Het ontcijferen van het moleculaire mechanisme en de functie van porievormende toxines met behulp van Leishmania major

Summary

Hier wordt een protocol gepresenteerd met behulp van Leishmania major promastigoten om de binding, cytotoxiciteit en signalering geïnduceerd door porievormende toxines te bepalen. Een proof-of-concept met streptolysine O wordt verstrekt. Andere toxines kunnen ook worden gebruikt om de genetische mutanten die beschikbaar zijn in L. major te gebruiken om nieuwe mechanismen van toxineresistentie te definiëren.

Abstract

Het begrijpen van de functie en het mechanisme van poriënvormende toxines (PFT's) is een uitdaging omdat cellen bestand zijn tegen de membraanschade veroorzaakt door PFT's. Hoewel biofysische benaderingen helpen bij het begrijpen van porievorming, vertrouwen ze vaak op reductionistische benaderingen die het volledige complement van membraanlipiden en eiwitten missen. Gekweekte menselijke cellen bieden een alternatief systeem, maar hun complexiteit en redundanties in reparatiemechanismen maken het identificeren van specifieke mechanismen moeilijk. Daarentegen biedt de menselijke protozoaire ziekteverwekker die verantwoordelijk is voor cutane leishmaniasis, Leishmania major, een optimale balans tussen complexiteit en fysiologische relevantie. L. major is genetisch handelbaar en kan in vitro worden gekweekt tot hoge dichtheid, en elke impact van verstoringen op infectie kan worden gemeten in gevestigde muizenmodellen. Bovendien synthetiseert L. major lipiden die verschillen van hun zoogdierachtige tegenhangers, wat de membraandynamiek zou kunnen veranderen. Deze veranderingen in de membraandynamica kunnen worden onderzocht met PFT's uit de best gekarakteriseerde toxinefamilie, cholesterolafhankelijke cytolysinen (CDC's). CDC's binden aan ergosterol in het Leishmania-membraan en kunnen L. major promastigoten doden, wat aangeeft dat L. major een geschikt modelsysteem is voor het bepalen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van de PFT-functie. Dit werk beschrijft methoden voor het testen van de PFT-functie in L. major promastigoten, waaronder parasietcultuur, genetische hulpmiddelen voor het beoordelen van lipidegevoeligheid, membraanbindingstests en celdoodtests. Deze testen zullen het snelle gebruik van L. major mogelijk maken als een krachtig modelsysteem voor het begrijpen van de PFT-functie in een reeks evolutionair diverse organismen en overeenkomsten in lipidenorganisatie.

Introduction

Poriënvormende toxines (PFT's) zijn de grootste familie van bacteriële toxines¹, maar de mechanismen waarmee ze cellen perforeren en vernietigen zijn slecht begrepen. De best bestudeerde familie van porievormende toxines is die van cholesterolafhankelijke cytolysinen (CDC's). CDC's worden voornamelijk gesynthetiseerd door grampositieve bacteriën, waaronder de veroorzaker van necrotiserende fasciitis, Streptococcus pyogenes². S. pyogenes scheidt de CDC streptolysine O (SLO) af, die zich bindt aan sterolen in het plasmamembraan van gastheercellen als monomeren, oligomeriseert en ~ 20-30 nm poriën in het membraan inbrengt¹. De rol die lipiden in dit proces spelen, blijft slecht bepaald.

Een benadering voor het bestuderen van lipide-CDC-interacties is het gebruik van chemisch gedefinieerde liposomen. Hoewel gedefinieerde liposomen informatie verschaffen over de noodzakelijke drempels van lipiden om toxinebinding en porievorming te ondersteunen ^3,4, recapituleren ze cellulaire functies niet volledig. Gereconstitueerde liposomen missen bijvoorbeeld de lipide-asymmetrie van zoogdiergastheren en lipidemodificaties als reactie op toxines⁵. Een alternatief voor liposomen is het gebruik van zoogdiercellijnen. Hoewel deze cellijnen fysiologisch relevanter zijn, is er een grote mate van redundantie in toxinedetectie- en weerstandsmechanismen². Als gevolg hiervan blijven de reparatiepaden die worden gebruikt om CDC's te weerstaan slecht bepaald. Met name Ca²⁺ instroom is de primaire activator van membraanreparatie¹. Stroomafwaarts van Ca²⁺ instroom worden meerdere paden ingeschakeld, waaronder een ceramide-afhankelijke reparatie ^6,7 en een MEK-afhankelijke reparatieroute⁶. Deze routes interageren met andere eiwiteffectoren, waaronder het endosomale sorteercomplex dat nodig is voor transport (ESCRT)⁸, en annexinen ^6,9,10. Het ontleden van deze paden in zoogdiercellen is een uitdaging vanwege de redundantie, die de interpretatie van gegevens vertroebelt.

