Methodenartikel

Humane microglia-achtige cellen: differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen en in vitro live-cel fagocytosetest met behulp van humane synaptosomen

DOI:

10.3791/64323

⸱

18 augustus 2022

 , 
1Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Translation Science Program, Morningside Graduate School of Biomedical Sciences, University of Massachusetts Chan Medical School

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft het differentiatieproces van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) in microglia-achtige cellen voor in vitro experimenten. We nemen ook een gedetailleerde procedure op voor het genereren van menselijke synaptosomen uit iPSC-afgeleide lagere motorneuronen die kunnen worden gebruikt als substraat voor in vitro fagocytosetests met behulp van live-cell imaging-systemen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia zijn de residente immuuncellen van myeloïde oorsprong die homeostase in de micro-omgeving van de hersenen handhaven en een belangrijke speler zijn geworden bij meerdere neurologische ziekten. Het bestuderen van menselijke microglia in gezondheid en ziekte vormt een uitdaging vanwege het extreem beperkte aanbod van menselijke cellen. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) afgeleid van menselijke individuen kunnen worden gebruikt om deze barrière te omzeilen. Hier wordt gedemonstreerd hoe menselijke iPSC's kunnen worden gedifferentieerd in microglia-achtige cellen (iMG's) voor in vitro experimenten. Deze iMG's vertonen de verwachte en fysiologische eigenschappen van microglia, waaronder microglia-achtige morfologie, expressie van de juiste markers en actieve fagocytose. Daarnaast wordt documentatie verstrekt voor het isoleren en labelen van synaptosoomsubstraten afgeleid van menselijke iPSC-afgeleide lagere motorneuronen (i3LMN's). Een live-cell, longitudinale beeldvormingstest wordt gebruikt om de overspoeling van menselijke synaptosomen gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof te monitoren, waardoor onderzoek naar de fagocytische capaciteit van iMG mogelijk is. De hierin beschreven protocollen zijn breed toepasbaar op verschillende gebieden die de menselijke microgliabiologie en de bijdrage van microglia aan ziekten onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia zijn de residente immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CZS) en spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling van het CZS. Microglia zijn ook belangrijk in de volwassen hersenen voor het handhaven van homeostase en het actief reageren op trauma- en ziekteprocessen. Cumulatief bewijs toont aan dat microglia een belangrijke bijdrage leveren aan de pathogenese van meerdere neurologische en neurodegeneratieve ziekten 1,2. Hoewel de huidige kennis over microgliale biologie voornamelijk is afgeleid van muismodellen, hebben recente studies belangrijke verschillen tussen muizen- en menselijke microglia opgehelderd, wat de noodzaak onderstreept van het ontwikkelen van technologieën om de genetica en biologische functies van menselijke microglia te bestuderen 3,4. Isolatie van microglia uit ontleed primair weefsel kan microglia-eigenschappen ernstig wijzigen5, waardoor de resultaten die met dergelijke cellen worden verkregen, mogelijk worden verstoord. Het algemene doel van deze methode is om menselijke iPSC's te differentiëren in iMG's, waardoor een celkweeksysteem wordt geboden om menselijke microglia onder basale omstandigheden te bestuderen. Bovendien is een fagocytosetest met behulp van een volledig menselijk modelsysteem hierin opgenomen als een middel om de functionaliteit van iMG's te bestuderen, zowel als een kwaliteitscontrolemaatstaf als om iMG-disfunctie in de context van ziekte te beoordelen.

Meerdere protocollen voor microglia differentiatie van iPSC's zijn onlangs in de literatuur naar voren gekomen 6,7,8,9,10. Mogelijke nadelen van sommige protocollen zijn langere of lange perioden van differentiatie, de toevoeging van meerdere groeifactoren en/of complexe experimentele procedures 6,9,10. Hier wordt een "gebruiksvriendelijke" differentiatiemethode aangetoond die aspecten van microglia-ontogenie recapituuleert door differentiatie van iPSC's in voorlopercellen die primitieve macrofaagprecursoren (PMP's) worden genoemd)7,11. PMP's worden gegenereerd zoals eerder beschreven, met enkele optimalisaties hierin gepresenteerd12. De PMP's bootsen MYB-onafhankelijke dooier-zak-afgeleide macrofagen na, die tijdens de embryonale ontwikkeling microglia veroorzaken door de hersenen binnen te dringen vóór de sluiting van de bloed-hersenbarrière13. Om PMP's terminaal te differentiëren in iMG's, gebruikten we een snelle en vereenvoudigde monocultuurmethode op basis van protocollen van Haenseler et al. en Brownjohn et al., met enkele aanpassingen om een efficiënte microgliadifferentiatiemethode te genereren waarin iMG's robuust microglia-verrijkte markers tot expressie brengen 7,8. Deze differentiatiemethode kan worden gereproduceerd in laboratoria met expertise in de cultuur van iPSC's en met onderzoeksdoelen gericht op het bestuderen van microgliabiologie met behulp van een menselijk modelsysteem.

