Isolatie van regenererende hepatocyten na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen

Samenvatting

Met lipiden beladen hepatocyten zijn inherent aan leverregeneratie, maar gaan meestal verloren bij centrifugatie van dichtheidsgradiënt. Hier presenteren we een geoptimaliseerd celisolatieprotocol dat steatotische hepatocyten behoudt, wat representatieve populaties van regenererende hepatocyten oplevert na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen.

Samenvatting

Partiële hepatectomie is op grote schaal gebruikt om leverregeneratie bij muizen te onderzoeken, maar de isolatie van hoge opbrengsten van levensvatbare hepatocyten voor downstream eencellige toepassingen is een uitdaging. Een duidelijke accumulatie van lipiden in regenererende hepatocyten wordt waargenomen tijdens de eerste 2 dagen van normale leverregeneratie bij muizen. Deze zogenaamde transient regeneration-associated steatose (TRAS) is tijdelijk maar overlapt gedeeltelijk de belangrijkste proliferatieve fase. Dichtheidsgradiëntzuivering is de ruggengraat van de meeste bestaande protocollen voor de isolatie van primaire hepatocyten. Omdat gradiëntzuivering afhankelijk is van de dichtheid en grootte van cellen, scheidt het niet-steatotische van steatotische hepatocytenpopulaties. Daarom gaan vette hepatocyten vaak verloren, wat niet-representatieve hepatocytenfracties oplevert.

Het gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige en betrouwbare methode voor de in vivo isolatie van regenererende hepatocyten, ongeacht hun lipidegehalte. Hepatocyten van mannelijke C57BL/6-muizen worden 24-48 uur na hepatectomie geïsoleerd door een klassieke tweestaps collagenaseperfusiebenadering. Een standaard peristaltische pomp drijft de verwarmde oplossingen via de gekatheteriseerde inferieure vena cava in het restant, met behulp van een retrograde perfusietechniek met uitstroom door de poortader. Hepatocyten worden gedissocieerd door collagenase voor hun afgifte uit de Glisson-capsule. Na het wassen en zorgvuldig centrifugeren kunnen de hepatocyten worden gebruikt voor eventuele downstream-analyses. Concluderend beschrijft dit artikel een eenvoudige en reproduceerbare techniek voor de isolatie van een representatieve populatie van regenererende hepatocyten na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen. De methode kan ook helpen bij de studie van leververvetting.

Inleiding

De lever kan zichzelf regenereren, zelfs na groot weefselverlies. Dit unieke regeneratieve vermogen wordt expliciet geïllustreerd door het experimentele model van partiële (70%) hepatectomie, voor het eerst beschreven bij ratten door Higgins en Anderson in 1931¹. In dit model wordt 70% van de lever operatief verwijderd van dieren door grotere leverkwabben af te knippen. De resterende lobben groeien vervolgens door compenserende hypertrofie om de oorspronkelijke levermassa binnen ongeveer 1 week na de operatie te herstellen, zij het zonder herstel van de oorspronkelijke leverarchitectuur ^2,3. Aanvullende hepatectomie met verschillende hoeveelheden weefselverwijdering zijn ontwikkeld, zoals 86% verlengde hepatectomie waarbij het leverrestant te klein is om te herstellen, wat uiteindelijk leidt tot posthepatectomie leverfalen (PHLF) en daaropvolgende dood bij 30% -50% van de dieren ^4,5,6. Deze modellen maken de studie van normale en mislukte leverregeneratie mogelijk, afhankelijk van de hoeveelheid gereseceerd weefsel (figuur 1).