Een manier om complexiteit in evenwicht te brengen met eenvoud voor het ontleden van reparatieroutes is het gebruik van eenvoudiger organismen, zoals protozoaire pathogenen in het geslacht Leishmania. Leishmania sp. veroorzaken leishmaniasis bij mensen en andere dieren. Leishmaniasis varieert van cutane leishmaniasis (zelfbeperkte huidlaesies) tot de fatale viscerale leishmaniasis (hepatosplenomegalie), afhankelijk van de soort en andere factoren¹¹. Leishmania major, de veroorzaker van cutane leishmaniasis, wordt overgedragen op mensen via een zandvliegvector en wordt gebruikt om de Leishmania-functie en infectie te begrijpen¹². Bovendien zijn Leishmania sp. digene¹². Ze bestaan als intracellulaire macrofaagparasieten van zoogdieren die amastigoten worden genoemd en als vrijzwemmende, flagellated promastigoten in de zandvlieg¹². L. belangrijke promastigoten kunnen worden gekweekt in serum-aangevulde media zoals M199 tot hoge dichtheid¹³. Promastigoten zijn ook genetisch handelbaar; er bestaan veel gen knock-outs, waaronder die gericht op lipide biosynthese pathways¹³. Deze knock-outs kunnen worden geëvalueerd op groei en verschillen in infectiviteit en laesieontwikkeling via infectie van Balb / c-muizen¹³.

Naast het relatieve gemak van de Leishmania-cultuur en het bereik van lipidebiosynthese knock-outs, heeft de parasiet een eenvoudiger genoom dan zoogdieren. De best gekarakteriseerde soort van Leishmania is L. major, die veel bestaande genetische hulpmiddelen heeft, zoals mutanten met een defect lipidenmetabolisme¹⁴. Met name veel reparatie-eiwitten zijn afwezig. L. major heeft tot op heden geen homologen geïdentificeerd voor belangrijke zoogdierhersteleiwitten zoals annexinen. Dit maakt de karakterisering van evolutionair geconserveerde reparatieroutes mogelijk zonder de complexiteit van zoogdiersystemen. Reparatiepaden zijn echter tot op heden niet gekarakteriseerd in Leishmania. Tegelijkertijd worden belangrijke signaleringsroutes die betrokken zijn bij reparatie, zoals de MEK-route⁶, bewaard in Leishmania ^sp.15,16, hoewel homologen moeten worden gevalideerd. De mitogeen-geactiveerde eiwitkinase (MAPK) -route is goed bestudeerd in L. mexicana, waar het bijdraagt aan intracellulaire overleving en thermostabiliteit in zoogdiercellen en metacyclogenese regelt¹⁶. In Leishmania sp. zijn 10 van de 15 MAPK's gekarakteriseerd¹⁷. LmMAPK9 en LmMAPK13 lijken naar verwachting het meest op zoogdier ERK1/2 op basis van identiteit in de geconserveerde fosforyleringslipsequentie. De fosforyleringslipsequentie is TEY voor zowel zoogdier ERK1/2 als LmMAPK9 en LmMAPK13. Acht van de Leishmania MAPKs hebben echter een TDY-fosforyleringsmotief¹⁵. Ten minste twee homologen van MEK zijn geïdentificeerd in Leishmania sp., LmxMKK¹⁸ en MEKK-gerelateerd kinase (MRK1)¹⁹. Dit suggereert dat inzichten geïdentificeerd in Leishmania zich kunnen vertalen naar zoogdiersystemen. Waar ze zich niet vertalen naar zoogdiersystemen, vertegenwoordigen ze therapeutische doelen voor de behandeling van leishmaniasis.

Om L. major promastigoten te gebruiken om membraanherstel en interacties met toxines te bestuderen, zijn technieken met gemiddelde doorvoer nodig. Hoewel live cell imaging met hoge resolutie de visualisatie van gelabelde eiwitten en membranen in realtime mogelijk maakt, is het een lage doorvoer en meet het mogelijk niet de cellulaire overleving. Medium-throughput levensvatbaarheidstests omvatten kleurstofopname gemeten door flowcytometrie, de meting van mitochondriale activiteit of de afgifte van cellulaire eiwitten zoals lactaatdehydrogenase (LDH). In zoogdiercellen meten LDH-assays de celdood niet kwantitatief²⁰. Bovendien maken populatiegebaseerde assays zoals LDH-afgifte of mitochondriale activiteit geen robuuste eencellige of multiparametrische analyse mogelijk²⁰. Flowcytometrie-gebaseerde assays maken daarentegen multiparametrische eencellige analyse^{mogelijk 20}. Deze testen zijn echter niet toegepast op het begrijpen van toxinebiologie of reacties op toxines in L. major promastigoten.

In deze studie wordt SLO gebruikt als een hulpmiddel om de plasmamembraanverstoring van de sfingolipide null-mutant van L. major in twee verschillende buffers te begrijpen - de M199-media die routinematig worden gebruikt om L. major promastigoten en de eenvoudigere Tyrode-buffer te kweken. Een medium-throughput flow cytometrie assay wordt beschreven en gebruikt om toxine dosis-respons curven te genereren. Gegevens van de flowcytometrische test worden gemodelleerd naar een logistieke curve om de LC_50-waarden te bepalen. Met deze informatie kan een sublytische dosis SLO worden bepaald, zodat MAPK-antilichamen kunnen worden gevalideerd met behulp van western blotting.