iPSC-afgeleide microglia vormen een biologisch relevante bron van menselijke microglia voor in vitro experimenten en zijn een belangrijk hulpmiddel om microgliale canonieke functies, waaronder fagocytose, te onderzoeken. Microglia zijn de professionele fagocyten van de hersenen en het CZS, waar ze celresten, geaggregeerde eiwitten en afgebroken myelineopruimen 14. Microglia functioneren ook bij synaptische remodellering door synapsen te overspoelen en in de verdediging tegen externe infecties door fagocytose van pathogenen 15,16. In dit protocol wordt fagocytose door iMG's beoordeeld met behulp van menselijke synaptosomen als materiaal voor iMG-overspoeling. Hiertoe wordt een beschrijving beschreven voor het isoleren van synaptosomen afgeleid van humane i3 LMN's. De i3LMN-afgeleide humane synaptosomen zijn gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof die kwantificering mogelijk maakt van synaptosomen gelokaliseerd in zure compartimenten tijdens fagosoomverwerking en afbraak in vitro. Een fagocytosetest met behulp van live-cell microscopie wordt getoond voor het monitoren van het dynamische proces van microglia-engulfment in realtime. Deze functionele test legt een basis om mogelijke defecten in microgliale fagocytose in gezondheid en ziekte te onderzoeken met behulp van een compleet menselijk systeem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Alle reagentia die in dit protocol worden gebruikt, moeten steriel zijn en alle stappen moeten onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast worden uitgevoerd. Alle iPSC-lijnen, evenals onderhouds- en differentiatiemedia, worden beschreven in de materiaaltabel. De hieronder geïllustreerde microgliadifferentiatiemethode is gebaseerd op eerder gepubliceerde protocollen 7,8,12 met nieuwe wijzigingen die hierin worden beschreven.

1. Microglia differentiatie

OPMERKING: Een overzicht van het protocol is samengevat in figuur 1.