Hoewel muismodellen van hepatectomie al vele jaren met succes worden gebruikt, hebben pas onlangs meer geavanceerde analytische methoden een dieper inzicht op eencellig niveau mogelijk gemaakt. Voor de meeste van deze methoden is de aanwezigheid van individuele hepatocyten echter een basisvoorwaarde. De meeste protocollen voor de isolatie van primaire hepatocyten zijn gebaseerd op een tweestaps collagenaseperfusietechniek en daaropvolgende dichtheidsgradiëntzuivering om levensvatbare hepatocyten te scheiden van puin en niet-parenchymaal, evenals dode cellen ^7,8,9. Deze methode werd voor het eerst beschreven door Berry en Friend in 1969¹⁰ en aangepast door Seglen en collega's in 1972^11,12. Omdat gradiëntcentrifugatie echter afhankelijk is van de dichtheid en grootte van cellen, gaan lipide-beladen hepatocyten vaak verloren tijdens standaardzuivering. Hoewel een dergelijk verlies voor veel onderzoeksvragen verwaarloosbaar kan zijn, is het een cruciaal aspect voor vroege leverregeneratie. Tijdens de eerste 2 dagen accumuleren hepatocyten in de regenererende muizenlever lipiden, waardoor ze in omvang toenemen en in dichtheid dalen. Deze voorbijgaande regeneratie-geassocieerde steatose (TRAS) dient om regeneratieve brandstof te leveren en is tijdelijk, maar overlapt gedeeltelijk de belangrijkste proliferatieve fase en is ongelijk verdeeld binnen de leverkwabben - de functionele eenheden van de lever^13,14. Na verlengde 86%-hepatectomie treedt TRAS echter ook op, maar blijft bestaan, omdat de regeneratie is vastgelopen en lipiden niet worden geoxideerd¹⁴. Daarom zal gradiëntzuivering van hepatocyten na 70% - of 86% -hepatectomie niet-representatieve fracties opleveren, omdat de meeste lipide-beladen hepatocyten verloren gaan vanwege hun lage dichtheid¹⁵.

In dit aangepaste isolatieprotocol worden hepatocyten van C57BL/6-muizen 24-48 uur na hepatectomie geïsoleerd door een klassieke tweestaps collagenaseperfusiebenadering. Meestal worden cannulatie en perfusie van het restant voor celisolatie gedaan via de poortader. De portovasculaire weerstand in kleine resten die overblijven na een grote resectie is echter hoog¹⁶, en dus is perfusie delicaat. Omdat de vena cava onaangetast blijft door hepatectomie, kan perfusie gemakkelijk in retrograde richting worden uitgevoerd via cannulatie van de vena cava. Een standaard peristaltische pomp drijft de verwarmde oplossingen via de gekatheteriseerde inferieure vena cava in het leverrest, met behulp van retrograde perfusie met uitstroom door de poortader (aanvullende figuur S1). Hepatocyten worden gedissocieerd door collagenasen en vrijgegeven uit de Glisson-capsule. Na het wassen en zorgvuldig verwerken van levensvatbare hepatocyten door stapsgewijze isolatie met behulp van een centrifugatiebenadering met lage snelheid, kunnen de hepatocyten worden gebruikt voor eventuele downstream-analyses.

Protocol

Alle dierproeven waren in overeenstemming met de Zwitserse federale diervoorschriften en goedgekeurd door het Veterinair Bureau van Zürich (nr. 007/2017, 156/2019) om de menselijke zorg te garanderen. Mannelijke C57BL/6 muizen in de leeftijd van 10-12 weken werden gehouden op een 12 uur dag/nacht cyclus met gratis toegang tot voedsel en water. Elke experimentele groep bestond uit zes tot acht dieren. Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, apparatuur en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.

1. Partiële hepatectomie bij muizen

1. Voor standaard hepatectomie (70%) ligate en reseceer de linker laterale kwab, het rechterdeel van de mediane kwab en het linker deel van de mediane kwab (figuur 1B). Verwijder voor uitgebreide hepatectomie (86%)⁴ ook de caudate lobben en de rechter voorkwab (figuur 1C).
2. OPMERKING: Standaard hepatectomie is een procedure die al vele jaren wordt gebruikt in leverregeneratieonderzoek. Protocollen voor deze procedure zijn beschikbaar^3,17, inclusief het video-ondersteunde protocol van Mitchell en Willenbring ¹⁸. Meer informatie over de technieken die hier worden gebruikt voor hepatectomie is te vinden in Aanvullend Dossier 1.

Figuur 1: Standaard (70%) en uitgebreide (86%) hepatectomie bij muizen. (A) De vijf leverkwabben van muizen en hun respectieve bijdragen aan het totale levergewicht. (B) Schematische illustratie van 70%-hepatectomie bij muizen. De donkere kwabben vertegenwoordigen het toekomstige leverrestant. (C) Schematische illustratie van 86%-hepatectomie bij muizen. De donkere kwabben vertegenwoordigen het toekomstige leverrestant. (D) Precieze volume van gereseceerd weefsel na 70%- en 86%-hepatectomie. (E) Muizenbuik onmiddellijk na 70%-hepatectomie; (F) muizenbuik onmiddellijk (links) en 48 uur (rechts) na 86%-hepatectomie. Let op de bleke kleur van het steatotische overblijfsel (witte pijl). n = 6-7/groep. Afkortingen: sHx = standaard hepatectomie; eHx = uitgebreide hepatectomie; LW = levergewicht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Bereiding van de perfusieoplossingen