Protocol

Alle passende richtlijnen en standaard microbiologische, veiligheids- en celkweekpraktijken werden gebruikt voor het gebruik en de behandeling van de RG2-pathogeen Leishmania major en recombinant DNA. Alle experimenten met levende L. major werden uitgevoerd in een bioveiligheidskast in een BSL-2 gecertificeerd laboratorium. Het werk stond onder toezicht van het Texas Tech University Institutional Biosafety Committee.

OPMERKING: Vanuit een veiligheidsperspectief zijn levende L. major promastigoten risicogroep 2 pathogenen. Behandel het gebruik van de juiste inperking, voorzorgsmaatregelen en toezicht van het Institutional Biosafety Committee (IBC). Behandel giftige stoffen en chemicaliën in overeenstemming met institutionele procedures voor giftige stoffen. Als recombinante toxines worden gebruikt, kan IBC-goedkeuring en toezicht nodig zijn voor recombinant DNA-werk.

1. Teelt en bereiding van L. major promastigoten

1. Verkrijgen, of maken en valideren, L. belangrijke genetische mutanten zoals eerder beschreven met behulp van homologe recombinatie of CRISPR-gebaseerde methoden^13,21. Gebruik knock-outs aangevuld met het gen toegevoegd aan een plasmide om de specificiteit van de knock-out te garanderen.
2. Kweek wild type L. major en spt2^- promastigoten bij 27 °C in volledig M199 medium. Kweek de episomale addbackcellen (spt2^-/+SPT2) in volledig M199 plus 10 μg/ml G418 (zie tabel 1 en materiaaltabel).
   OPMERKING: De volledige experimentele opstelling met experimenten met L. major-cellen moet worden uitgevoerd in een BSL2-gecertificeerde bioveiligheidskast.
3. Cultiveer de promastigoten in volledige M199 medium²² totdat ze de logfase bereiken (2-8 x 10⁶ cellen / ml), zoals bepaald door L. belangrijke groeicurvetests die eerder zijn gedaan²³. Plan 1 x 10⁵ cellen voor elke put voor cytotoxiciteit, plus 5 x 10⁵ cellen voor kleuringscontrole. Voor western blot, plan 2 x 10⁷ cellen per put.
   OPMERKING: Voer cytotoxiciteitstest uit met twee technische replicaties.
4. Om de juiste celdichtheid te controleren, mengt u een aliquot (10-40 μL) promastigoten met een gelijk volume fixatief (3,7% paraformaldehyde in 1x PBS). Laad 10 μL van het vaste monster op elke zijde van de hemacytometer.
   LET OP: Formaldehyde is een giftige chemische stof. Behandel in overeenstemming met het institutionele beleid voor gevaarlijke chemische stoffen.
5. Voer celtelling uit met behulp van een microscoop met een vergroting van 20x. Tel alle cellen in de 25 kleine vierkantjes in het midden van de hemacytometer. Herhaal dit voor de vierkanten aan beide zijden en gemiddelde van de tellingen.
   OPMERKING: Als de variatie tussen tellingen >10 is, hertelling en gemiddelde. Als het gemiddelde aantal <10 of >100 is, wijzigt u de verdunning en hertelling en berekent u vervolgens de cultuurdichtheid met behulp van de volgende formule:
   (Eq 1)
   Als er bijvoorbeeld gemiddeld 250 Leishmania in 25 vierkanten zijn, is de cultuurdichtheid 5 x 10⁶ cellen / ml.
6. Breng na het tellen 5 x 10⁶ cellen over naar een conische buis van 15 ml en centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.
7. Gooi het supernatant weg met een pipet van 10 ml en vortex de celpellet kort. Voeg 5 ml 1x PBS toe aan dezelfde buis en was de cellen door 3-6x voorzichtig om te keren. Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.
8. Gooi het supernatant weg met behulp van een pipet van 10 ml en resuspenseer de 5 x 10^6-cel pellet in 5 ml medium (bijv. M199 of 1x Tyrode's buffer) die voor de experimenten wordt gebruikt met een 5 ml pipet om een eindconcentratie van 1 x 10⁶ cellen / ml te geven.