  1. Geïnduceerde pluripotente stamcelcultuur (iPSC)
    OPMERKING: Verdere details over iPSC-kweektechnieken zijn elders te vinden17.
    1. Ontdooien en onderhoud
      1. Bereid iPSC-medium, aliquot het medium en bewaar het bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. Ontdooi de aliquots een nacht bij 4 °C en gebruik ze maximaal 1 week. Laat de media voor gebruik ten minste 1 uur op kamertemperatuur staan.
      2. Bestrijk de putjes van een 6-wellsplaat door 1 ml 10 μg/ml laminine 521 toe te voegen, verdund in DPBS met calcium en magnesium18. Bewaar de platen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende ten minste 2 uur of bij voorkeur een nacht. Bewaar het laminine na verdunning gedurende 3 maanden bij 4 °C.
      3. Bereid 10 mM Rho kinaseremmer Y27632 (ROCK Inhibitor) stockoplossing door verdunning in steriel water. Maak aliquots voor eenmalig gebruik van ROCK-remmeroplossing en bewaar ze maximaal 1 jaar bij -20 °C.
      4. Bereid 0,5 mM EDTA door de stamoplossing van 0,5 M EDTA in DPBS te verdunnen.
      5. Om een injectieflacon met bevroren iPSC's te ontdooien, plaatst u de injectieflacon in een waterbad bij 37 °C totdat deze grotendeels is ontdooid. Breng de inhoud van de injectieflacon onmiddellijk over in een conische buis van 15 ml met 4 ml iPSC-medium. Centrifugeer bij 500 × g gedurende 1 min.
      6. Aspirateer het supernatant en resuspensieer de cellen door 1 ml iPSC-medium met 10 μM ROCK-remmer langzaam tegen de wand van de buis toe te voegen om verstoring van de kolonies te voorkomen.
      7. Voeg 1,5 ml iPSC-medium met 10 μM ROCK-remmer toe aan elk van de gecoate putten en breng de geresuspendeerde kolonies druppelsgewijs over naar de putten die het medium bevatten.
        OPMERKING: Gebruik 5-7 druppels uit stap 1.1.1.6 voor kweekonderhoud, maar pas de optimale zaaidichtheid voor elke iPSC-lijn aan.
      8. Verdeel de cellen gelijkmatig in de putjes door de plaat handmatig van links naar rechts en van achter naar voren te schuiven. Plaats de cellen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Vervang de volgende dag het medium volledig door vers iPSC-medium zonder ROCK-remmer toe te voegen.
      9. Voor onderhoud, verander het medium elke dag totdat de cellen 80% samenvloeiing bereiken.
        OPMERKING: De cellen kunnen gedurende 2 dagen worden onderhouden zonder het medium te veranderen als het gebruikte iPSC-medium een flexibel voedingsschema mogelijk maakt. Het wordt geadviseerd om dit te beperken tot één keer per passage en alleen als de cellen minder dan 50% confluent zijn.
    2. Splitsen
      1. Aspirateer het medium en was de cellen met 1 ml DPBS (zonder calcium en magnesium).
      2. Om de cellen los te maken, voegt u 1 ml 0,5 mM EDTA toe en incubeert u gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur totdat de randen van de celkolonies van het oppervlak van de put opstijgen. Was de cellen opnieuw met DPBS en voeg 1 ml iPSC-medium toe.
      3. Dissocieer de celkolonies door ze voorzichtig te schrapen met behulp van een cellifter. Schraap elk deel van de put slechts één keer om te voorkomen dat de kolonies worden verstoord.
        OPMERKING: Alternatieve methoden om de kolonies uit de put te verdrijven zijn elders te vinden17.
      4. Verzamel de cellen met behulp van een pipetpunt van 1 ml en breng ze druppelsgewijs over in een verhouding van 1:6 (cellen tot medium) in voorgecoate putten (zoals vermeld in stap 1.1.1.2) met 1,5 ml iPSC-medium.
  2. iPSC-differentiatie naar microglia-achtige cellen (iMG's)
    OPMERKING: De kleine moleculen en groeifactoren worden opgelost in steriel gefilterd 0,1% runderserumalbumine in DPBS tot een voorraadconcentratie die 1.000x hoger is dan de uiteindelijke concentratie. Het wordt aanbevolen om iPSC's te onderscheiden in iMG's tijdens vroege passages. Routinematige karyotypering van iPSC-lijnen wordt geadviseerd.
    1. Standaardcoatingoplossing voorbereiden
      1. Ontdooi de stamoplossing van een extracellulair matrixcoatingreagens op ijs bij 4 °C 's nachts.
      2. Prechill microcentrifugebuizen en filterpipetpunten bij 4 °C.
      3. Aliquot 250 μL van het geconcentreerde extracellulaire matrix coatingreagens in elke buis en onmiddellijk op ijs plaatsen. Bewaar de aliquots bij -20 °C.
      4. Om de coatingoplossing te bereiden, ontdooit u een van de extracellulaire matrix coatingreagens op ijs bij 4 °C 's nachts.
      5. Voeg 50 ml ijskoude DMEM-F12 geoptimaliseerd voor de groei van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen (aangeduid als DMEM-F12) media toe aan een vooraf gechilleerde conische buis en houd deze op ijs.
      6. Koel een pipetpunt van 1 ml door ijskoude DMEM-F12 meerdere keren op en neer te pipetteren en gebruik vervolgens onmiddellijk de pipetpunt om 250 μL van het extracellulaire matrixcoatingreagens over te brengen in de conische buis die het DMEM-F12-medium bevat.
        OPMERKING: De standaard coatingoplossing kan 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
    2. Embryoïde lichaam (EB) vorming
      1. Bereid EB-medium voor dat maximaal 4 dagen op 4 °C kan worden gehouden.
      2. Zodra iPSC's 80% confluency hebben bereikt, dissocieert u de kolonies door te wassen met 1 ml DPBS en 1 ml dissociatiereagens toe te voegen gedurende 2 minuten bij 37 °C. Maak de kolonies los met behulp van een cellifter door meerdere keren te schrapen om een eencellige suspensie te creëren. Verzamel de cellen en breng alles over naar een conische buis van 15 ml met 9 ml DPBS.