1. Bereid de perfusie-, verterings- en conserveringsbuffers voor (zie tabel 1).
   1. Stel de pH van alle bufferoplossingen in op 37 °C door zo nodig natriumhydroxide (NaOH) of waterstofchloride (HCl) toe te voegen. De optimale pH voor de buffers is 7,4.
   2. Leg de conserveringsbuffer en Williams' Medium E op ijs.
2. Bereid de flowcytometriebuffer voor en bewaar deze op ijs.

Tabel 1: Oplossingen en buffers die worden gebruikt voor de vertering en zuivering van hepatocyten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

3. Voorbereiding van perfusieapparatuur

1. Verwarm het waterbad tot 42 °C en plaats de perfusiebuffer (50 ml) en de vergistingsbuffer (10-20 ml) in het waterbad. Voeg nog geen collagenase toe aan de verteringsbuffer.
2. Bereid de peristaltische pomp voor en plaats de slang. De volledige perfusie-instelling is weergegeven in figuur 2.
   1. Sluit een 26 G IV-canule aan op het uitlaatuiteinde van de slang met behulp van een Luer-vergrendelingsconnector. Steek het inlaatuiteinde van de buis in de voorverwarmde perfusiebufferbuis in het waterbad. Spoel de slang met 70% ethanol, gevolgd door 50 ml steriel natriumchloride (NaCl 0,9%). Primeer de slang met warme perfusiebuffer (pompsnelheid van 3 ml/min).
3. Verdoof de muis met isofluraan inhalatie-anesthesie (800 ml / min O 2, 3% -5% isofluraan voor inductie en₂% voor onderhoud tijdens de procedure). Behandel isofluraan onder een laboratoriumkap en zorg voor voldoende ventilatie.
4. Buprenorfine subcutaan toedienen 30 minuten vóór de operatie in een dosering van 0,1 mg/kg lichaamsgewicht.
5. Om onderkoeling te voorkomen, plaatst u de verdoofde muis op een opwarmkussen en plaatst u een opgerold doekweefsel onder de bovenbuik om de lever boven de andere organen te verheffen en de toegang tot de inferieure vena cava te vergemakkelijken.
   OPMERKING: Gebruik geen weefsel dat te dik is, omdat knikken van bloedvaten mogelijk is en de perfusie-werkzaamheid zou worden beïnvloed.
6. Voeg oogzalf toe om schade aan het hoornvlies te voorkomen.
7. Voordat u met de operatie begint, moet u ervoor zorgen dat het dier voldoende wordt verdoofd door de pedaalterugtrekkingsreflex te testen (voetkussen knijpen op beide achterpoten). In geval van een reactie, geef extra anesthesie en test opnieuw voordat u de procedure start.
8. Reinig de buik met 70% ethanol.
   1. Open de middellijnincisie opnieuw door de hechtdraad door te snijden en de wondranden voorzichtig uit elkaar te trekken. Als de hepatectomie ouder is dan 24-48 uur, verwijder dan de hechting en knip de huid met een schaar.
   2. Bevestig een 5-0 polypropyleenhechting aan het borstbeen, trek eraan en bevestig het in deze positie. Gebruik een oprolmechanisme of eenvoudige clips om de buik open te houden. De buikholte moet zoveel mogelijk worden blootgesteld om de toegang en visualisatie te optimaliseren.
9. Beweeg de darmen naar rechts met wattenstaafjes om de poortader en de vena cava te onthullen. Gebruik een natte doek om de darmen vast te houden.
10. Plaats een zwaar voorwerp van ongeveer 2 cm hoog (bijvoorbeeld een met siliconen beklede gewichtsring voor volumetrische kolven) naast de achterpoten van de muis (aanvullende figuur S2A). Plaats de slang met de aangesloten 26 G IV canule op het voorwerp en plaats de naald voorzichtig bovenop de vena cava. Pas de lengte van de slang aan.
11. Doe de bereide collagenase-stockoplossing in de voorverwarmde verteringsbufferbuis. Voeg 250 μL van de stamoplossing toe aan 10 ml verteringsbuffer. Bereid 10-20 ml verteringsbuffer per dier voor. Voor grotere dieren of perfusie van hele levers, bereid tot 30 ml verteringsbuffer voor.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de collagenase-stockoplossing ongeveer 30 minuten voor het begin van het verteringsproces toe te voegen aan de verwarmde verteringsbuffer.
    