2. Cytotoxiciteitstest

1. Experimentele voorbereiding
   1. Zuiver het toxine zoals eerder beschreven²⁴, of koop het toxine van een leverancier. Aliquot in aliquots voor eenmalig gebruik en bewaar −80 °C gedurende maximaal 1 jaar. Vermijd meerdere vries-dooicycli.
   2. Bepaal de hemolytische activiteit voor elk toxine met behulp van menselijke rode bloedcellen (zie materiaaltabel)²⁴.
      OPMERKING: Hemolytische activiteit wordt gebruikt omdat het controleert op verschillen in activiteit als gevolg van zuivering, mutaties, enz. De soortkeuze van erytrocyten kan de hemolytische activiteit veranderen (intermedilysine vereist bijvoorbeeld menselijke rode bloedcellen).
   3. Plan twee technische replica's voor elke toestand, zeven verdunningen voor de dosis-responscurve en een controle zonder toxine.
      OPMERKING: Met wild-type (WT), spt2^- en spt2-/+SPT2-promastigoten kunnen twee behandelingen worden getest in één V-bottom 96-well-plaat. De gevoeligheid voor media kan bijvoorbeeld worden vergeleken (figuur 1). In plaats van een V-bodemplaat kunnen buizen van 1,2 ml microtiter (zie materiaaltabel) worden gebruikt. Vanwege de acquisitietijden op de cytometer wordt het uitvoeren van meer dan één plaat tegelijk niet aanbevolen.
   4. Bepaal welke testbuffer moet worden gebruikt op basis van de benodigde testomstandigheden en het doel van het experiment.
      OPMERKING: In dit voorbeeld worden twee testbuffers vergeleken: M199 en tyrodebuffer aangevuld met de levensvatbaarheidskleurstof propidiumjodide (PI). Cholesterol in serum zal interfereren met CDC-activiteit²⁴.
   5. Bereken de hoeveelheid toxine die nodig is op basis van de omstandigheden en het aantal behandelde genotypen. Zorg ervoor dat 50% specifieke lyse halverwege de verdunningscurve optreedt.
      OPMERKING: Voor CDC's geeft een tweevoudige seriële verdunning een goed bereik voor latere logistieke modellering. Voor spt2-promastigoten is 4.000 HU/ml SLO de aanbevolen startverdunning. Wanneer inactieve toxines worden gebruikt, mag in plaats daarvan een massa worden gebruikt die overeenkomt met de hoogste dosis.
   6. Plan een eindvolume van 200 μL per put en voeg een klein volume extra (50-100 μL) toe om rekening te houden met pipetfouten.
      OPMERKING: Met drie genotypen, elk in tweevoud gedaan, zullen er zes monsters zijn voor de seriële verdunning.
   7. Bepaal de totale hoeveelheid toxine die nodig is met behulp van de volgende formule:
      (Eq 2)
      waarbij ActivityMax de hoogste gebruikte concentratie is (HU/ml); TotalFinalVolume is het totale volume (voor zes monsters, 200 x 6 + 100 = 1.300 μL); ActivityStock is de activiteit van de toxinevoorraad (HU/ml); en VolStockToxin is het volume van de toxinevoorraad dat nodig is.
   8. Bereid voldoende testbuffer voor die nodig is voor het experiment. Vul het basale medium aan met een levensvatbaarheidskleurstof en eventuele Ca²⁺ of EGTA die nodig is om Ca²⁺ niveaus onder controle te houden. Vortex om te mengen.
      OPMERKING: Voeg bijvoorbeeld voor elke 10 ml Tyrode's buffer 50 μL van 2 mg / ml PI en 200 μL van 100 mM CaCl₂ toe, wat de eindconcentraties van respectievelijk 10 μg / ml en 2 mM oplevert.
   9. Zorg ervoor dat de levensvatbaarheidskleurstof PI niet conflicteert met andere gebruikte sondes, zoals voor fluorescerende bindingstests met Cy5 of AlexaFluor647-geconjugeerde toxines^20,25.
   10. Plan toxineverdunningen om een 2x oplossing van toxine te maken. Voeg de testbuffer toe aan de centrifugebuizen van 1,5 ml en koel op ijs. Voeg het toxine alleen toe onmiddellijk voordat de test wordt gestart.
       OPMERKING: In dit voorbeeld zou 1,3 ml testbuffer worden toegevoegd voor de bovenste verdunning en 650 μL zou worden toegevoegd voor seriële verdunningen om de 2x toxine-oplossing te bereiden.
2. Experiment
   1. Reserveer 0,5 ml verwerkte promastigoten uit stap 1.8 in een aparte buis als "Niet-gekleurde controle".
      OPMERKING: Dit monster wordt gebruikt om gating op de flowcytometer in te stellen.