      3. Centrifugeer de cellen op 500 × g gedurende 1 minuut, verwijder het supernatant en resuspenseer de cellen in 1 ml EB-medium. Neem 10 μL cellen en verdun 1:1 met Trypan blue. Tel de cellen met een hemacytometer en verdun op basis van het celgetal de celvoorraad tot een uiteindelijke verdunning van 10.000 cellen per 100 μL. Voeg voor platingcellen 100 μL van de verdunde cellen per put toe aan een laag hechtende, ronde bodem, 96-well plaat.
        OPMERKING: Over het algemeen kunnen 48 putten van de 96-well plaat worden verkregen uit elke 80% confluent put van iPSC's.
      4. Centrifugeer de plaat bij 125 × g gedurende 3 minuten en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 4 dagen. Voer op dag 2 een halve mediumverandering uit door een meerkanaals pipet te gebruiken en voorzichtig 50 μL oud medium te verzamelen en vervolgens 50 μL vers EB-medium toe te voegen.
        OPMERKING: Op dag 4 zullen iPSC's bolvormige cellulaire structuren vormen die EB's worden genoemd, zoals beschreven in de sectie resultaten. Het EB-differentiatieproces kan indien nodig worden verlengd tot 7 dagen.
    3. Generatie van primitieve macrofaagprecursoren (PMP's)
      1. Bereid PMP-basismedium, steriel filter, en bewaar het bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
      2. Bestrijk de putten van een 6-wellsplaat door 1 ml ijskoude Matrigel-coatingoplossing toe te voegen en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende ten minste 2 uur of bij voorkeur een nacht.
      3. Breng op dag 4 van EB-differentiatie de EB's over naar de met Matrigel gecoate putten door de EB's te verzamelen met 1 ml pipetpunten (met behulp van een pipet). Pipetteer een of twee keer op en neer om de EB's uit de put te verwijderen. Houd de 6-well plaat in een gekantelde hoek zodat de EB's zich aan de rand van de put kunnen nestelen.
        LET OP: Negen of tien EV's kunnen per goed gecoate partij worden verguld.
      4. Zodra alle EB's zijn neergedaald, pipetteer en verwijder je voorzichtig het oude medium met behulp van een pipetpunt van 1 ml terwijl je de EB's aan de rand van de put houdt. Voeg 3 ml vers bereide PMP compleet medium toe aan elk putje. Verdeel de cellen gelijkmatig in de putjes door de plaat handmatig van links naar rechts en van achter naar voren te schuiven. Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C en 5% CO2.
      5. Verstoor de plaat gedurende 7 dagen niet zodat de EB's zich aan de bodem van de put kunnen hechten. Voer na die tijd een halve medium verandering uit met behulp van PMP complete medium.
        OPMERKING: Op dit punt moeten de meeste EV's aan de plaat worden bevestigd. Eventuele zwevende EV's kunnen worden verwijderd.
      6. Inspecteer na 5-7 dagen de EB's onder een lichtveldmicroscoop bij 4x vergroting om ervoor te zorgen dat ze aan de onderkant van de putten zijn bevestigd. Wijzig het medium zoals beschreven in 1.2.3.5. Voer op dag 21 een volledige mediumverandering uit met 3 ml PMP compleet medium.
        OPMERKING: Myeloïde voorlopers die in het medium zweven, kunnen op dit punt duidelijk zijn. Deze cellen moeten worden weggegooid tijdens de mediumverandering.
      7. Zoek op dag 28 naar ronde cellen die PMP's in het supernatant worden genoemd en verzamel het medium dat de PMP's bevat met behulp van een pipet van 10 ml en een automatische pipettor. Zorg ervoor dat u de EB's niet verstoort. Breng de PMP's en het medium over in een conische buis van 15 ml en ga verder zoals beschreven in stap 1.2.4.
        OPMERKING: Meestal kunnen PMP's van dezelfde iPSC-lijn worden verzameld uit vijf putten van een 6-well plaat en samengevoegd in een enkele 15 ml conische buis.
      8. Voeg 3 ml vers PMP compleet medium toe voor verder onderhoud van de EB's. Aangezien PMP's gedurende meer dan 3 maanden continu uit DEEB's tevoorschijn komen, verzamelt u ze om de 4-7 dagen (laat het medium niet van kleur veranderen in een gele tint) zoals beschreven in stap 1.2.3.7 en 1.2.3.8.
        OPMERKING: Hoewel PMP's enkele maanden kunnen worden verzameld, kunnen ze hun fenotype in de loop van de tijd veranderen.
    4. Differentiatie naar iMGs
      1. Bereid het iMG-basismedium (materiaaltabel), steriel filter en bewaar het maximaal 3 weken bij 4 °C.
      2. Zodra de PMP's zijn verzameld in een conische buis van 15 ml, centrifugeert u ze gedurende 4 minuten bij 200 × g . Aspirateer het supernatant en resuspendeer de PMP's met behulp van 1-2 ml iMG basaal medium. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer door een kleine aliquot te nemen en 1:1 te verdunnen met Trypan blue.
        OPMERKING: 0,5-1,5 × 106 PMP's worden normaal gesproken elke week verkregen, afhankelijk van de iPSC-lijn en de leeftijd van de EB-cultuur.
      3. Centrifugeer de rest van de cellen opnieuw op 200 × g gedurende 4 minuten. Verdun de PMP's tot de gewenste concentratie, zodat cellen worden geplateerd met een dichtheid van ~ 105/cm2 op met celkweek behandelde platen met behulp van vers bereid iMG compleet medium. Voer elke 3-4 dagen gedurende 10-12 dagen een half-mediumverandering uit met behulp van vers bereide iMG complete medium om terminaldifferentiatie mogelijk te maken.
        OPMERKING: Op dit punt moeten de cellen microglia-achtige morfologie verwerven. Om de toewijding van PMP's aan het lot van microglia te bevestigen, wordt immunofluorescentieanalyse uitgevoerd om de expressie van microglia-verrijkte markers zoals purinerge receptor P2RY12 en transmembraaneiwit 119 (TMEM119)9 te bevestigen.
      4. Om de gezondheid en levensvatbaarheid van cellen te behouden, voert u alle experimenten uit tussen dag 10 en 12 van iMG-differentiatie.