    Figuur 2: Overzicht van de perfusie-opstelling. (A) Operatietafel met de apparatuur die nodig is voor de perfusie. (B) De materialen die nodig zijn voor de bereiding van de lever, evenals hepatocytenextractie en isolatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Cannulatie en perfusie

1. Stel het pomptoerental in op 3 ml/min en zet de pomp aan. Laat de voorverwarmde perfusiebuffer de naald bereiken. Gooi de eerste 2-3 ml perfusiebuffer weg.
2. Voer cannulatie uit van de inferieure vena cava.
   1. Terwijl de buffer door de naald loopt, steekt u de 26 G IV-canule onder een ondiepe hoek in de vena cava onder de nier. Zorg ervoor dat de naald naar boven wijst.
   2. Gebruik een wattenstaafje om de vena cava voorzichtig caudaal onder de prikplaats te trekken, zodat de geleverde spanning het inbrengen van de canule in de ader vergemakkelijkt. Zoek naar bloed in de flitskamer van de katheter wanneer de naald het lumen binnenkomt.
   3. Verplaats de naald nog eens 2-3 mm om ervoor te zorgen dat de punt van de plastic katheter ook in de ader is gekomen.
   4. Schuif de plastic katheter over de naald en nog eens 5 mm in de vena cava. Verwijder de naald langzaam en heel voorzichtig.
      OPMERKING: Het fixeren van de canule met een ligatuur wordt niet aanbevolen. Deze stap is tijdrovend omdat het vat hiervoor eerst moet worden ontleed. Als de canule losjes is gepositioneerd en ondersteund met een object, is verdere fixatie niet nodig (zie perfusie-opstelling in aanvullende figuur S2). Om de cannulatieplaats te stabiliseren en terugstroming te voorkomen, kan een enkele druppel monomeer n-butyl-cyanoacrylaat op de cannulatieplaats worden toegevoegd.
3. Wanneer er bloed uit de canule valt, vult u deze met een warme perfusiebuffer met een spuit.
4. Bevestig de buis opnieuw aan de canule, die nog steeds draait met een pompsnelheid van 3 ml / min. Laat de perfusiebuffer in de lever komen.
5. Zoek na 2-3 s naar witte vlekken in de lever en / of uitbreiding / zwelling van de poortader, die erop wijzen dat de perfusiebuffer door de lever stroomt en de leverlobben binnendringt vanuit de centrale ader (figuur 3).
6. Wacht tot de poortader zichtbaar opzwelt binnen 1-2 s na het verschijnen van witte vlekken op het leveroppervlak. Knip de poortader met een schaar zo distaal mogelijk van de lever hilus. Gebruik een clip van een microvat om de snijplaats te labelen (niet af te sluiten) (figuur 3B).
   OPMERKING: Dit vereenvoudigt de beoordeling van de stroom door de lever tijdens het perfusieproces. De lever zuivert onmiddellijk van bloed en wordt binnen enkele seconden geelwit (figuur 3C). Een extra snee door de huid aan de rechterkant van de buikopening vergemakkelijkt de uitstroom van het bloed en de perfusieoplossing (figuur 3B en aanvullende figuur S2B, C).
7. Verhoog de stroom tot 4-7 ml / min, afhankelijk van het gewicht van het dier, de levergrootte en de omvang van de eerdere hepatectomie.
8. Klem de poortader vast met een pincet of vaatklem gedurende 7-10 s. Zorg ervoor dat er geen vloeistof doorheen gaat.
   OPMERKING: De lever zwelt zichtbaar op tijdens het klemmen en ontspant bij het loslaten. Dit is cruciaal om de hele lever te spoelen en te ontdoen van eventueel achtergebleven bloed.
9. Voer na ongeveer 30 s een tweede klem uit en zorg ervoor dat de lever opzwelt en ontspant. Ga door met het spoelen van het dier totdat de buffer die uit de poortader stroomt vrij is, maar ten minste gedurende 3-4 minuten.
   OPMERKING: De pompsnelheid is afhankelijk van de buis en de grootte van de lever. Het moet individueel worden geëvalueerd.
10. Op dit punt van de procedure had euthanasie secundair aan exsanguinatie moeten plaatsvinden. Bevestig dat de systemische circulatie is gestopt (geen hartslag of flikkering van het hart). Om de dood te garanderen, wordt bilaterale pneumothorax in dit stadium van de procedure uitgevoerd als secundaire fysieke methode van euthanasie.
    OPMERKING: Verlaag de pompsnelheid enigszins als de systemische circulatie is gestopt (geen hartslag of flikkering van het hart).

