Voorbereiding van een niet-cardiomyocytencelsuspensie voor single-cell RNA-sequencing van een post-myocardinfarct volwassen muizenhart

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol om een voldoende hoeveelheid enkele niet-cardiomyocyten met hoge levensvatbaarheid te isoleren uit een post-myocardinfarct (MI) muizenhart. Dit kan worden gebruikt voor daaropvolgende single-cell sequencing, flowcytometrie-analyse en primaire celcultuur.

Samenvatting

Myocardinfarct (MI) is een van de meest voorkomende hart- en vaatziekten, met een toenemende mortaliteit wereldwijd. Niet-cardiomyocyten zijn goed voor meer dan de helft van de totale hartcelpopulatie en ze dragen bij aan adaptieve compensaties bij myocardletsel, waaronder ontstekingsreacties, weefselherstel en littekenvorming. Om de post-MI cardiale micro-omgeving te bestuderen, wordt single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) veel gebruikt om verschillende hartceltypen en intercellulaire communicatie te identificeren. Onder de procedures van scRNA-seq monstervoorbereiding is het voorbereiden van de celsuspensie een van de meest kritieke stappen, omdat de levensvatbaarheid van de cel de kwaliteit van de scRNA-seq-resultaten kan beïnvloeden. Daarom hebben we een experimenteel protocol ontworpen voor het bereiden van een niet-cardiomyocytencelsuspensie van post-MI-muizenharten met een extra focus op het verbeteren van de levensvatbaarheid van de cel door milde spijsverteringsenzymen te kiezen, de verteringstijd te regelen en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) toe te passen. Ten slotte isoleerden we CD45⁺ cellen uit de niet-cardiomyocytencelsuspensie verkregen via dit protocol, en vervolgens voerden we scRNA-seq uit.

Inleiding

Myocardinfarct (MI) is een van de meest voorkomende hart- en vaatziekten en de mortaliteit ervan neemt over de hele wereld toe¹. MI wordt veroorzaakt door een onvoldoende bloedtoevoer naar het omliggende myocardium, wat een gevolg kan zijn van een kransslagaderblokkade die optreedt bij atherosclerotische plaqueruptuur. Hoewel percutane coronaire interventie (PCI) de sterftecijfers van acute MI-patiënten heeft verminderd, blijft de hoge prevalentie van hartfalen na MI een probleem². De belangrijkste pathofysiologie die ten grondslag ligt aan post-MI hartfalen is de compenserende reactie van het lichaam op hartletsels, waarbij de dode hartspier wordt vervangen door niet-contractiele fibrotische littekens. Deze adaptieve reacties zijn aanzienlijk afhankelijk van lokale ontsteking gemedieerd door de interacties tussen meerdere celtypen en hartweefselcellen, en deze ontsteking wordt nu beschouwd als een potentieel therapeutisch doelwit om fibrotische littekenvorming te verminderen en dus te beschermen tegen post-MI hartfalen ^3,4. Interessant is dat de micro-omgeving op de infarctplaats een tijdsafhankelijke overgang ervaart in de infiltrerende celtypen en functies in verschillende stadia van MI ^1,5. Veel studies hebben aangetoond dat niet-cardiomyocyten (bijv. Immuuncellen, fibroblasten en endotheelcellen) een centrale rol spelen bij post-MI-ontsteking en weefselherstel ^5,6. In de afgelopen jaren is single-cell sequencing op grote schaal gebruikt als een krachtig hulpmiddel voor het ophelderen van de betrokkenheid en functies van niet-cardiomyocyten in de post-MI micro-omgeving ^7,8_. Dit geeft inzicht in de pathofysiologie van post-MI letsel en herstel en de ontwikkeling van mogelijke therapieën tegen post-MI hartfalen.