2. Fagocytosetest met behulp van van motorneuronen afgeleide humane synaptosomen

  1. Transcriptiefactor-gemedieerde differentiatie van iPSC-afgeleide lagere motorneuronen (i3LMN's)
    OPMERKING: Een WTC11-lijn met stabiele inbrenging van de hNIL-induceerbare transcriptiefactorcassette met de transcriptiefactoren neurogenine-2 (NGN2), eilandje-1 (ISL1) en LIM homeobox 3 (LHX3) in de CLYBL-safe harbor-locus werd gebruikt voor het differentiatieproces zoals eerder beschreven17. De iPSC-lijn werd gehandhaafd zoals beschreven in stap 1.1.1, maar met de coatingomstandigheden beschreven in stap 1.2.1. Elk extracellulair matrixcoatingreagens kan worden gebruikt voor het kweken van iPSC's die zullen worden gebruikt voor neuronale differentiatie, aangezien laminine 521 niet vereist is. Alle media worden gedurende ten minste 1 uur voor gebruik in evenwicht gebracht met de omgevingstemperatuur.
    1. Bekleed schotels van 10 cm met 5 ml standaardcoatingoplossing zoals beschreven in stap 1.2.1.
      OPMERKING: Hier werden schalen van 3-4 10 cm per differentiatie gebruikt.
    2. Bereid inductiebasismedium, steriel filter, en bewaar het bij 4 °C gedurende maximaal 3 weken.
    3. Bereid Neuron medium, steriel-filter, en bewaar het bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
    4. Bereid boraatbuffer door 100 mM boorzuur, 25 mM natriumtetraboraat en 75 mM natriumchloride in steriel water te mengen. Stel de pH in op 8,5 en filter deze steriel.
    5. Zodra iPSC's 80% confluency hebben bereikt, wast u de cellen met DPBS en maakt u de kolonies los door 0,5 mM EDTA toe te voegen.
      OPMERKING: Twee putten zijn meestal voldoende voor elke schaal van 10 cm.
    6. Incubeer de cellen gedurende 4-5 minuten bij omgevingstemperatuur. Verwijder de EDTA en voeg 3 ml DMEM/F12 met HEPES toe aan elk putje.
    7. Schraap de cellen met behulp van een cellifter en gebruik een pipet van 10 ml om de cellen van de bodem van de put te verwijderen door 2-3x voorzichtig op en neer te pipetteren.
    8. Verzamel de cellen in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten op 300 × g .
    9. Resuspendeer de cellen in 3 ml iPSC-medium met 10 μM ROCK-remmer en tel ze met behulp van een hemacytometer.
    10. Plaat 1,5 × 106 iPSC's in een voorgecoate schaal van 10 cm met 12 ml iPSC-medium met 10 μM ROCK-remmer.
    11. Verwijder de volgende dag het medium en was de cellen met DPBS. Voeg 12 ml vers bereid compleet inductiemedium toe om de expressie van de transcriptiefactoren te induceren.
    12. Op dag 2, bedek 10 cm gerechten met 5 ml neuroncoatingoplossing bereid met gelijke volumes van 0,1 mg / ml poly-D-lysine en 1 mg / ml poly-L-ornithine verdund in boraatbuffer. Incubeer een nacht bij 37 °C en 5% CO2.
    13. Was op dag 3 de gecoate gerechten 3x met steriel water, zuig het water volledig op en laat de vaat drogen door de borden te kantelen en ze gedeeltelijk onbedekt te laten in een bioveiligheidskast gedurende ten minste 1 uur bij omgevingstemperatuur.
    14. Zodra de gerechten volledig zijn gedroogd, bedekt u ze met 6 ml compleet inductiemedium aangevuld met 15 μg / ml laminaat en 40 μM BrdU gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C en 5% CO2.
      OPMERKING: BrdU-behandeling wordt aanbevolen om mitotisch actieve cellen te elimineren en zo de zuiverheid van de neuronale culturen te verbeteren. De effecten van BrdU op de neuronale gezondheid zijn minimaal.
    15. Behandel de differentiërende cellen met 3 ml dissociatiereagens per schaal van 10 cm en incubeer gedurende 3-4 minuten bij omgevingstemperatuur.
    16. Voeg 6 ml DPBS toe aan de plaat zonder het dissociatiereagens te verwijderen en pipetteer de cellen in oplossing 4-5x met een pipet van 10 ml om de cellen te dissociëren.
    17. Verzamel de celsuspensie en laat deze door een celzeef van 40 μm in een conische buis van 50 ml lopen. Voeg 1 ml inductiebasismedium toe om de zeef te spoelen.
    18. Centrifugeer de cellen op 300 × g gedurende 5 min. Aspirateer het medium en resuspendeer de cellen in 3 ml complete inductiemedium met 40 μM BrdU.
    19. Tel de cellen met een hemocytometer. Plaats ongeveer 2,5 × 106 cellen per schaal van 10 cm in voorgecoate schotels door de cellen te verdunnen in 6 ml volledig inductiemedium met 40 μM BrdU zonder de in stap 2.1.14 toegevoegde coatingoplossing te verwijderen.
    20. Op dag 4 aspirateer je het medium, was je de cellen 1x met DPBS en voeg je een vers Complete Inductiemedium toe dat 40 μM BrdU bevat.
    21. Op dag 6 aspirateer het medium, was de cellen 1x met DPBS en voeg Neuron medium aangevuld met 1 μg/ml laminine toe.
    22. Verander op dag 9 1/3rd van het medium door het te vervangen door vers Neuron-medium aangevuld met 1 μg / ml laminine.
    23. Handhaaf i3LMN's gedurende nog eens 25 dagen door halve medium veranderingen uit te voeren met Neuron medium aangevuld met verse 1 μg / ml laminine om de 3-4 dagen.
