 825
MILLIPLEX MAP Kit Human cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel A magnetische kralenpanelEMD MilliporeHCYTA-60K-25
M-PER Mammalian Protein Extractie Reagens 25 mLThermo Fisher78503Voor bepaalde toepassingen zoals Western blot, kunnen agressievere lyse buffers worden gebruikt (bijv. RIPA)
MultiSkan SkyHigh Microplate SpectrofotometerThermofisherA51119500C
NanoSight NS300Malvern PanalyticalNTA; 3.4 versie
Pierce Halt Protease and Phosphatase Inhibitor CocktailThermo Fisher78441
Polypropyleen spuit (G29)PeroxFarma1mL spuit; 0.33x12mm-G29x1/2"
Secundair anti-konijn antilichaamThermo Fisher10794347
Simoa GFAP Discovery KitQuanterix102336
Simoa, SR-X instrumentQuanterixSR-X Ultra-Gevoelige Biomarker Detectie Systeem; commerciële biomarker detectie technologie
Specific Protein Test Apolipoprotein B - APOB (100 det) COBAS C/CIRoche Diagnostics3032574122
SuperSignal West FemtoThermo Fisher34095Ultra-gevoelige verbeterde chemiluminescentie (ECL) HRP substraat 
Trans-Blot Turbo Transfer SysteemBioRad1704150

Referenties

  1. Pathan, M., et al. Vesiclepedia 2019: a compendium of RNA, proteins, lipids and metabolites in extracellular vesicles. Nucleic Acids Research. 47, 516-519 (2019).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Gustafson, D., Veitch, S., Fish, J. E. Extracellular vesicles as protagonists of diabetic cardiovascular pathology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 71(2017).
  4. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  5. Harding, C. V., Heuser, J. E., Stahl, P. D. Exosomes: Looking back three decades and into the future. Journal of Cell Biology. 200 (4), 367-371 (2013).
  6. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  7. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  8. Hood, J. L., San Roman, S., Wickline, S. A. Exosomes released by melanoma cells prepare sentinel lymph nodes for tumor metastasis. Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).
  9. Rak, J. Microparticles in cancer. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 888-906 (2010).
  10. Ledreux, A., et al. Small neuron-derived extracellular vesicles from individuals with down syndrome propagate tau pathology in the wildtype mouse brain. Journal of Clinical Medicine. 10 (17), 3931(2021).
  11. Winston, C. N., et al. Prediction of conversion from mild cognitive impairment to dementia with neuronally derived blood exosome protein profile. Alzheimer's and Dementia: Diagnosis, Assessment and Disease Monitoring. 3, 63-72 (2016).
  12. Goetzl, E. J., Schwartz, J. B., Abner, E. L., Jicha, G. A., Kapogiannis, D. High complement levels in astrocyte-derived exosomes of Alzheimer's disease. Annals of Neurology. 83 (3), 544-552 (2018).
  13. Fiandaca, M. S., et al. Identification of preclinical Alzheimer's disease by a profile of pathogenic proteins in neurally derived blood exosomes: A case-control study. Alzheimer's and Dementia. 11 (6), 600-607 (2015).
  14. Mustapic, M., et al. Plasma extracellular vesicles enriched for neuronal origin: A potential window into brain pathologic processes. Frontiers in Neuroscience. 11, 278(2017).
  15. Hamlett, E. D., et al. Neuronal exosomes reveal Alzheimer's disease biomarkers in Down syndrome. Alzheimer's and Dementia. 13 (5), 541-549 (2017).
  16. Goetzl, E. J., et al. Abnormal levels of mitochondrial proteins in plasma neuronal extracellular vesicles in major depressive disorder. Molecular Psychiatry. 26 (12), 7355-7362 (2021).
  17. Goetzl, E. J., et al. Neuron-derived exosome proteins may contribute to progression from repetitive mild traumatic brain injuries to chronic traumatic encephalopathy. Frontiers in Neuroscience. 13, 452(2019).
  18. Goetzl, E. J., et al. Cargo proteins of plasma astrocyte-derived exosomes in Alzheimer's disease. FASEB Journal. 30 (11), 3853-3859 (2016).
  19. Goetzl, E. J., et al. Traumatic brain injury increases plasma astrocyte-derived exosome levels of neurotoxic complement proteins. FASEB Journal. 34 (2), 3359-3366 (2020).
  20. Nogueras-ortiz, C. J., et al. Astrocyte- and neuron-derived extracellular vesicles from Alzheimer's disease patients effect complement-mediated neurotoxicity. Cells. 9 (7), 1618(2020).
  21. Haydon, P. G., Carmignoto, G. Astrocyte control of synaptic transmission and neurovascular coupling. Physiological Reviews. 86 (3), 1009-1031 (2006).
  22. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  23. Rothstein, J., et al. Antisense knockout of glutamate transporters reveals a predominant role for astroglial glutamate transport in excitotoxicity and clearance of extracellular glutamate. Neuron. 16 (3), 675-686 (1996).