High-throughput RNA sequencing (RNA-Seq) is een techniek die wordt gebruikt om volledige transcriptomen in detail te bestuderen met behulp van next-generation sequencing (NGS)^7,8,9. Onlangs heeft de ontwikkeling van scRNA-Seq een revolutie teweeggebracht in het biomedische onderzoeksveld. Vergeleken met conventionele bulksequencing analyseert scRNA-Seq genexpressieprofielen en transcriptionele heterogeniteit op het niveau van één cel ^7,8. Deze techniek bevordert het onderzoek van de cellulaire pathofysiologie van MI ^9,10 aanzienlijk door verschillende circulerende celtypen in de post-MI micro-omgeving te identificeren en de interactie tussen cardiomyocyten en niet-cardiomyocyten bloot te leggen. Deze bevindingen dragen verder bij aan het ontdekken van nieuwe therapeutische doelen voor post-MI hartfalen. Over het algemeen omvat het op scRNA-seq gebaseerde post-MI-experiment drie hoofdsecties: (1) de vaststelling van een post-MI-diermodel; 2) de bereiding van de celsuspensie; en (3) monstersequencing en gegevensanalyse. Opmerkelijk is dat het voorbereiden van de celsuspensie de meest kritieke stap is in de voorbereiding van het scRNA-Seq-experiment, omdat de kwaliteit van de celsuspensie de nauwkeurigheid van de resultaten bepaalt.

Dit protocol is ontworpen om een niet-cardiomyocytencelsuspensie uit het post-MI hartweefsel te extraheren; Veelbetekenend is dat de specifieke details voor het behoud van de levensvatbaarheid en resolutie van cellen zijn opgenomen. Ondertussen is de apparatuur die in dit protocol wordt gebruikt, zoals chirurgische kits voor muizen, knaagdierventilatoren en centrifuges, te vinden in de meeste dierexperimentele centra en biomedische laboratoria, en dus zijn de experimentkosten van dit protocol relatief laag. Bovendien, als tijdspunten en plaatsen van infarct als variabelen worden beschouwd, kan dit protocol worden toegepast om een breed scala aan klinische scenario's te simuleren, vooral voor de post-MI-complicaties.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren aan de Zhejiang University en werden goedgekeurd door de Animal Advisory Committee aan de Zhejiang University.

1. Linker anterieure dalende coronaire ligatie (LAD ligatie) operatie

OPMERKING: Acht weken oude mannelijke C57BL / 6J-muizen werden als modellen gebruikt. De harten werden geoogst 2 weken na MI. Linker anterieure dalende kransslagaderligatiechirurgie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven en aangetoond¹¹.

