Intestinale permeabiliteit bepalen met lucifergeel in een apical-out enteroïde model

Samenvatting

Het huidige protocol schetst een methode die lucifergeel gebruikt in een apicale enteroïde model om de darmdoorlaatbaarheid te bepalen. Deze methode kan worden gebruikt om paracellulaire permeabiliteit te bepalen bij enteroïden die inflammatoire darmziekten modelleren, zoals necrotiserende enterocolitis.

Samenvatting

Enteroïden zijn een opkomend onderzoeksinstrument in de studie van inflammatoire darmziekten zoals necrotiserende enterocolitis (NEC). Ze worden traditioneel gekweekt in de basolaterale (BO) conformatie, waarbij het apicale oppervlak van de epitheelcel naar het binnenste lumen is gericht. In dit model is de toegang tot het luminale oppervlak van enteroïden voor behandeling en experimenten een uitdaging, wat het vermogen beperkt om gastheer-pathogeen interacties te bestuderen. Om dit te omzeilen, werd een neonatale apicale-out (AO) -model voor necrotiserende enterocolitis gemaakt. Aangezien veranderingen in de permeabiliteit van intestinale epitheelcellen pathognomonisch zijn voor NEC, schetst dit protocol het gebruik van lucifergeel (LY) als een marker van paracellulaire permeabiliteit. LY doorkruist de intestinale epitheliale barrière via alle drie de belangrijkste paracellulaire paden: porie, lek en onbeperkt. Het gebruik van LY in een AO-model maakt een bredere studie van de permeabiliteit in NEC mogelijk. Na IRB-goedkeuring en ouderlijke toestemming werden chirurgische monsters van darmweefsel verzameld van menselijke premature pasgeborenen. Intestinale stamcellen werden geoogst via cryptisolatie en gebruikt om enteroïden te laten groeien. Enteroïden werden tot volwassenheid gekweekt en vervolgens AO getransformeerd of achtergelaten in BO-conformatie. Deze werden niet behandeld (controle) of werden behandeld met lipopolysaccharide (LPS) en onderworpen aan hypoxische voorwaarden voor de inductie van in vitro NEC. LY werd gebruikt om te beoordelen op permeabiliteit. Immunofluorescente kleuring van het apicale eiwit zonula occludens-1 en basolateraal eiwit β-catenine bevestigde AO-conformatie. Zowel AO- als BO-enteroïden behandeld met LPS en hypoxie vertoonden een significant verhoogde paracellulaire permeabiliteit in vergelijking met controles. Zowel AO- als BO-enteroïden vertoonden een verhoogde opname van LY in het lumen van de behandelde enteroïden in vergelijking met controles. Het gebruik van LY in een AO enteroïde model maakt het mogelijk om alle drie de belangrijkste routes van paracellulaire permeabiliteit te onderzoeken. Het maakt bovendien het onderzoek mogelijk naar gastheer-pathogeen interacties en hoe dit de permeabiliteit kan beïnvloeden in vergelijking met het BO enteroïde model.

Inleiding

Enteroïden zijn driedimensionale (3D) structuren die zijn afgeleid van orgaanbeperkte menselijke darmstamcellen ^1,2. Ze bestaan volledig uit epitheliale afstamming en bevatten alle gedifferentieerde intestinale epitheelceltypen². Enteroïden behouden ook cellulaire polariteit die bestaat uit een apicale luminale oppervlakte die een binnencompartiment vormt en een basolateraal oppervlak dat naar de omliggende media is gericht. Enteroïden zijn een uniek model omdat ze de kenmerken behouden van de gastheer waaruit ze zijn gegenereerd³. Enteroïden gegenereerd uit premature menselijke baby's vertegenwoordigen dus een model dat nuttig is voor het onderzoeken van ziekten die voornamelijk deze populatie treffen, zoals necrotiserende enterocolitis (NEC).