Figuur 3: Perfusieproces van cannulatie tot vertering. (A) Anatomie van de muizenlever met de inferieure vena cava (witte pijl) en de poortader (gele pijl). (B) Cannulatie van de vena cava inferior. De canule wordt vastgezet met een ligatuur (witte pijl) en de locatie van de uitstroom door de geopende poortader wordt gemarkeerd (niet geklemd) met een microvatklem. (C) Let op het verschijnen van fragmentarische structuren voordat de perfusiebuffer de lever heeft gezuiverd van al het resterende bloed (witte pijl). De huid wordt ingesneden (gele pijl) en een wattenstaafje wordt geplaatst om de afvoer van bloed en perfusievloeistof te garanderen. Intermitterend klemmen kan worden uitgevoerd met een vaatklem of pincet. (D) De lever moet van al het bloed worden ontdaan (*). Nadat de collagenase-bevattende verteringsbuffer de lever is binnengedrongen, zal deze na het klemmen niet meer ontspannen en zullen de leverkwabben in omvang toenemen. (E) Na een tijdje kan een sprankelend uiterlijk op het oppervlak van de lever worden waargenomen (*). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Spijsvertering

1. Pauzeer de perfusiepomp en breng de inlaatslang snel over van de perfusiebuffer naar de voorverwarmde verteringsbuffer. Start de pomp opnieuw op.
2. Voordat de spijsverteringsbuffer de lever bereikt, klemt u de poortader nog een keer gedurende 3-4 s. Zorg ervoor dat de lever ontspant bij het loslaten van de klem en de perfusievloeistof helder blijft.
   OPMERKING: De verteringsbuffer bevat fenolrood en is gemakkelijk te onderscheiden van de heldere perfusiebuffer. Dit zorgt voor eenvoudige tracking in de buis.
3. Zodra de verteringsbuffer de lever heeft bereikt, klemt u de poortader nogmaals vast met een microvatklem.
   OPMERKING: Bij het klemmen zwelt de lever op, maar ontspant niet bij het loslaten van de klem. Dit is normaal.
4. Om het verteringsproces te vergemakkelijken, sluit u de superieure vena cava met een vaatklem direct onder het diafragma om de spijsverteringsbuffer van de inferieure vena cava naar de lever naar de uitstroom door de geopende poortader te laten gaan.
   OPMERKING: Deze klemming zorgt ervoor dat de systemische circulatie wordt omzeild en onnodig contact met resterende bloedbestanddelen/remmers wordt voorkomen. Deze stap is optioneel, omdat het moeilijk is om de superieure vena cava achter het vergrote leverweefsel te benaderen na schijnchirurgie, maar de toegang is veel gemakkelijker bij hepatectomiemuizen.
5. Vergist gedurende ongeveer 4 minuten bij een stroomsnelheid van 5 ml / min. Naarmate de spijsvertering vordert, zoek dan naar tekenen van de lever die begint op te zwellen en kleine heldere / transparante secties op het oppervlak van de lever. Merk verder op dat de lever de textuur van een nat stuk doek aanneemt en bijna drassig lijkt (figuur 3E). Onderzoek de consistentie door voorzichtig aan te raken met een vochtig wattenstaafje.
6. Ga door met de perfusie totdat een duidelijk verschil in de oppervlaktestructuur van de lever kan worden waargenomen. Merk op dat de lever een zeer lichte kleur en een bruisend uiterlijk aanneemt (figuur 3E) en dat de capsule van de Glisson (d.w.z. de leverzak) zich scheidt van het parenchym. Stop het verteringsproces zodra de lever deze eigenschappen heeft verworven, omdat oververtering de hepatocyten kan beschadigen. Verwijder de naald voordat er lucht in de lever komt.
   OPMERKING: Meestal is 10-20 ml verteringsbuffer nodig om voldoende spijsvertering te bereiken. Dit hangt af van de grootte van het dier, de mate van hepatectomie, de opstelling van de slang en de kwaliteit van de collagenase-oplossing. Verhoog indien nodig de perfusietijd in plaats van de perfusiesnelheid. Te veel druk in het vasculaire systeem kan ervoor zorgen dat de lever barst en de perfusie / spijsverteringsvloeistof kan verloren gaan in de retroperitoneale ruimte.