   2. Voeg 2 mg/ml PI toe aan een eindconcentratie van 10 μg/ml aan de resterende promastigoten. Vortex voor 3 s.
      OPMERKING: Na de toevoeging van PI aan de verwerkte promastigoten kunnen deze cellen alleen worden gebruikt voor een periode van 2,5 uur. Na 2,5 uur beginnen de cellen af te sterven en worden de resultaten onjuist.
   3. Voeg 1 x 10⁵ (in 100 μL/put) verwerkte promastigoten toe aan elke put van een V-bodemplaat met 96 putten of 1,2 ml microtiterbuizen (figuur 1). Plaats de plaat of het buisrek op ijs in een hoek van ongeveer 45° ten opzichte van het zicht. Voer het werk uit in een bioveiligheidskast bij het hanteren van Leishmania promastigoten.
   4. Voeg 100 μL testbuffer met PI toe aan elke no-toxinecontrole (laatste rij). Controleer of het besturingselement correct is toegevoegd door visueel te identificeren welke buizen met een totaal volume van 200 μL donkerder van kleur lijken.
   5. Verwijder de toxine aliquots van −80°C, ontdooi op ijs en pool indien nodig. Voeg het in stap 2.1.5 berekende toxinevolume toe aan de hoogste verdunning (bereid in stap 2.1.10). Verdun vervolgens het toxine serieel (figuur 1). Pipetteer minstens 8x op en neer om mengen te garanderen.
      OPMERKING: Presteren op ijs omdat CDC's snel inactiveren bij kamertemperatuur.
   6. Begin bij de laagste toxineconcentratie en voeg snel 100 μL toxine toe aan de juiste rij (figuur 1 en figuur 2) en ga door totdat al het toxine aan de cellen is toegevoegd.
   7. Sluit de plaat af met afdichtingstape. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min. Na de incubatietijd, verpak en transporteer de plaat naar de flowcytometer.
3. Data-acquisitie
   1. Stel de flowcytometer (zie Materiaaltabel) en acquisitiesoftware in volgens de instructies van de fabrikant en per facilitair beleid. Voer de flowcytometrieprocedure niet uit zonder voorafgaande training op de cytometer.
      OPMERKING: In dit voorbeeld is een 4-laser Attune NxT gebruikt. PI werd verzameld op het YL-1-kanaal (opgewonden door een 561 nm-laser, door een 577 LP, gereflecteerd vanaf 600 DLP en gefilterd door 585/16 bandpass), hoewel het brede spectrum van PI verzameling op andere kanalen mogelijk maakt.
   2. Stel met behulp van het niet-gekleurde L. major promastigote monster de poorten in voor voorwaartse en zijwaartse spreiding en de initiële fluorescerende parameters op basis van de gekozen kleurstoffen.
   3. Voeg indien gewenst een extra parameter toe voor dot plots om autofluorescentie te controleren (bijv. "geen vlek") (figuur 3).
      OPMERKING: In dit voorbeeld werd het BL-1-kanaal (opgewonden door een 488 nm-laser, door 495 DLP en 503 LP gegaan, gereflecteerd van 555 DLP en gefilterd via 530/30 bandpass) gebruikt.
   4. Stel met behulp van enkele gekleurde controles de poorten in voor de levensvatbaarheidskleurstof (PI in deze studie) en eventuele fluorescerend gelabelde toxines. Monitor voorwaartse spreiding versus tijd voor micro-klompen.
      OPMERKING: PI zal alle cellen boven niet-gekleurde besturingselementen vaag kleuren. Dode cellen zullen gemakkelijk te scheiden zijn, met tijdelijk permeabiliseerde cellen tussen populaties.
   5. Verkrijg > 10.000 gated events voor elk monster op de cytometer.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om te lezen van meest gevoelig naar minst gevoelig, maar de volgorde van verwerving kan worden omgekeerd om de impact van de leesvolgorde op de monsterresultaten te bepalen.
   6. Sla de gegevens op en exporteer indien nodig voor analyse.
4. Data-analyse
   OPMERKING: In dit onderzoek is excel met oplosser plug-in (zie Materiaaltabel) werd gebruikt voor gegevensanalyse (zie Aanvullend bestand 1).
   1. Gate totaal, eencellige L. major promastigoten door gating op voorwaartse en zijwaartse spreiding en tijd indien nodig (figuur 3). Gebruik hoogte of gebied zoals aanbevolen voor de flowcytometer.
      OPMERKING: Voor de hier gebruikte flowcytometer is hoogte de aanbevolen parameter in plaats van het gebied.