Het traditionele enteroïde model wordt gekweekt in een basolaterale (BO) conformatie, waarbij de enteroïde is ingepakt in een koepel van keldermembraanmatrix (BMM). BMM induceert de enteroïde om een 3D-structuur te behouden met het basolaterale oppervlak aan de buitenkant. BO-enteroïden zijn een geschikt model voor NEC dat de kloof overbrugt tussen tweedimensionale (2D) primaire menselijke cellijnen en in vivo diermodellen ^2,4. NEC wordt geïnduceerd in enteroïden door pathogenen zoals LPS of bacteriën in de media rond de enteroïden te plaatsen, gevolgd door blootstelling aan hypoxische aandoeningen ^2,3. De uitdaging met het BO enteroïde NEC-model is dat het geen effectieve studie van gastheer-pathogeeninteracties mogelijk maakt, die in vivo op het apicale oppervlak plaatsvinden. Veranderingen in de darmdoorlaatbaarheid zijn te wijten aan deze gastheer-pathogeen interacties. Om beter te begrijpen hoe permeabiliteit de pathofysiologische basis van ziekte beïnvloedt, moet een model worden gemaakt dat betrekking heeft op de behandeling van het apicale oppervlak.

Co et al. waren de eersten die aantoonden dat volwassen BO-enteroïden kunnen worden geïnduceerd om een apicale (AO) conformatie te vormen door de BMM-koepels te verwijderen en ze in media⁵ te resuspenderen. Dit artikel toonde aan dat AO-enteroïden de juiste epitheliale polariteit behielden, alle darmceltypen bevatten, de intestinale epitheelbarrière handhaafden en toegang gaven tot het apicale oppervlak⁵. Het gebruik van AO-enteroïden als NEC-model bereikt een fysiologische reproductie van het ziekteproces en studie van gastheer-pathogeeninteracties.

Een belangrijke bijdrage aan de pathofysiologie van NEC is verhoogde darmdoorlaatbaarheid⁶. Verschillende moleculen zijn voorgesteld als een manier om te testen op intestinale permeabiliteit in vitro⁷. Onder deze, lucifer geel (LY) is een hydrofiele kleurstof met excitatie en emissie pieken bij 428 nm en 540 nm, respectievelijk⁸. Terwijl het alle belangrijke paracellulaire routes doorkruist, is het gebruikt om paracellulaire permeabiliteit te evalueren in verschillende toepassingen, waaronder de bloed-hersenen en intestinale epitheliale barrières ^8,9. De traditionele toepassing van LY maakt gebruik van cellen gekweekt in monolagen op een semi-permeabel oppervlak¹⁰. LY wordt aangebracht op het apicale oppervlak en kruist paracellulaire tight junction-eiwitten om samen te komen aan de basolaterale kant. Hogere LY-concentraties in het basolaterale compartiment wijzen op verminderde tight junction-eiwitten met daaropvolgende intestinale epitheelcelbarrièreafbraak en verhoogde permeabiliteit¹⁰. Het is ook beschreven in 3D BO enteroid modellen waar LY werd toegevoegd aan de media en individuele enteroïden werden afgebeeld voor opname van LY in het lumen¹¹. Hoewel dit kwalitatieve analyse mogelijk maakt via de visualisatie van LY-opname, is kwantitatieve analyse beperkt. Dit protocol schetst een unieke techniek die LY gebruikt om paracellulaire permeabiliteit te beoordelen met behulp van een in vitro NEC enteroïde model in AO enteroïden met behoud van 3D-oriëntatie. Deze methode kan worden gebruikt voor zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse van de permeabiliteit.

Protocol

Het huidige onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de goedkeuring van de Institutional Review Board (IRB, # 11610, 11611) aan de Universiteit van Oklahoma. Ouderlijke toestemming was vereist voordat menselijke chirurgische monsters werden verzameld volgens de IRB-specificaties. Na IRB-goedkeuring en ouderlijke toestemming werd menselijk dunne darmweefsel verkregen van zuigelingen (gecorrigeerde zwangerschapsduur (GA) variërend van 36-41 weken op het moment van monsterverzameling, allemaal met een voorgeschiedenis van vroeggeboorte bij een geschatte GA van 25-34 weken, 2: 1 M: F) die een operatie ondergingen voor NEC of andere intestinale resectie, zoals stoma-verwijdering of atresieherstel. Enteroïden werden gegenereerd uit weefsel verkregen uit het jejunum of ileum.