  24. Vasile, F., Dossi, E., Rouach, N. Human astrocytes: structure and functions in the healthy brain. Brain Structure and Function. 222 (5), 2017-2029 (2017).
  25. Balu, D. T., et al. Neurotoxic astrocytes express the D-serine synthesizing enzyme, serine racemase, in Alzheimer's disease. Neurobiology of Disease. 130, 104511(2019).
  26. Sofroniew, M. V. Astrocyte barriers to neurotoxic inflammation. Nature Reviews Neuroscience. 16 (5), 249-263 (2015).
  27. Yun, S. P., et al. Block of A1 astrocyte conversion by microglia is neuroprotective in models of Parkinson's disease. Nature Medicine. 24 (7), 931-938 (2018).
  28. Bianco, F., et al. Acid sphingomyelinase activity triggers microparticle release from glial cells. EMBO Journal. 28 (8), 1043-1054 (2009).
  29. Datta Chaudhuri, A., et al. Stimulus-dependent modifications in astrocyte-derived extracellular vesicle cargo regulate neuronal excitability. Glia. 68 (1), 128-144 (2020).
  30. Serrano-Pozo, A., Gómez-Isla, T., Growdon, J. H., Frosch, M. P., Hyman, B. T. A phenotypic change but not proliferation underlies glial responses in Alzheimer disease. American Journal of Pathology. 182 (6), 2332-2344 (2013).
  31. Tong, J., et al. Low levels of astroglial markers in Parkinson's Disease: relationship to α-synuclein accumulation. Neurobiology of Disease. 82, 243-253 (2015).
  32. Kamo, H., et al. A distinctive distribution of reactive astroglia in the precentral cortex in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 74 (1), 33-38 (1987).
  33. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  34. Winston, C. N., Goetzl, E. J., Schwartz, J. B., Elahi, F. M., Rissman, R. A. Complement protein levels in plasma astrocyte-derived exosomes are abnormal in conversion from mild cognitive impairment to Alzheimer's disease dementia. Alzheimer's and Dementia: Diagnosis, Assessment and Disease Monitoring. 11, 61-66 (2019).
  35. Niu, Z., et al. Polymer-based precipitation preserves biological activities of extracellular vesicles from an endometrial cell line. PLoS ONE. 12 (10), 1-21 (2017).
  36. Alcolea, D., et al. The Sant Pau Initiative on Neurodegeneration (SPIN) cohort: A data set for biomarker discovery and validation in neurodegenerative disorders. Alzheimer's and Dementia: Translational Research and Clinical Interventions. 5, 597-609 (2019).
  37. O'Bryant, S. E., et al. Guidelines for the standardization of preanalytic variables for blood-based biomarker studies in Alzheimer's disease research. Alzheimer's and Dementia. 11 (5), 549-560 (2015).
  38. Kim, K., et al. Role of excitatory amino acid transporter-2 (EAAT2) and glutamate in neurodegeneration: Opportunities for developing novel therapeutics. Journal of Cellular Physiology. 226 (10), 2484-2493 (2011).
  39. Middeldorp, J., Hol, E. M. GFAP in health and disease. Progress in Neurobiology. 93 (3), 421-443 (2011).
  40. Mora, J., et al. Next generation ligand binding assays-review of emerging technologies' capabilities to enhance throughput and multiplexing. AAPS Journal. 16 (6), 1175-1184 (2014).
  41. Chunyk, A. G., et al. A multi-site in-depth evaluation of the quanterix simoa from a user's perspective. AAPS Journal. 20 (1), 1-12 (2018).
  42. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: A position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 26913(2014).
  43. Hansen, E. O., et al. Millipore xMap® Luminex (HATMAG-68K): An accurate and cost-effective method for evaluating Alzheimer's biomarkers in cerebrospinal fluid. Frontiers in Psychiatry. 12, 1-9 (2021).
  44. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogenous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  45. Gauthier, S. A., et al. Enhanced exosome secretion in Down syndrome brain - a protective mechanism to alleviate neuronal endosomal abnormalities. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 65(2017).
  46. Cataldo, A. M., et al. Endocytic pathway abnormalities precede amyloid β deposition in sporadic alzheimer's disease and down syndrome: Differential effects of APOE genotype and presenilin mutations. American Journal of Pathology. 157 (1), 277-286 (2000).
  47. Cataldo, A. M., et al. Down syndrome fibroblast model of Alzheimer-related endosome pathology: Accelerated endocytosis promotes late endocytic defects. American Journal of Pathology. 173 (2), 370-384 (2008).
  48. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  49. Van Deun, J., et al. EV-TRACK: Transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Extracellulaire vesikels van astrocytenEV verrijkingpolymere precipitatieimmunocapturemagnetische microbeadsACSA 1 markergliaal fibrillair zuur eiwitvloeibare biopsie
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.