6. Bereiding van de lever

1. Verwijder de lever voorzichtig uit de buikholte. Wees heel voorzichtig, want het is nu erg dun en fragiel.
2. Pak het centrale bindweefsel tussen de lobben vast met een tang en til het iets naar boven op, met behulp van het als ankerpunt.
3. Knip alle verbindingen van de lever met andere organen door, verwijder de galblaas en plaats de lever in de ijskoude conserveringsbuffer.
   OPMERKING: Idealiter moeten hepatocytenextractie en verdere verwerking onmiddellijk plaatsvinden om de levensvatbaarheid van hepatocyten te behouden. Indien nodig kan de lever echter korte tijd worden bewaard bij 4 °C (bijvoorbeeld voor transport). Deze vertraging mag niet langer zijn dan 30-40 minuten.

7. Hepatocytenextractie

1. Breng de lever over in een petrischaaltje van 10 cm en voeg 10 ml ijskoude Williams' Medium E toe.
2. Scheur de capsule van de Glisson met een pincet met fijne punt op een paar plaatsen langs het leveroppervlak. Pak een centraal deel (bijvoorbeeld bindweefsel bij de lever hilus) vast met twee pincetten en trek ze langzaam uit elkaar, waardoor de capsule kan scheuren zonder de hepatocyten te beschadigen. Laat de cellen los door de capsule voorzichtig te schudden (aanvullende figuur S3).
   OPMERKING: Idealiter scheurt de lever gemakkelijk uit elkaar en laat de cellen los. Oefen geen geweld uit. Een celschraper kan helpen om alle cellen volledig te verwijderen en de celopbrengst te verhogen. Knip de lever niet in stukken met een schaar.
3. Filtreer 5 ml leverpulp door een celzeef van 100 μm in een buis van 50 ml. Spoel het filter af met 10 ml vers ijskoud medium. Filter de resterende 5 ml pulp door de celzeef.
   OPMERKING: Gebruik een serologische pipet van 25 ml om de leverpulp over te brengen met de gedissocieerde hepatocyten (figuur 4A). Kleinere pipetten met kleinere openingen verhogen de schuifspanning en beschadigen de hepatocyten onomkeerbaar.
4. Voeg in totaal 30 ml koud medium toe om de petrischaal af te spoelen, filter deze en voeg de suspensie toe aan de buis van 50 ml totdat deze vol is. Alle geïsoleerde cellen zijn nu in suspensie (figuur 4B).

Figuur 4: Zuivering door zachte centrifugering . (A) Leverhomogenaat dat overblijft na de extractiestap. B) microscopisch beeld (20x vergroting) van het homogenaat; Let op de gemarkeerde verontreiniging met puin. C) zuiveringscentrifugatiestappen en D) microscopische beelden van de weg te gooien supernatanten. (E) Microscopisch beeld van de gezuiverde hepatocytenfractie. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