      OPMERKING: Op dit tijdstip moeten i3 LMN'seen neuronale morfologie presenteren met lange processen. Neuronen hebben ook de neiging om klonten of clusters van cellen te vormen. Een meer gedetailleerde beschrijving van hoe de differentiatie van i3 LMN'skan worden gevalideerd, is elders te vinden17.
  2. Synasptosoomzuivering en etikettering
    OPMERKING: Handhaaf steriele omstandigheden en voer alle stappen uit in een bioveiligheidskast.
    1. Was i3 LMN's twee keer met DPBS.
    2. Voeg 2 ml ijskoude cellysereagens toe voor isolatie van synaptokosomen, incubeer gedurende 2 minuten op ijs en schraap de neuronen stevig.
    3. Breng het lysaat over in meerdere microbuizen van 2 ml (~ 1,5 ml lysaat per buis) en centrifugeer op 1.200 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: Houd de buizen gedurende deze procedure op ijs.
    4. Verzamel het supernatant (gooi de pellet weg) en centrifugeer bij 15.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Bewaar en resuspendeer de pellet die de synaptokosomen bevat met een vergelijkbaar volume (als het oorspronkelijke lysaat) van 5% DMSO in DPBS.
      OPMERKING: De synaposomen kunnen onmiddellijk worden geëtiketteerd met een fluorofoor of worden bewaard bij -80 °C voor toekomstig gebruik.
    5. Voer een Bicinchoninic acid (BCA) eiwittest uit voor alle buizen om de totale opbrengst van eiwit in het synasptosoompreparaat te beoordelen.
      OPMERKING: Andere testen om de eiwitconcentratie te meten kunnen worden gebruikt. De totale eiwitopbrengst verkregen uit verschillende preparaten is als referentie opgenomen in tabel 1 . Het wordt aanbevolen om western blot-analyse van het synasptosoompreparaat uit te voeren om de aanwezigheid van presynaptische en postsynaptische eiwitten te bevestigen. Hier werden de presynaptische marker, synaptophysine (SYP), en de postsynaptische marker, postsynaptische dichtheidseiwit 95 (PSD95) gekozen voor western blotting-analyse zoals eerder beschreven19.
    6. Bereid een oplossing van 100 mM natriumbicarbonaat in water, stel de pH in op 8,5 en steriel filter.
    7. Verzacht 1 mg gelyofiliseerd poeder van de gebruikte pH-gevoelige kleurstof tot 150 μL DMSO. Maak aliquots voor eenmalig gebruik en bewaar ze bij -80 °C.
    8. Centrifugeer de synaptokosomen bij 15.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    9. Verdun tot 1 mg synaptosomen in 100 μL natriumbicarbonaatoplossing van 100 mM.
    10. Om de synaptosomen te labelen, voegt u 1 μL van de gereconstitueerde pH-gevoelige kleurstof per 1 mg synaptosomen toe en bedekt u de reactie met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Schud op kamertemperatuur gedurende 2 uur met behulp van een tube shaker.
    11. Voeg 1 ml DPBS toe aan de buis en centrifugeer de gelabelde synaptokosomen bij 15.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    12. Verwijder het supernatant en voer vier extra wasbeurten uit zoals beschreven in stap 2.2.11.
    13. Verwijder na de laatste wasbeurt en spin het supernatant zoveel mogelijk zonder de pellet te verstoren en resuspenseer de gelabelde synaposomen met 5% DMSO in DPBS op een volume voor de gewenste concentratie (0,7 μg/μL die hier wordt gebruikt). Bereid aliquots voor eenmalig gebruik en bewaar bij -80 °C. Zorg ervoor dat u blootstelling aan licht aan de gelabelde synaptokosomen vermijdt.
  3. Levendcellige fagocytosetest
    1. Plaat 20-30 × 104 PMP's in 96-well platen in 100 μL iMG compleet medium en volg het differentiatieproces gedurende 10 dagen zoals aangegeven in stap 1.2.4.
    2. Bereid op de dag van de test de nucleaire kleuringsoplossing door 1 druppel van een kernvlek voor levende cellen toe te voegen aan 2 ml iMG basaal medium.
    3. Verwijder 40 μL medium per putje van de 96-wellsplaat en voeg 10 μL van de nucleaire kleuringsoplossing toe met behulp van een meerkanaals pipet. Incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 2 uur.
    4. Ontdooi de gelabelde synaposomen op ijs en soniceer voorzichtig met behulp van een water sonicator gedurende 1 minuut. Breng de synapptosomen onmiddellijk terug naar ijs. Verdun de gelabelde synaptosomen in iMG complete medium in een verhouding van 1 μL synaptosomen per 50 μL medium.
      OPMERKING: De concentratie van synaptosoom is assay-afhankelijk en kan optimalisatie vereisen. Om een relatief laag percentage (d.w.z. 0,1% of minder) DMSO in het medium te behouden, wordt geadviseerd om niet meer dan 2 μL synaptosomen per put toe te voegen.
    5. Als negatieve controle, voorbehandeling van sommige van de putten met cytochalasine D om actinepolymerisatie en dus fagocytose te remmen. Bereid een oplossing van 60 μM cytochalasine D in iMG compleet medium. Voeg 10 μL van deze oplossing toe aan elk putje voor een eindconcentratie van 10 μM en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 30 minuten.
    6. Haal de plaat uit de incubator en incubeer bij 10 °C gedurende 10 min. Houd de plaat op ijs en voeg 50 μL medium toe dat synaptosomen bevat, bereid zoals beschreven in stap 2.3.4.