1. Desinfecteer de chirurgische instrumenten vóór de operatie met 70% ethanol.
2. Weeg de muis en verdoof de muis vervolgens met intraperitoneale injecties van 1% pentobarbitalnatrium (50 mg / kg). Observeer de teen-knijpreflex en meet de ademhalingsfrequentie om de diepte van de anesthesie tijdens de procedure te evalueren.
3. Plaats de muis op de operatietafel met een verwarmingskussen van 37 °C. Gebruik oogheelkundige zalf om uitdroging van de ogen te voorkomen.
4. Ontharing van de linker precordiale borst en nek met ontharingscrème en gebruik wattenstaafjes om haren te verwijderen. Desinfecteer de huid met jodophor, gevolgd door 70% alcohol om het gebied drie keer schoon te maken.
5. Voer een middellijn cervicale incisie (0,8-1,0 cm) uit onder een microscoop. Scheid de huid, spieren en weefsel rond de luchtpijp en breng vervolgens een canule van 20 G in de luchtpijp in.
   OPMERKING: Observeer tijdens het inbrengen van de canule in de luchtpijp onder microscopisch zicht om ervoor te zorgen dat de buis niet in de slokdarm wordt ingebracht.
6. Sluit de muis aan op een knaagdierventilator die is ingesteld op 0,2 ml getijdenvolume met 150 slagen per minuut.
7. Snijd de muizenborst schuin langs de midclaviculaire lijn met een steriele schaar. Ontleed het onderhuidse weefsel om de ribben bloot te leggen.
8. Gebruik een steriele schaar om de huid schuin langs de linker midden-claviculaire lijn (0,8-1,0 cm) te knippen. Voer linker thoracotomie uit om de derde en vierde ribben te scheiden om het hart bloot te leggen. Gebruik een rib retractor voor een duidelijk zicht.
9. Open het hartzakje met een gebogen tang en laat vervolgens de linker voorste dalende slagader (onder het linker atriumaanhangsel) los met behulp van een 7-0 zijden hechtdraad. Een bleke voorste wand van de linker ventrikel geeft aan dat de myocardiale perfusie met succes wordt onderbroken.
10. Laat het ribretractor los en hecht de thoracale incisie in lagen met een 5-0 zijden hechtdraad terwijl de lucht uit de borst wordt verdreven. Hecht de nekincisie met een 5-0 hechtdraad zijden hechtdraad.
11. Verwijder de tracheale buis van de muis zodra de spontane ademhaling is hersteld. Injecteer intraperitoneaal 0,5 ml voorverwarmde steriele zoutoplossing. Injecteer buprenorfine (0,1 mg/kg) elke 12 uur subcutaan om pijn te minimaliseren.
12. Plaats ten slotte de muis op het verwarmingskussen om te wachten op reanimatie. Controleer de muis om ervoor te zorgen dat deze niet lijdt aan overmatige dyspneu of bloedingen via visuele observatie.
13. Breng de muis terug naar zijn kooi nadat hij wakker is geworden. Controleer de muis de eerste week dagelijks om te controleren of de mobiliteit, verzorging en eetgewoonten voldoende zijn. Volgens de behoeften van het experiment, oogst het hart op verschillende tijdstippen na MI.
    OPMERKING: In dit protocol werd de eencellige suspensie 2 weken na MI met het hart bereid.

2. Voorbereiding van de cardiale eencellige suspensie

1. Voorbereiding van de oplossingen en media
   1. Cardiale weefseldissociatiebuffer: Meng 10 mg collagenase IV (600 U / ml), 5 mg dispase II (0, 5 U / ml) en 50 μl DNase I (100 μg / ml) in 5 ml RPMI 1640. Verwarm dit medium voor gebruik voor gebruik voor op 37 °C in een waterbad.
   2. Celwasbuffer: Bereid 1% BSA of 10% FBS in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, PH 7.4) en bewaar bij 4 °C of op ijs.
   3. Perfusieoplossing: Voorkoel PBS (PH 7.4) als perfusieoplossing.
   4. Rode bloedcel (RBC) lysis buffer: Gebruik de RBC lysis buffer zoals vermeld door de fabrikant.
      OPMERKING: Raadpleeg de materiaaltabel voor de lijst van reagentia en apparatuur die in dit onderzoek worden gebruikt.
2. Euthanaseer de muis door een intraperitoneale pentobarbital natrium (150 mg / kg) injectie.
3. Hartdissectie
   1. Plaats de muis in rugligging door de achterpoten op hun plaats te bevestigen met plakband.
   2. Spray het lichaam met 70% ethanol en snijd vervolgens verticaal door de buikhuid en spieren terwijl u vermijdt de lever te doorboren. Open voorzichtig de thorax en vermijd het doorboren van het hart.
   3. Gebruik de voorgekoelde PBS (PH 7.4) om de linker ventrikel te perfuseren totdat de kleurloze perfusievloeistof wordt waargenomen (ongeveer 15 ml PBS [pH 7.4] is nodig).
   4. Til het hart voorzichtig op van de thorax met een tang en knip het overtollige weefsel weg dat aan de buitenkant van het hart is bevestigd met een oogheelkundige schaar. Plaats het hart in 1 ml voorgekoelde PBS (PH 7,4) in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
4. Enzymatische dissociatie van het hartweefsel
   1. Breng het muizenhart over in een put van een 24-putplaat met 150 μL van de hartweefseldissociatiebuffer op ijs en snijd het in kleine stukjes (~ 1 mm) met een schaar.
   2. Breng het gehakte hartweefsel over in een centrifugebuis van 15 ml met 5 ml van de weefseldissociatiebuffer.
      OPMERKING: Het aanbevolen buffervolume voor dissociatie van hartweefsel is 5 ml / hart.
   3. Plaats de centrifugebuis gedurende 1 uur bij 37 °C in de elektrisch thermostatische zuigerschudder bij 125 tpm. Pipetteer de weefselsuspensie 10 keer per 20 min op en neer.
   4. Filter de celsuspensie door een 70 μm celzeef om onverteerd weefsel en klonten te verwijderen. Voeg 25 ml van de celwasbuffer toe om de originele buis te spoelen en breng deze vervolgens over om de celzeef te spoelen. Filter vervolgens de celsuspensie door een celzeef van 40 μm om celklonten verder te verwijderen.
   5. Centrifugeer de gefilterde celsuspensie gedurende 5 minuten bij 300 x g bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspensie het celmonster vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) in 1x RBC-lysisbuffer.
   6. Voeg vier keer meer volume van de celwasbuffer toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C op 300 x g .
   7. Verwijder het supernatant en resuspensie van de cellen in 10 ml van de celwasbuffer. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   8. Verwijder het supernatant en resuspensie van de cellen in 1 ml van de celwasbuffer.
   9. Meng 18 μL van de celsuspensie met 2 μL van acridine sinaasappel (AO)/propidium jodide (PI) kleuringsoplossing (9:1) en voeg 10 μL van het mengsel toe aan een telkamerschuif. Evalueer de celaantallen en levensvatbaarheid met behulp van een automatische celteller.