8. Hepatocytenisolatie

1. Draai bij 50 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C (laagste versnelling en laagst mogelijke rem).
   OPMERKING: Hepatocyten zijn dichter dan niet-parenchymale levercellen. Vanwege de lage centrifugatiekracht worden alleen hepatocyten gepelletiseerd, terwijl andere cellen (bijv. Immuuncellen, erytrocyten en sinusoïdale cellen) in het supernatant blijven.
2. Zuig het grootste deel van het supernatant op, waardoor 1 ml overblijft om de cellen te resuspenderen door de buis voorzichtig te draaien.
3. Voeg 40 ml koud Williams' E-medium toe en draai opnieuw bij 50 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C (lage acceleratie, lage rem) om dode hepatocyten en celresten verder te verwijderen en pellet levensvatbare en vette hepatocyten (figuur 4C).
4. Gooi het grootste deel van het supernatant weg en laat 1 ml over om de cellen te resuspenderen door de buis te draaien.
5. Voeg 40 ml koud Williams' E-medium toe en draai opnieuw op 50 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C (lage acceleratie, lage rem).
6. Zuig het grootste deel van het supernatant op, waardoor 1 ml overblijft om de cellen te resuspenderen door de buis voorzichtig te draaien.
   OPMERKING: Stop dit proces niet totdat cellen zijn gefixeerd of geanalyseerd. Hepatocyten zijn erg kwetsbaar en elke vertraging in het perfusie-, verterings- en zuiveringsproces kan de cellen beschadigen.
7. Bepaal de uiteindelijke celconcentratie na toevoeging van trypan blauw, met behulp van een door Neubauer verbeterde telkamer.
   OPMERKING: De meeste puin en niet-parenchymale cellen zijn nu verwijderd, wat resulteert in een schone pellet van ongeveer 10-15 × 10⁶ hepatocyten die overblijven na 70% -hepatectomie.
8. Voeg afhankelijk van de gewenste concentratie meer ijskoud medium toe. Gebruik de hepatocytencelsuspensie voor elke downstream-analyse of start een primaire celcultuur.
   OPMERKING: In dit stadium blijven slechts enkele immuun- en niet-parenchymale cellen (<5%) in de suspensie achter. Indien verdere zuivering gewenst is, voert u een negatieve selectie van CD31+ en CD45⁺ cellen uit door middel van magnetische of fluorescentie-geactiveerde celsortering (MACS/FACS). Tot op heden is er geen betrouwbare en robuuste oppervlaktemarker voor leverparenchymale cellen.

9. Bereiding van de geïsoleerde hepatocyten voor flowcytometrie

1. Centrifugeer de hepatocyten op 100 × g gedurende 5 min.
2. Gooi het supernatant weg en voeg de gewenste hoeveelheid flowcytometriebuffer toe, afhankelijk van de concentratie van de celsuspensie.
3. Voeg 1 ml celsuspensie toe in een flowcytometriebuis. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 100 × g en gooi het supernatant weg.
4. Voeg 100-200 μL van de verdunde Alexa Fluor 488 Zombie groene levensvatbaarheidskleurstof (concentratie 1:400) toe aan de cellen en schud ze voorzichtig. Resuspendeer de hepatocyten voorzichtig door handmatig te schudden of een vortexmixer te gebruiken op lage snelheid (maximaal 2-3) gedurende 2 s.
   OPMERKING: Gebruik geen kleine pipetpunten om de cellen opnieuw te suspenderen. Ze zijn erg kwetsbaar en de toegepaste schuifspanning veroorzaakt schade en vermindert de levensvatbaarheid van cellen. Als pipetteren niet te vermijden is, gebruik dan een pipet van 1.000 μL nadat u het kleinste deel van de punt hebt afgesneden om de diameter te vergroten en de cellen heel langzaam te pipetten.
5. Leg de buisjes op ijs of bewaar ze bij kamertemperatuur, afhankelijk van de gewenste kleuring. Incubeer de cellen gedurende 20-30 minuten in het donker.
6. Voeg 2 ml flowcytometriebuffer toe en was de cellen 3x. Centrifugeer de cellen na elke wasstap op 100 × g gedurende 5 minuten.
7. Voeg 2 ml fixatiebuffer toe (1:1, 4% PFA en PBS). Resuspendeer de hepatocyten voorzichtig door handmatig te schudden of een vortexmixer te gebruiken op lage snelheid (maximaal 2-3) gedurende 2 s.
8. Bevestig de cellen gedurende 30 minuten.
9. Centrifugeer op 100 × g gedurende nog eens 5 minuten, gooi het supernatant weg en voeg een flowcytometriebuffer toe.
   OPMERKING: Cellen kunnen worden opgeslagen in flowcytometriebuffer voorafgaand aan analyse tot 72 uur na isolatie.

10. Hepatocyten analyseren met flowcytometrie

1. Analyseer de hepatocyten met behulp van een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder.
   OPMERKING: Houd rekening met de relatief grote omvang van hepatocyten en pas de spanningen aan. Begin met een lage spanning en ga niet hoger dan 350 V voor forward scatter (FSC) en 220 V voor side scatter (SSC).
   1. Pas de spanningen voor FSC en SSC aan de geschatte grote omvang van de cellen aan. Identificeer de hepatocytenpopulatie en registreer alle gebeurtenissen met behulp van SSC-A en FSC-A (figuur 5A).
   2. Merk op dat puin en niet-parenchymale cellen worden weergegeven in de linkerbenedenhoek van de FSC versus SSC-dichtheidsgrafiek en worden uitgesloten (figuur 5A).
   3. Aangezien doubletcellen de analyse kunnen beïnvloeden, construeert u een side scatter height (SSC-H) versus side scatter area (SSC-A) density plot om doubletten uit te sluiten, zoals weergegeven in figuur 5B.
   4. Selecteer de uiteindelijke hepatocytenpopulatie door CD31- (endotheelmarker) en CD45^- (immuunmarker) cellen te gaten (figuur 5C).