    7. Centrifugeer de plaat op 270 × g gedurende 3 minuten bij 10 °C en houd de plaat op ijs totdat de beeldvorming is verkregen.
  4. Imaging acquisitie en analyse
    1. Plaats de plaat in een live-cell imaging reader en selecteer de putjes die geanalyseerd moeten worden.
    2. Selecteer een lens met een 20x objectief.
    3. Pas de focus, led-intensiteit (light-emitting diode), integratietijd en versterking van de heldere veld - en blauwe (4',6-diamidino-2-fenylindool [DAPI]) kanalen aan. De fluorescentie van het synptoptosoom moet op het beginpunt verwaarloosbaar zijn. Als u zich wilt concentreren op het rode (RFP)-kanaal, gebruikt u het brightfield-kanaal als referentie. De integratietijd en -winst kunnen variëren tussen experimenten; gebruik deze initiële instellingen voor het rode kanaal: LED: 4, integratietijd: 250 en gain: 5.
    4. Selecteer het aantal afzonderlijke tegels dat in een montage per put moet worden verkregen (verkrijg 16 tegels in het midden van de put, waardoor ongeveer 5% van het totale putoppervlak wordt afgebeeld). Stel de temperatuur in op 37 °C en het gewenste tijdsinterval voor beeldvorming.
      OPMERKING: Afbeeldingen werden elke 1 - 2 uur gedurende maximaal 16 uur in dit onderzoek verkregen.
    5. Open de analysesoftware.
      1. Open het experiment dat de afbeeldingen bevat. Klik op het pictogram Gegevensreductie.
      2. Kies in het menu Imaging Stitching onder Imaging Processing om een volledige afbeelding te maken van de 4 x 4 afzonderlijke tegels in de montage met de parameters die worden beschreven in tabel 2.
      3. Zodra de gestikte afbeeldingen zijn gemaakt, definieert u een intensiteitsdrempel met behulp van de DAPI- en RFP-kanalen voor deze afbeeldingen. Open een afbeelding en klik op Analyseren; selecteer onder Analyse de optie Cellulaire analyse en kies onder Detectiekanaal een gestikte afbeelding in de DAPI- of RFP-kanalen. Ga naar het tabblad Primair masker en aantal en stel een drempelwaarde en objectgroottewaarden vast waarmee de celkernen in het DAPI-kanaal of het synasptosoomsignaal in het RFP-kanaal correct worden geselecteerd. Herhaal het proces met verschillende afbeeldingen totdat parameters die op het hele experiment kunnen worden toegepast, zijn geoptimaliseerd.
        OPMERKING: Voorgestelde waarden zijn te vinden in tabel 2.
      4. Als u het aantal kernen wilt tellen, gaat u naar het menu Gegevensreductie en selecteert u onder Beeldanalyse de optie Cellulaire analyse. Ga naar het tabblad Primair masker en aantal en selecteer onder Kanaal de DAPI-gestikte afbeeldingen en gebruik de parameters die worden beschreven in tabel 2.
      5. Ga naar het tabblad Berekende statistieken en selecteer Celaantal. Als u het gebied van het synasptosoomsignaal wilt verkrijgen, gaat u naar het menu Gegevensreductie en selecteert u onder Analyse de optie Cellulaire analyse.
      6. Ga naar het tabblad Primair masker en aantal en selecteer onder Kanaal de optie RFP-gestikte afbeeldingen en gebruik de parameters die in tabel 2 worden beschreven.
      7. Ga naar het tabblad Berekende statistieken en selecteer Objectsomgebied. Klik op het tabblad Gegevensreductie op OK en laat de software alle verkregen afbeeldingen analyseren.
      8. Exporteer de waarden objectsomgebied en celtelling voor elk tijdstip. Deel het objectsomgebied door het aantal cellen om het genormaliseerde gebied per tijdstip te berekenen. Als u meerdere behandelingen of genotypen vergelijkt, berekent u de fagocytose-index met behulp van vergelijking (1):
        figure-protocol-1 (1)
      9. Sla de resultaten op en integreer de gegevens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om iMG's te genereren met behulp van dit protocol, is het belangrijk om te beginnen met ongedifferentieerde iPSC's die compacte koloniemorfologie vertonen met goed gedefinieerde randen (figuur 2A). Gedissocieerde iPSC's die worden onderhouden zoals beschreven in de EB-formatiesectie zullen bolvormige aggregaten vormen, EB's genaamd, die in omvang zullen toenemen tot dag 4 van differentiatie (figuur 2B). Zodra de EB's zijn verzameld en verguld in de juiste omstan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven differentiatieprotocol biedt een efficiënte methode om iPSC-afgeleide microglia-achtige cellen te verkrijgen in ~ 6-8 weken met een hoge zuiverheid en in een voldoende opbrengst om immunofluorescentie-experimenten en andere testen uit te voeren die een groter aantal cellen vereisen. Dit protocol heeft in 1 week tot 1 × 106 iMG's opgeleverd, wat eiwit- en RNA-extractie en bijbehorende downstream-analyses mogelijk maakt (bijv. RNASeq, qRT-PCR, western blot, massaspectrometrie). Dat gezegd heb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Michael Ward voor het leveren van de WTC11 hNIL iPSC-lijn voor motorneurondifferentiatie en de Jackson Laboratories voor het leveren van de KOLF2.1J WT-kloon B03 iPSC-lijn die wordt gebruikt voor microgliadifferentiatie. We bedanken ook Dorothy Schafer voor haar steun tijdens de implementatie van de protocollen, Anthony Giampetruzzi en John Landers voor hun hulp bij het live-cell imaging systeem, evenals Hayden Gadd voor zijn technische bijdragen tijdens revisies en Jonathan Jung voor zijn medewerking aan deze studie. Dit werk werd ondersteund door het Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience van UMASS Chan Medical School en het Angel Fund, Inc.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antilichamen voor immunofluorescentieanalyse