   2. Identificeer en gate dode cellen als "PI hoog". Gate tussenliggende cellen als "PI laag". PI-hoge cellen zijn dode cellen, terwijl PI-lage cellen tijdelijk permeabiliseerd zijn²⁶.
      OPMERKING: PI-hoge cellen vertonen meestal een 2-3 logverschuiving van negatieve cellen.
   3. Exporteer de gegevens naar Excel. Verkrijg de monsternaam/ID en %PI hoog om het doden te bepalen.
      OPMERKING: Als fluorescerende toxines werden gebruikt, zal de mediane fluorescerende intensiteit (MFI) van levende, tijdelijk permeabiliseerde en negatieve populaties nodig zijn. %PI low mag worden geëxporteerd voor transiënte permeabilisatie.
   4. Bepaal het gemiddelde %PI hoog voor elke voorwaarde tussen de twee technische replicaten.
      OPMERKING: Als gemiddelde MFI nodig is voor fluorescerende toxines, bereken dit dan ook.
   5. Bereken %Specifieke Lysis uit de %PI high met behulp van de volgende formule^24,25:
      (Eq 3)
      waarbij PIhighxpt het %PI-hoog is voor de experimentele toestand; en PIhighctl is de %PI hoog voor de no-toxine controle.
   6. Grafiek %Specifieke Lysis tegen toxineconcentratie voor de dosis-responscurve (figuur 4).
   7. Organiseer de dosis-responscurve in Excel voor logistieke modellering. Inclusief toxineconcentratie en gemiddelde %specifieke lysis, samen met experimentele details en/of ruwe %PI-hoge berekeningen (tabel 2).
   8. Controleer of de invoegtoepassing Oplosser is ingeschakeld.
      OPMERKING: Als u de Oplosser wilt inschakelen in de bureaubladversie van Excel, gaat u naar Opties voor bestand > > invoegtoepassingen en schakelt u het selectievakje Oplosser in. Start Excel opnieuw.
   9. Label nog vier kolommen als "gemodelleerd", "restanten", "parameters" en "parameterwaarden". Controleer of de eerste kolommen overeenkomen met de experimentele parameters, de toxineconcentratie en %Specifieke Lysis (tabel 2).
   10. Voeg de volgende parameters toe in de kolom "parameters": L, k, c, SUM en LC50. Initialiseer de parameters L, k en c door de volgende waarden in de kolom "parameterwaarden" in te voeren: 100, 0,05, 1.000.
   11. Maak in de kolom "gemodelleerd" het logistieke model met behulp van de volgende formule:
       (Eq 4)
       Stel L, k en c in op de cellen met deze parameters in de kolom 'parameterwaarden'.
       Stel x in op de cel die de toxineconcentratie bevat.
       OPMERKING: Voor tabel 2, cel G4, is de formule als volgt: =$J$3/(1+EXP(-$J$4*(D4-$J$5)))
   12. Pas deze vergelijking toe op alle %Specifieke Lysis-waarden, behalve de controle zonder toxine.
   13. Bereken in de kolom "resten" het kwadraat van het verschil tussen het gemodelleerde getal en de werkelijke specifieke lysis met behulp van de volgende vergelijking:
       (Eq. 5)
       waarbij y de experimentele %Specifieke Lysis is; en m is de overeenkomstige waarde in de kolom "gemodelleerd", berekend in de stappen 2.4.10-2.4.11.
   14. In de kolom "parameterwaarden" naast "SOM" somt u alle waarden in de kolom restwaarden op.
   15. Initialiseer in de kolom "parameterwaarden" naast "LC50" de vergelijking om de LC₅₀ te berekenen op basis van de bepaalde waarden. Dit is het oplossen van Eq 4 voor x wanneer m = 50.
       (Eq 6)
       Voor tabel 2 is de Excel-formule als volgt: =J5-(LN(J3/(50)-1))/J4
   16. Open de oplosser op het tabblad Gegevens. Selecteer doelstelling instellen als de cel die de som van de berekende restwaarden bevat. Stel het in op Min.
   17. Wijzig de variabele cellen voor de parameterwaarden L, k en c.
       OPMERKING: De oplosser kan zich beter gedragen als "Maak ongelimiteerde variabelen niet-negatief" is aangevinkt.
   18. Voor negatieve k-waarden wijzigt u Eq 4 en Eq 6 door −1 van k te berekenen om k in positief te veranderen. Gebruik de GRG Nonlinear solving methode. Klik op Oplossen.
   19. Controleer de curve en dat de LC₅₀ automatisch wordt berekend met behulp van Eq 6 (tabel 2). Controleer de pasvorm door zowel %Specifieke lyse als modellering tegen toxineconcentratie grafisch uit te zetten.
       OPMERKING: Het kan ook worden gecontroleerd door de R² voor de curve te berekenen.