Resultaten

Een eencellige suspensie met hoge vitaliteit werd verkregen door toepassing van sectie 2 van dit protocol. Er konden echter nog steeds celfragmenten worden waargenomen (figuur 1A); daarom werd fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) uitgevoerd om de kwaliteit verder te verbeteren¹⁶. Na FACS neemt de gemiddelde celgrootte af van 9,6 μm tot 9,1 μm ( tabel 1), wat suggereert dat het aandeel celfragmenten in de celsuspensie effectief kan worden ver...

Discussie

Dit artikel was bedoeld om een protocol te beschrijven om enkele niet-cardiomyocyten te isoleren van muizenharten post MI. Het protocol kan worden toegepast om verschillende soorten cellen in de post-MI-micro-omgeving met hoge kwaliteit te isoleren, waaronder immuuncellen, endotheelcellen en fibroblasten. Drie essentiële factoren zijn cruciaal voor het verkrijgen van een hoogwaardige celsuspensie voor single-cell sequencing. De eerste is de instelling van de enzymatische spijsvertering. Het is belangrijk om de tijd van v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acridine Orange / Propidium Iodide Stain	Logos biosystems	F23001
Automated Cell Counter	Logos biosystems	L20001
Bovine Serum Albumin	Servicebio	G5001	Cytoprotectieve effect
Cell Counting Slides	Logos biosystems	L12001
Collagenase Type IV	Gibco	17104019	Dierlijke enzymen
Dispase II	Sigma	D4693	Dierlijke enzymen
Dnase I	Roche	11284932001	Voorkomen van celklompjes
Falcon 40μm Cell Strainer	Falcon	352340	Verwijder celklompjes
Falcon 70μm Cell Strainer	Falcon	352350	Verwijder onverteerd weefsel en klonten
Flow Cell Sorter	Beckman Coulter	B25982
Iodophor	OU QING SI	10054963976859
Needle Holder	FST	12061-01
Ophthalmic Forceps	RWD	F14012-10
Ophthalmic Scissors	RWD	S11036-08
Phosphate Buffered Saline	Servicebio	G4202-500ML
RBC Lysis Buffer	Beyotime	C3702-120ml	Verwijder rode bloedcellen
Rib Retractor	FST	17005-04
Rodent Ventilator	Harvard	730043
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093	Solvent oplossing van enzym
Sterile Scissor	RWD	S14014-10