1. Van menselijke baby's afgeleide enteroïde culturen: cryptisolatie en beplating van heel weefsel

1. Bereid kweekmedia voor, chelaatbuffer #1 en chelaatbuffer #2 (tabel 1) naar aanleiding van het vorige rapport⁴. Bewaar chelaatbuffers bij 4 °C en gebruik ze binnen 48 uur.
2. Bereid menselijke minigut-media (tabel 1). Bewaar de bouillon bij −20 °C en verwarm voor gebruik in een waterbad van 37 °C.
3. Bereid 50% L-WRN geconditioneerde media (CM) (tabel 1). Bewaar de bouillon bij 4 °C gedurende maximaal 1 week.
   OPMERKING: 100% L-WRN-basis voor de geconditioneerde media wordt beschreven in een protocol van Miyoshi et ^al.12.
4. Genereer enteroïden uit dunne darmweefselmonsters die zijn verkregen uit chirurgische monsters na het vorige rapport⁴. Plaat vier putten van enteroïden in een 24-well plaat van een 0,75-2,5 g stuk darmweefsel.
   OPMERKING: Enteroïden kunnen met succes worden gegenereerd uit weefsel dat is opgeslagen in 30 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium in een conische buis van 50 ml bij 4 °C gedurende maximaal 48 uur.
5. Plaats de 24-well plaat in een 37 °C, 5% CO₂ incubator ondersteboven gedurende 15-20 minuten om de polymerisatie van BMM domes mogelijk te maken⁴.
6. Voeg 500 μL 50% L-WRN CM (zoals beschreven in stap 1.3) met 0,5 μL Y-27632, ROCK-remmer (RI, zie Materiaaltabel) toe aan elk putje. Vervang na 2-3 dagen door 50% L-WRN CM zonder RI.

2. Generatie van AO enteroïden

1. Kweek enteroïden ingebed in BMM gedurende 7-10 dagen met 50% L-WRN CM⁴.
2. Verwijder de media en voeg 500 μL celterugwinningsoplossing (CRS, zie Materiaaltabel) toe aan één put. Schraap de koepel, pipetteer meerdere keren op en neer en voeg vervolgens de CRS/enteroïde/BMM-oplossing toe aan de volgende put.
3. Schraap de koepel, pipetteer meerdere keren op en neer en plaats de oplossing in een microcentrifugebuis. Voeg 500 μL CRS toe aan het tweede putje, pipetteer op en neer en voeg het vervolgens toe aan het eerste putje. Breng deze oplossing over in dezelfde microcentrifugebuis van 1,5 ml.
4. Herhaal stap 2.3 en voeg twee putten samen in één microcentrifugebuis totdat alle putinhoud in CRS is.
   OPMERKING: Meer dan twee putten kunnen worden samengevoegd in een grotere conische buis van 15 ml als grote volumes AO-enteroïden worden gegenereerd. Het handhaven van een CRS-verhouding van 500 μL per put is belangrijk om volledige oplosbaarheid van BMM te garanderen.
5. Plaats de microcentrifugebuizen (stap 2.3) met een samengevoegde CRS/enteroïde/BMM-oplossing gedurende 1 uur bij 4 °C op een rotator om de BMM op te lossen.
6. Centrifugeer de oplossing bij 200 x g gedurende 3 minuten bij 4°C en verwijder vervolgens het supernatant met een micropipette en laat de pellet achter.
7. Resuspendeer de enteroïde pellet in 1 ml van 50% L-WRN CM (zoals bereid in stap 1.3) per microcentrifugebuis. Pipetteer voorzichtig 500 μL van de opnieuw gesuspendeerde enteroïde/media-oplossing in elk putje van de ultralage bevestigings- 24-well weefselkweekplaten (zie Materiaaltabel).
8. Incubeer bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 3 dagen voorafgaand aan het experimenteren.