Resultaten

TRAS piekt 16 uur na hepatectomie en verdwijnt geleidelijk 32-48 uur na standaard hepatectomie, maar blijft langer dan 48 uur na langdurige hepatectomie. Macroscopisch is TRAS gemakkelijk zichtbaar als een bleke teint van het leverrestant (figuur 1F) en kan worden waargenomen bij hepatectomie muizen tussen 16 h en 48 h na de operatie.

De geschatte uiteindelijke opbrengst is 10-15 × 10 6 hepatocyten na 70%-hepatectomie en 4-9 × 10⁶ na verlengde 86%^<...

Discussie

Het gepubliceerde protocol biedt een betrouwbare en eenvoudige methode om een hoge opbrengst van normale en steatotische muizenhepatocyten te isoleren voor eencellige downstream-analyses of bulkanalyse van cellen na FACS-sortering. Het duidelijke voordeel ten opzichte van dichtheidsgradiëntzuivering is dat het cellulaire lipidengehalte in wezen geen invloed heeft op de effectieve opbrengst van hepatocyten. Zo zal de fractie van steatotische hepatocyten worden behouden en opgenomen in downstream-analyses. Dit is niet alle...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagents
Alexa Fluor 488 Zombie green	BioLegend	423111	Amine-reactive viability dye
Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%	Provet AG	QN01AB06	CAUTION: needs ventilation
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E8008-100ML	-
Ethanol	Sigma-Aldrich	V001229	Dilute with water to 70%
Fetal bovine serum (FCS)	Gibco	A5256701	-
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red	Sigma-Aldrich	H9269-6x600ML	For digestion/preservation
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red	Sigma-Aldrich	H6648-6x500ML	For perfusion buffer
HEPES solution, 1 M	Sigma-Aldrich	83264-100ML-F	-
Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate)	B. Braun	1050052	For stabilization of cannulation site
Hoechst 33258 Staining Dye Solution	Abcam	ab228550	-
Liberase Research Grade	Roche	5401119001	Lyophilized collagenases I/II
NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer	B. Braun	123	-
Paralube Vet Ointment	Dechra	17033-211-38	-
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	A1286301	-
Sudan IV – Lipid staining	Sigma-Aldrich	V001423	-
Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL	Indivior Europe Ltd.	345928	Narcotics. Store securely.
Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered	Sigma-Aldrich	T8154	For cell counting
Williams’ Medium E	Sigma-Aldrich	W4128-500ML	-
Materials
25 mL serological pipette, Greiner Cellstar	Merck	P7865	-
50 mL Falcon tubes	TPP	-	-
BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G	BD Falcon	391349	-
Cell scraper, rotating blade width 25 mm	TPP	99004	-
Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon	BD Falcon	352360	-
Fenestrated sterile surgical drape	-	-	Reusable cloth material
Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm)	Drifton	FILLINGNOZZLE#16	To go into the tubes
Flow cytometry tubes, 5 mL	BD Falcon	352008	-
Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm	Drifton	LM41	Connection tube to syringe
Petri dishes, 96 x 21 mm	TPP	93100	-
Prolene 5-0	Ethicon	8614H	To retract the sternum
Prolene 6-0	Ethicon	8695H	For skin suture
Prolene 8-0	Ethicon	EH7470E	Ligature gall bladder
Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm	Drifton	SC0374T	Perfusion tube
Equipment
BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer	BD	-	-
Isis rodent shaver	Aesculap	GT421	-
Isofluran station	Provet	-	-
Low-speed centrifuge – Scanspeed 416	Labogene	-	-
Neubauer-improved counting chamber	Marienfeld	-	-
Oxygen concentrator – EverFlo	Philips	1020007	0 – 5 L/min
Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix	TPP	94700	-
Shenchen perfusion pump – YZ1515x	Shenchen	YZ1515x	-
Surgical microscope – SZX9	Olympus	-	-
ThermoLux warming mat	Thermo Lux	-	-
Vortex Genie 2, 2700 UpM	NeoLab	7-0092	-
Water bath – Precision GP 02	Thermo scientific	-	Adjust to 42 °C