3. Eiwitanalyse van toxine-uitgedaagde L. major promastigoten

1. Bereid L. major promastigoten zoals beschreven in rubriek 1.
2. Resuspendeer 2 x 10⁷ WT, spt2^-, en spt2^-/+SPT2 L. belangrijke promastigoten in 2 ml van de gewenste testbuffer met behulp van een pipet van 5 ml (bijv. serumvrij M199). Voeg toxine toe aan een uiteindelijke sublytische concentratie en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten.
   OPMERKING: Een sublytische dosis SLO voor spt2-promastigoten is bijvoorbeeld 500 HU /ml.
3. Neem andere genotypen en controles zonder toxine op.
4. Centrifugeer de promastigoten bij 1.500 x g gedurende 10 minuten om de cellen te pelleteren. Gooi het supernatant weg met een pipet van 10 ml. Laat de gesloten buis met de celpellet drie keer snel over een onregelmatig oppervlak lopen, zoals de grill van de bioveiligheidskast, om de celpellet te breken.
   OPMERKING: De celkorrel is bijna onzichtbaar voor het blote oog.
5. Reconstitueer 1x SDS-PAGE monsterbuffer met 2-mercaptoethanol onmiddellijk voor gebruik en verwarm tot 95 °C gedurende 10 minuten voordat u het aan de celpellet toevoegt. Resuspendeer de celpellet in hete 1x SDS-PAGE monsterbuffer en meng goed door op en neer te pipetteren. Verwarm de resuspended cel pellet in 1x monster buffer op 95 °C gedurende 10 min.
   OPMERKING: Bewaar de monsters na oplosbaarheid in de monsterbuffer indien nodig langdurig bij −20 °C.
6. Bereid de oplossende gel voor. Ontgas alle componenten behalve ammoniumpersulfaat (APS) en TEMED gedurende 15 minuten.
7. Voeg APS en TEMED toe vlak voordat u de gel giet. Leg de oplossende gel voorzichtig over met water. Laat de oplossende gel polymeriseren, ~30-45 min.
8. Decanteer het water en bereid de stapelgel voor. Voeg de stapelgel toe en zorg ervoor dat bubbels worden vermeden. Plaats een kam met het relevante aantal putjes en laat gedurende 5 minuten polymeriseren. Controleer de polymerisatie met behulp van overgebleven stapelgel.
9. Monteer de gel voor het uitvoeren van SDS-PAGE en voeg reservoirbuffer toe aan de kamer.
10. Laad 10 μL van elk monster per put, of 8 μL van de eiwitladder. Voer op 180 V totdat de monsters in de oplossende gel komen en verlaag vervolgens de spanning tot ~ 160 V en loop totdat de kleurstof voorkant ~ 0,5 cm van de rand van de plaat is.
    OPMERKING: De tijd die nodig is voordat de monsters de bodem bereiken, kan variëren tussen 1-1,5 uur. De tijd kan worden verlengd door de spanning te verlagen. Verlaag de spanning nooit tot nul. Hogere spanningen kunnen het "glimlachen" van de gel verhogen en de platen kraken.
11. Breng de gel over op Coomassie-vlek (voor eiwitkleuring) of op 1x transferbuffer (voor western blotting). Voor Coomassie-kleuring, 's nachts vlekken en vervolgens vasthouden, beeld en droog.
12. Voor western blot, bereid het transfersysteem voor volgens de instructies van de fabrikant.
13. Gebruik voor een natte overdracht koude 1x transferbuffer en voorvochtige pads, filterpapier en nitrocellulose. Voor het bio-rad Protean III-systeem (zie hier gebruikte materiaaltabel) mag het filterpapier worden gesneden tot 10 cm x 7,5 cm. Snijd de nitrocellulose tot 9 cm x 6,75 cm.
    LET OP: Nitrocellulose is licht ontvlambaar. Vermijd open vuur en andere potentiële ontstekingsbronnen.
14. Leg de transfercassette op met pads, filtreerpapier en nitrocellulose. Rol luchtbellen uit. Voeg de gel voorzichtig toe.
15. Voeg het filtreerpapier toe en rol luchtbellen uit. Voeg de pad toe, sluit de cassette en steek in de houder in de juiste richting (zorg ervoor dat nitrocellulose naar de rode pool is gericht). Voeg een roerstaaf en een ijspak toe aan de zijkant en vul het reservoir af met koude 1x transferbuffer. Transfer bij 110 V gedurende 90 min.
    OPMERKING: De warmte die tijdens de overdracht wordt gegenereerd, kan de overdracht nadelig beïnvloeden. Gebruik voor een goede overdracht altijd koude 1x overdrachtsbuffer.
16. Verwijder de nitrocellulose en vlek met Ponceau-oplossing gedurende ~ 5 min. Spoel af met ultrapuur water. Markeer de eiwitladder met potlood en snijd de vlek indien nodig bij. Houd de vlek vast met behulp van overgebleven overdrachtsbuffer.
    OPMERKING: Ponceau kan vele malen worden hergebruikt.
17. Blokkeer de nitrocellulose in 25 ml van 5% BSA in 1x TBST bij 4 °C, met schudden, 's nachts. Gooi vervolgens de blokkerende oplossing weg en voeg primair antilichaam (1: 1.000) toe in 1% BSA in 1x TBST. Eén nacht op 4 °C.
    OPMERKING: Het primaire antilichaam kan worden opgeslagen bij −20 °C en meerdere keren worden hergebruikt.
18. Was de nitrocellulose 3x gedurende 10 min elk in 1x TBST met schudden. Gooi de was weg en voeg 10 ml HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (1:10.000) toe aan 1% BSA in 1x TBST. Schud op kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was de nitrocellulose 3x gedurende 10 min elk in 1x TBST met schudden.
19. Bereid ECL-reagens onmiddellijk voordat u de nitrocellulose in beeld brengt. Decanteer vlak voor de beeldvorming de TBST en voeg het ECL-reagens toe aan de nitrocellulose. Schud gedurende 1 min. Stel je de gel voor.

Results

Verhoogde promastigotengevoeligheid voor SLO in de buffer van Tyrode in vergelijking met M199
De SLO-gevoeligheid van L. major promastigoten werd vergeleken tussen verschillende assaybuffers. Wild-type, spt2^-, en spt2^-/+SPT2 promastigoten werden uitgedaagd met SLO in serumvrije M199 of Tyrode's buffer aangevuld met 2 mM CaCl₂ gedurende 30 minuten voorafgaand aan de analyse op een flowcytometer. Geschikte parasieten voor analyse waren afzonder...