3. Verificatie van AO-enteroïde conformatie via immunofluorescente kleuring van de hele montering

1. Na incubatie van de enteroïden in mediasuspensie gedurende 3 dagen pipetteert u de enteroïde/mediasuspensie van één put in een microcentrifugebuis.
2. Centrifugeer de enteroïde/media suspensie bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant met een micropipette.
3. Resuspendeer de enteroïden in 20 μL BMM. Pipetteer 10 μL enteroïde suspensie op een microscoopglaasje en verspreid deze in een dunne laag van ongeveer 1 cm bij 1 cm vierkant. Herhaal dit met de resterende 10 μL enteroïdsuspensie op een apart deel van dezelfde dia, zodat er twee uitstrijkjes van enteroïde/BMM-suspensie zijn.
4. Laat de enteroïde/BMM-uitstrijkjes gedurende 15 minuten stollen bij kamertemperatuur (RT).
5. Werk in de zuurkast, plaats de glijbaan in een vlekkenpot en vul met 4% paraformaldehyde totdat deze het enteroïde / BMM-uitstrijkje bedekt (~ 30 ml voor één dia als u een glazen vlekpot met 10 schuifcapaciteit gebruikt). Laat 30 minuten (bij kamertemperatuur) toe voordat de fixatie plaatsvindt.
   LET OP: 4% paraformaldehyde is gevaarlijk en kan oogbeschadiging/irritatie, huidirritatie en kanker veroorzaken. Werk altijd onder een zuurkast bij gebruik. Draag beschermende handschoenen en persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren ervan. Gooi het weg in een goedgekeurde afvalcontainer.
6. Gooi 4% paraformaldehyde weg in een geschikte afvalcontainer. Voeg 30 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan de kleurpot of totdat PBS de enteroïde / BMM-uitstrijkjes bedekt. Laat het 3 minuten op RT zitten en gooi de PBS vervolgens weg in de paraformaldehyde-afvalfles. Herhaal deze stap nog twee keer voor een totaal van drie wasbeurten.
7. Vul een nieuwe vlekkenpot met 30 ml 0,5% Triton X-100 verdund in PBS. Plaats de glijbaan met enteroïde/BMM-uitstrijkjes in de Triton-oplossing en laat deze gedurende 20 minuten doordringen op RT.
8. Gooi de 0,5% Triton X-100 verdund in PBS weg. Voeg 30 ml PBS toe aan de beitspot en laat deze 3 minuten staan. Gooi de PBS weg door te decanteren.
9. Veeg de glijbaan voorzichtig rond de enteroïde / BMM-uitstrijkjes en pas op dat u ze niet verstoort. Teken met behulp van een hydrofobe barrièrepen (barrière PAP-pen, zie Tabel met materialen) een cirkel rond elk van de enteroïde /BMM-uitstrijkjes. Maak een serum van 20%, specifiek voor het dier waarin het secundaire antilichaam is grootgebracht (zie materiaaltabel).
10. Leg de microscoopglaasje plat op de laboratoriumbank. Blokkeer de dia gedurende 1 uur bij 4 °C door 100 μL specifiek 20% serum vanaf stap 3.9 te pipetteren op elk van de enteroïde/BMM-uitstrijkjes die door de hydrofobe barrièrepen worden geringd.
11. Bereid een oplossing van 100 μL met verdunningen van respectievelijk 1:100 en 1:200 van β-catenine en ZO-1 primaire antilichamen, verdund in PBS.
    OPMERKING: Elk primair antilichaam moet van een ander dier zijn om ervoor te zorgen dat ze verschillende immunofluorescente kanalen hebben wanneer ze in beeld worden gebracht. De huidige studie maakt gebruik van een muis β-catenine antilichaam en een konijn ZO-1 antilichaam (zie Tabel van Materialen).
12. Tik op de schuif op het aanrecht om het 20% serum te verwijderen en veeg voorzichtig droog, waarbij u moet oppassen dat u de enteroïde / BMM-uitstrijkjes niet verstoort. Pipetteer 100 μL β-catenine/ZO-1 primaire antilichaamoplossing op een van de enteroïde/BMM-uitstrijkjes. Pipetteer 100 μL PBS zonder primair antilichaam op het andere enteroïde/BMM-uitstrijkje als negatieve controle.
13. Bekleed de bodem van een plastic container met een natte papieren handdoek om een bevochtigde container te maken. Plaats de glijbaan in de container en zorg ervoor dat u oplossingen die de enteroïde / BMM-uitstrijkjes bedekken, niet verstoort. Plaats het deksel op de container om af te sluiten en bewaar het plat bij 4 °C 's nachts.
    OPMERKING: Laat de glijbaan niet uitdrogen. Zorg ervoor dat de container gesloten is om uitdroging te voorkomen.
14. Zodra u klaar bent om verder te gaan, tikt u op de schuifregelaar om primaire antilichamen en PBS uit de enteroïde / BMM-uitstrijkjes te verwijderen.
15. Voer een wasstap uit door de dia in een vlekkenpot te plaatsen en te vullen met 30 ml PBS of totdat PBS de enteroïde / BMM-uitstrijkjes bedekt. Laat het 3 minuten op kamertemperatuur staan. Gooi de PBS weg en herhaal deze stap nog twee keer voor een totaal van drie wasbeurten.
16. Bereid 200 μL secundaire antilichamen voor twee verschillende immunofluorescentiekanalen, waarbij elk antilichaam een verdunning van 1:1000 in PBS heeft (zie materiaaltabel). Houd de oplossing uit de buurt van licht.
17. Pipetteer 100 μL secundaire antilichaamoplossing op elk van de enteroïde/BMM-uitstrijkjes. Zet het in het donker en laat het 1 uur op RT staan.
18. Tik op de dia op de toonbank om secundaire antilichamen te verwijderen. Herhaal de wasstappen die in stap 3.15 zijn beschreven en zorg ervoor dat alle wasbeurten in het donker worden uitgevoerd.
19. Voeg een druppel 4′,6-diamidino-2-fenylindool (Fluoroshield met DAPI, zie Materiaaltabel) montagemedium toe aan elk van de enteroïde/BMM-uitstrijkjes en breng een coverslip aan om ervoor te zorgen dat beide uitstrijkjes voldoende bedekt zijn. Voorkom dat bubbels onder de dekenslip worden opgesloten. Houd de dia in het donker totdat u klaar bent om onder de microscoop te bekijken.
    OPMERKING: Onmiddellijke beeldvorming van de dia's levert de meest optimale resultaten op; dia's kunnen echter plat worden bewaard in een bevochtigde container bij 4 °C en tot 1 week na de toevoeging van DAPI in beeld worden gebracht.