anti-IBA1 konijn antilichaamWako Chemical USANC92883641:350 verdunning
anti-P2RY12 konijn antilichaamSigma-AldrichHPA0145181:50 verdunning
anti-TMEM119 konijn antilichaamSigma-AldrichHPA0518701:100 verdunning
Antilichamen voor Western blot-analyse
anti-β-Tubulin konijn antilichaamAbcamab60461:500 verdunning
anti-Synaptophysine (SYP) konijn antilichaamAbclonalA63441:1.000 verdunning
anti-PSD95 muis antilichaamMilliporeMAB15961:500 verdunning
Borate buffer componenten
Boorzuur (100 mM)SigmaB6768
Natriumbicarbonaat (NaHCO3) BioXtraSigma-AldrichS6297-250G
Natriumchloride (75 mM)Sigma S7653
Natriumtetraboraat (25 mM)Sigma221732
Celcultuurmaterialen
6-wells platenGreiner Bio-One657160
40 μm Cell Strainers Falcon352340
100 mm x 20 mm Tissue Culture TreatedCELLTREAT229620
Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, SterielCELLTREAT229305
laag hechtingsronde bodem 96-well plateCorning7007
Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture PlateCorning353847,
Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture PlateCorning353846
Primaria 96-well Clear Flat Bottom MicroplateCorning353872
Celdissociatie reagentia
Accutase Corning25058CIdissociatie reagentia gebruikt voor differentiatie van lagere motorneuronen
TrypLE reagentLife Technologies12-605-010dissociatie reagentia gebruikt voor microglia differentiatie
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020
Coating reagentia voor celcultuur
Matrigel GFR Membrane MatrixCorning™354230Wordt vermeld als extracellulair matrix coating reagens
CellAdhere Laminin-521STEMCELL Technology77004Wordt vermeld als laminine 521
Poly-D-LysineSigmaP7405Reconstitueer tot 0,1 mg/mL in boraatbuffer
Poly-L-OrnithineSigma P3655Reconstitueer tot 1 mg/mL in boraatbuffer
Componenten van iPSC media
 mTeSR Plus KitSTEMCELL Technology100-0276Om iPSC media te bereiden, worden de componenten gemengd tot 1x
Componenten van EB media
BMP-4Fisher ScientificPHC9534eindconcentratie 50 ng/mL
iPSC mediaeindconcentratie 1x
ROCK-remmer Y27632Fisher ScientificBD 562822eindconcentratie 10 µM
SCFPeproTech300-07eindconcentratie 20 ng/mL
VEGFPeproTech100-20Aeindconcentratie 50 ng/mL
Componenten van PMP basismedia
GlutaMAXGibco35050061eindconcentratie 1x
Penicilline-streptomycine (10.000 U/mL)Gibco15140122eindconcentratie 100 U/mL
X-VIVO 15Lonza12001-988eindconcentratie 1x
Componenten van PMP compleet media
55 mM 2-mercaptoethanolGibco21985023eindconcentratie 55 µM
IL-3PeproTech200-03eindconcentratie 25 ng/mL
M-CSFPeproTech300-25eindconcentratie 100 ng/mL
PMP basismediaeindconcentratie 1x
Componenten van iMG basismedia
Advanced DMEM/F12Gibco12634010eindconcentratie 1x
GlutaMAXGibco35050061eindconcentratie 1x
N2-supplement, 100xGibco17502-048eindconcentratie 1x
Penicilline-streptomycine (10.000 U/mL)Gibco15140122eindconcentratie 100 U/mL
Componenten van iMG compleet media
55 mM 2-mercaptoethanolGibco21985023eindconcentratie 55 µM
IL-34PeproTech of Biologend200-34 of 577904eindconcentratie 100 ng/mL
iMG basismediaein

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254(2021).
  2. Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065(2021).
  3. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  4. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  5. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  6. Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  7. Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
  8. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  9. McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
  10. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  11. Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
  12. Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098(2013).
  13. Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486(2015).
  14. Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144(2018).
  15. Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545(2015).
  16. Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138(2014).
  17. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51(2018).
  18. Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808(2020).
  19. Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
  20. Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
  21. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microglia differentiatiesynaptosoom assayimmunofluorescentiekleuringWestern blotneurodegeneratieve ziekten

Gerelateerde artikelen