Dit protocol beschrijft het differentiatieproces van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) in microglia-achtige cellen voor in vitro experimenten. We nemen ook een gedetailleerde procedure op voor het genereren van menselijke synaptosomen uit iPSC-afgeleide lagere motorneuronen die kunnen worden gebruikt als substraat voor in vitro fagocytosetests met behulp van live-cell imaging-systemen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Humane microglia-achtige cellen: differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen en in vitro live-cel fagocytosetest met behulp van humane synaptosomen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Microglia zijn de residente immuuncellen van myeloïde oorsprong die homeostase in de micro-omgeving van de hersenen handhaven en een belangrijke speler zijn geworden bij meerdere neurologische ziekten. Het bestuderen van menselijke microglia in gezondheid en ziekte vormt een uitdaging vanwege het extreem beperkte aanbod van menselijke cellen. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) afgeleid van menselijke individuen kunnen worden gebruikt om deze barrière te omzeilen. Hier wordt gedemonstreerd hoe menselijke iPSC's kunnen worden gedifferentieerd in microglia-achtige cellen (iMG's) voor in vitro experimenten. Deze iMG's vertonen de verwachte en fysiologische eigenschappen van microglia, waaronder microglia-achtige morfologie, expressie van de juiste markers en actieve fagocytose. Daarnaast wordt documentatie verstrekt voor het isoleren en labelen van synaptosoomsubstraten afgeleid van menselijke iPSC-afgeleide lagere motorneuronen (i3LMN's). Een live-cell, longitudinale beeldvormingstest wordt gebruikt om de overspoeling van menselijke synaptosomen gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof te monitoren, waardoor onderzoek naar de fagocytische capaciteit van iMG mogelijk is. De hierin beschreven protocollen zijn breed toepasbaar op verschillende gebieden die de menselijke microgliabiologie en de bijdrage van microglia aan ziekten onderzoeken.
Inleiding
Microglia zijn de residente immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CZS) en spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling van het CZS. Microglia zijn ook belangrijk in de volwassen hersenen voor het handhaven van homeostase en het actief reageren op trauma- en ziekteprocessen. Cumulatief bewijs toont aan dat microglia een belangrijke bijdrage leveren aan de pathogenese van meerdere neurologische en neurodegeneratieve ziekten 1,2. Hoewel de huidige kennis over microgliale biologie voornamelijk is afgeleid van muismodellen, hebben recente studies belangrijke verschillen tussen muizen- en menselijke microglia op....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Alle reagentia die in dit protocol worden gebruikt, moeten steriel zijn en alle stappen moeten onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast worden uitgevoerd. Alle iPSC-lijnen, evenals onderhouds- en differentiatiemedia, worden beschreven in de materiaaltabel. De hieronder geïllustreerde microgliadifferentiatiemethode is gebaseerd op eerder gepubliceerde protocollen 7,8,12 met nieuwe wijzigingen die hierin worden beschreven.
1. Microglia differentiatie
OPMERKING: Een ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om iMG's te genereren met behulp van dit protocol, is het belangrijk om te beginnen met ongedifferentieerde iPSC's die compacte koloniemorfologie vertonen met goed gedefinieerde randen (figuur 2A). Gedissocieerde iPSC's die worden onderhouden zoals beschreven in de EB-formatiesectie zullen bolvormige aggregaten vormen, EB's genaamd, die in omvang zullen toenemen tot dag 4 van differentiatie (figuur 2B). Zodra de EB's zijn verzameld en verguld in de juiste omstan.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hier beschreven differentiatieprotocol biedt een efficiënte methode om iPSC-afgeleide microglia-achtige cellen te verkrijgen in ~ 6-8 weken met een hoge zuiverheid en in een voldoende opbrengst om immunofluorescentie-experimenten en andere testen uit te voeren die een groter aantal cellen vereisen. Dit protocol heeft in 1 week tot 1 × 106 iMG's opgeleverd, wat eiwit- en RNA-extractie en bijbehorende downstream-analyses mogelijk maakt (bijv. RNASeq, qRT-PCR, western blot, massaspectrometrie). Dat gezegd heb.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Michael Ward voor het leveren van de WTC11 hNIL iPSC-lijn voor motorneurondifferentiatie en de Jackson Laboratories voor het leveren van de KOLF2.1J WT-kloon B03 iPSC-lijn die wordt gebruikt voor microgliadifferentiatie. We bedanken ook Dorothy Schafer voor haar steun tijdens de implementatie van de protocollen, Anthony Giampetruzzi en John Landers voor hun hulp bij het live-cell imaging systeem, evenals Hayden Gadd voor zijn technische bijdragen tijdens revisies en Jonathan Jung voor zijn medewerking aan deze studie. Dit werk werd ondersteund door het Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience van UMASS Chan Medical School en het Angel Fund, Inc.<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Antilichamen voor immunofluorescentieanalyse | |||
| anti-IBA1 konijn antilichaam | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 verdunning |
| anti-P2RY12 konijn antilichaam | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 verdunning |
| anti-TMEM119 konijn antilichaam | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 verdunning |
| Antilichamen voor Western blot-analyse | |||
| anti-β-Tubulin konijn antilichaam | Abcam | ab6046 | 1:500 verdunning |
| anti-Synaptophysine (SYP) konijn antilichaam | Abclonal | A6344 | 1:1.000 verdunning |
| anti-PSD95 muis antilichaam | Millipore | MAB1596 | 1:500 verdunning |
| Borate buffer componenten | |||
| Boorzuur (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Natriumbicarbonaat (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Natriumchloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Natriumtetraboraat (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Celcultuurmaterialen | |||
| 6-wells platen | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Steriel | CELLTREAT | 229305 | |
| laag hechtingsronde bodem 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Celdissociatie reagentia | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociatie reagentia gebruikt voor differentiatie van lagere motorneuronen |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociatie reagentia gebruikt voor microglia differentiatie |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagentia voor celcultuur | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Wordt vermeld als extracellulair matrix coating reagens |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Wordt vermeld als laminine 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitueer tot 0,1 mg/mL in boraatbuffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitueer tot 1 mg/mL in boraatbuffer |
| Componenten van iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | Om iPSC media te bereiden, worden de componenten gemengd tot 1x |
| Componenten van EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | eindconcentratie 50 ng/mL |
| iPSC media | eindconcentratie 1x | ||
| ROCK-remmer Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | eindconcentratie 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | eindconcentratie 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | eindconcentratie 50 ng/mL |
| Componenten van PMP basismedia | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | eindconcentratie 1x |
| Penicilline-streptomycine (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | eindconcentratie 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | eindconcentratie 1x |
| Componenten van PMP compleet media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | eindconcentratie 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | eindconcentratie 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | eindconcentratie 100 ng/mL |
| PMP basismedia | eindconcentratie 1x | ||
| Componenten van iMG basismedia | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | eindconcentratie 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | eindconcentratie 1x |
| N2-supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | eindconcentratie 1x |
| Penicilline-streptomycine (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | eindconcentratie 100 U/mL |
| Componenten van iMG compleet media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | eindconcentratie 55 µM |
| IL-34 | PeproTech of Biologend | 200-34 of 577904 | eindconcentratie 100 ng/mL |
| iMG basismedia | ein |
Referenties
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254(2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