4. Inductie van experimentele NEC

1. Zorg ervoor dat AO-enteroïden ten minste 72 uur vóór gebruik in suspensie zijn geweest.
2. Pipetteer voorzichtig alle enteroïde / media-suspensie van elke put in een microcentrifugebuis.
   OPMERKING: Meerdere putten kunnen worden samengevoegd in één conische buis van 15 ml als een groot volume putten wordt behandeld. Voor dit protocol wordt minimaal drie putjes per behandelgroep aanbevolen.
3. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten bij RT en verwijder het supernatant.
4. Voeg 10 μL 5 mg/ml lipopolysaccharide (LPS, zie materiaaltabel) toe aan 500 μL 50% LWRN CM per putje (eindconcentratie 100 μg/ml LPS).
5. Resuspend AO enteroïden aangewezen als de behandelingsgroep in 50% LWRN + LPS en aliquot 500 μL suspensie naar een 24-well ultra-low bevestigingsplaat. Resuspend AO enteroïden aangewezen als onbehandelde controles in 500 μL van 50% LWRN CM per put. Aliquot 500 μL van deze suspensie naar een aparte 24-well ultra-low bevestigingsplaat.
6. Induceer hypoxie in de met LPS behandelde AO-enteroïden via een modulaire incubatorkamer (MIC) met 1% O₂, 5% CO₂ en 94% N₂ volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). Behandel de enteroïden met hypoxie en LPS gedurende 24 uur.
7. Plaats de onbehandelde en met LPS + hypoxie behandelde culturen, nog steeds in de MIC-kamer, gedurende 24 uur in een 37 °C, 5% CO_2-incubator .

5. Meting van paracellulaire permeabiliteit met behulp van LY

1. Pipetteer de enteroïde/media-suspensie van elke put voorzichtig in een microcentrifugebuis. Warme DPBS en 50% LRWN CM in een waterbad van 37 °C.
2. Centrifugeer de enteroïde/media suspensie bij 300 x g gedurende 3 minuten bij RT.
3. Verwijder de media. Was de enteroïden met warme DPBS van 500 μL.
4. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 min bij RT. Verwijder het supernatant met een micropipette.
5. Herhaal stap 5.3-5.4 nogmaals voor een totaal van twee keer.
6. Voeg na het wassen 450 μL warme 50% LWRN CM toe (zoals bereid in stap 1.3).
7. Voeg 50 μL 2,5 mg/ml LY (eindconcentratie is 0,25 μg/μL, zie materiaaltabel) toe aan elk putje en draai voorzichtig om te mengen. Plaats in een 37 °C, 5% CO₂ incubator gedurende 2 uur.
8. Pipetteer de enteroïde/media-suspensie van elke put voorzichtig in een microcentrifugebuis.
9. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten bij RT, verwijder vervolgens het supernatant en laat de enteroïde pellet achter.
10. Was de enteroïden met 500 μL warme DPBS.
11. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten bij RT en verwijder vervolgens het supernatant dat de enteroïde pellet achterlaat.
12. Herhaal stap 5.10-5.11 nog drie keer voor een totaal van vier wasbeurten.
13. Resuspendeer elke pellet met 1.000 μL koude DPBS en pipetteer krachtig op en neer om de enteroïden te dissociëren.
14. Bereid normen voor de LY-standaardcurve verdund in DPBS (100 ng/ml; 50 ng/ml; 25 ng/ml; 12,5 ng/ml; 6,25 ng/ml; 3,13 ng/ml; 1,57 ng/ml; 0 ng/ml).
15. Pipetteer 150 μL van elk monster per put in drievoud op een plaat met 96 putten.
16. Meet de fluorescentie bij een excitatiepiek van 428 nm en emissiepiek van 536 nm op een plaatlezer die fluorescentie kan lezen (zie Materiaaltabel). Bereken met behulp van statistische software (zie Materiaaltabel) de concentraties door de standaardcurve te interpoleren en een curve met vier parameters te gebruiken.