Discussion

In deze studie werden methoden beschreven om de moleculaire mechanismen en functies van PFT's te bestuderen, met behulp van de menselijke ziekteverwekker Leishmania major als modelsysteem. Er werd een op medium-throughput flowcytometrie gebaseerde cytotoxiciteitstest ontwikkeld om de levensvatbaarheid van eencellige cellen te meten. De levensvatbaarheid is kwantitatief op populatieniveau omdat LC_50-waarden kunnen worden berekend op basis van de dosis-responscurve met behulp van logistieke modellering....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.2 mL microtiter (Marsh) tubes	Fisher	02-681-376	Cytotoxicity assay
1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	05-408-129	Toxin dilutions
15 mL centrifuge tube	Avantor VWR (Radnor, PA)	89039-666	Om cellen en media vast te houden
1x Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher	BP399	Voor celverwerking
3% H2O2	Walmart  (Fayetteville, AR)	N/A	Voor ECL
5x M199	Cell-gro	11150067	Basal groeimedia voor L. major promastigoten
Biosafety cabinet	Baker		Om cellen te kweken in steriele omstandigheden
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher	BP1605-100	Fractie V acceptabele zuiverheid
CaCl2	Fisher	BP510-100	Stockconcentratie 100 mM
Centrifuge	Thermo Fisher	Heraeus Megafuge 40R	Om de cellen uit de cultuur te pellen
Cy5 Mono-reactive dye pack	Cytiva (Marlborough, MA)	PA25031	Fluorophore label voor toxines
Digital dry bath	Benchmark	BSH1002	Om eiwitmonsters te denatureren
EGTA	Amresco	0732-100G	Stockconcentratie 0,5 M
Excel	Microsoft (Redmond, VA)		Gegevensanalysesoftware
Flow cytometer (4-laser Attune NxT)	Fisher		Cytometer voor dataverwerving
FlowJo	BD (Ashland, OR)		Software
Formaldehyde	Fisher	BP531-500	Fixatief voor celtelling
G418	Fisher	BP673-1	Selectiemiddel voor cellen
Hellmanex III	Sigma	Z805939	Verdun 1:4 voor het schoonmaken van cytometer
Hemacytometer	Fisher	0267151B	Voor het tellen van cellen
Human red blood cells	Zen-bio (Durham, NC)	SER-10MLRBC	Om toxineactiviteit te valideren
Ice bucket
Light microscope	Nikon	Eclipse 55i	Om cellen te visualiseren
Nitrocellulose	Fisher	88018	Voor het onderzoeken van eiwitten via antilichamen
Pipettors and tips	Avantor VWR		Om reagentia af te geven
Power supply	Bio-Rad		Om SDS-PAGE en overdrachten uit te voeren
Propidium iodide	Biotium	40016	Stockconcentratie 2 mg/mL in water
Protein ladder	Bio-Rad	161-0373	Om het moleculair gewicht van eiwitten te bepalen
SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III)	Bio-Rad	165-3302	Om eiwitten te scheiden op basis van hun grootte
Sealing tape	R&D	DY992	Om platen met cellen te verzegelen
Streptolysin O C530A plasmid insert			Gekloond in pBAD-gIII vector (Referentie: 7)
Streptolysin O C530A toxin	Lab purified		Specifieke activiteit  4,34 x 105 HU/mg
Swinging bucket rotor	Thermo Fisher	75003607	Om cellen te centrifugeren
V-bottom plate	Greiner Bio-one	651206	Voor cytotoxicity assay
Vortex	Benchmark	BV1000	Om cellen te mengen
Western blot imaging system (Chemi-doc)	Bio-Rad		Om eiwitten door western blot te visualiseren
Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III)	Bio-Rad	170-3930	Overdracht van eiwitten naar nitrocellulose
Whatman Filter paper	GE Healthcare Life Sciences	3030-700	Gebruikt bij de overdracht van eiwitten naar nitrocellulose
Antibody
Anti-ERK antibody	Cell Signaling Technologies	Cat# 9102S	Konijn (1:1000 verdunning)
Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody	CreativeBioLabs	Cat# WIC79.3	Muis (1: 1000)
Anti-MEK antibody	Cell Signaling Technologies	Cat# 9122L	Konijn (1:1000)
Anti-mouse IgG, HRP conjugate	Jackson Immunoresearch	Cat#715-035-151	Ezel (1:10000)
Anti-phosphoERK antibody	Cell Signaling Technologies	Cat# 9101S	Konijn (1:1000)
Anti-pMEK antibody	Cell Signaling Technologies	Cat# 9121S	Konijn (1:1000)
Anti-rabbit IgG, HRP conjugate	Jackson Immunoresearch	Cat#711-035-152	Ezel (1:10000)
Anti-tubulin antibody	Sigma	Cat# T5168	Muis (1: 2000)
Leishmania major Genotypes			Referentie: 13
Episomal addback (spt2-/+SPT2)			Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2
Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2-)			Δspt2::HYG/Δspt2::PAC
Wild type (WT)			LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P)