Resultaten

AO-conformatie
Enteroïden die gedurende 72 uur in 50% LWRN-media zijn gesuspendeerd, gaan uit van een AO-conformatie (figuur 1). Dit werd bevestigd via immunofluorescente kleuring met behulp van enteroïde hele mounts van het apicale eiwit, zonula occludens-1 (ZO-1) en basolateraal eiwit, β-catenine (figuur 1). AO-enteroïden tonen ZO-1 (groen) op het buitenste, apicale oppervlak van de enteroïde, terwijl β-catenine (rood) zich op het ...

Discussie

Intestinale permeabiliteit is complex en weerspiegelt de epitheliale barrièrefunctie. De darmbarrière bestaat uit een enkele laag epitheelcellen die transcellulair en paracellulair transport bemiddelt¹⁴. Paracellulaire permeabiliteit is afhankelijk van tight junction-eiwitten die de ruimte tussen epitheelcellen afdichten¹⁴. Binnen dit paracellulaire transport zijn er drie verschillende paden waarlangs moleculen elkaar kunnen kruisen: porie, lek en onbeperkt

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
[leu] 15-gastrine 1	Millipore Sigma	G9145-.1MG
100 µm steriele celstrainer	Corning	431752
100% LWRN geconditioneerd media	Gemaakt in-house volgens Miyoshi et al.12
24-wells weefselkweekplaat	Corning	3526
96-wells zwarte, heldere bodemplaat	Greiner Bio-One	655090
A-83-01	R&D Systems	2939/10
Alexa Fluor 488 geit anti-konijn secundaire ab, 1:1000	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 594 geit anti-muis secundaire ab, 1:1000	Invitrogen	A-11032
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
Anti-zonula occludens-1 konijn primaire ab, 1:200	Cell Signaling	#D6L1E
Anti-β-catenin muis primaire ab, 1:100	Cell Signaling	#14-2567-82
B-27 supplement zonder Vitamine A	Thermo Fisher Scientific	17504-044
Barrier PAP pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
BMM (Matrigel)	Corning	CB-40230C
Cell Recovery Solution	Corning	354270
Dissectie schaar
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11-965-118
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	11320-082
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14-190-144
Epidermale Groeifactor (EGF)	Millipore Sigma	GF144
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)	Millipore Sigma	EDS-500G
EVOS m7000 beeldvormingssysteem	Invitrogen	AMF7000
Foetaal bovien serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-525
Fluoroshield met DAPI	Millipore Sigma	F6057-20mL
Pincet
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15-750-060
Glas dekglasjes
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061
GraphPad Prism 9	Dotmatics
Insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Lipopolysaccharide (LPS)	Millipore Sigma	L2630-25MG
Lucifer Yellow CH, Lithium Salt	Invitrogen	L453
Modulaire incubator kamer	Billups Rothenberg Inc.	MIC101
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethaan sulfonzuur (HEPES)	Thermo Fisher Scientific	15630-080
N-Acetylcysteïne	Millipore Sigma	A9165-5G
Nicotinamide	Millipore Sigma	N0636-100G
Penicilline-Streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140-148
Gekoelde schommelende emmercentrifuge
Gekoelde tafel microcentrifuge
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
SB202190	Millipore Sigma	S7067-5MG
SpectraMax iD3 microplate reader	Molecular devices
Buis Revolver Rotator	ThermoFisher Scientific	88881001
Ultra-lage hechting 24-wells weefselkweekplaat	Corning	3473
Y-27632, ROCK inhibitor (RI)	Tocris	1254