IDG-SW3-celkweek in een driedimensionale extracellulaire matrix

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het kweken van IDG-SW3-cellen in een driedimensionale (3D) extracellulaire matrix.

Samenvatting

Osteocyten worden beschouwd als niet-proliferatieve cellen die terminaal gedifferentieerd zijn van osteoblasten. Osteoblasten ingebed in de extracellulaire matrix van het bot (osteoïde) brengen het Pdpn-gen tot expressie om cellulaire dendrieten te vormen en te transformeren in pre-osteocyten. Later brengen preosteocyten het Dmp1-gen tot expressie om matrixmineralisatie te bevorderen en daardoor te transformeren in volwassen osteocyten. Dit proces wordt osteocytogenese genoemd. IDG-SW3 is een bekende cellijn voor in vitro studies van osteocytogenese. Veel eerdere methoden hebben collageen I gebruikt als het belangrijkste of het enige onderdeel van de kweekmatrix. Naast collageen I bevat de osteoïde echter ook een grondsubstantie, die een belangrijk onderdeel is bij het bevorderen van celgroei, hechting en migratie. Bovendien is de matrixstof transparant, wat de transparantie van de collageen I-gevormde gel verhoogt en zo helpt bij het verkennen van dendrietvorming door middel van beeldvormingstechnieken. Dit artikel beschrijft dus een protocol om een 3D-gel tot stand te brengen met behulp van een extracellulaire matrix samen met collageen I voor IDG-SW3-overleving. In dit werk werden dendrietvorming en genexpressie geanalyseerd tijdens osteocytogenese. Na 7 dagen osteogene kweek werd een uitgebreid dendrietennetwerk duidelijk waargenomen onder een fluorescentie confocale microscoop. Real-time PCR toonde aan dat de mRNA-niveaus van Pdpn en Dmp1 gedurende 3 weken voortdurend toenamen. In week 4 onthulde de stereomicroscoop een ondoorzichtige gel gevuld met minerale deeltjes, in overeenstemming met de röntgenfluorescentie (XRF)-test. Deze resultaten geven aan dat deze kweekmatrix met succes de overgang van osteoblasten naar volwassen osteocyten vergemakkelijkt.

Inleiding

Osteocyten zijn terminaal gedifferentieerde cellen die zijn afgeleid van osteoblasten ^1,2. Zodra de osteoblast door de osteoïde is begraven, ondergaat deze osteocytogenese en brengt het Pdpn-gen tot expressie om preosteocyten te vormen, het Dmp1-gen om de ^{osteoïde te mineraliseren en de} Sost- en Fgf23-genen om te functioneren als een volwassen osteocyt in botweefsel³. Hier wordt een 3D-kweeksysteem geïntroduceerd om dendrietextensie en markergenexpressie in het osteocytogeneseproces te identificeren.

IDG-SW3-cellen zijn een onsterfelijke primaire cellijn afgeleid van transgene muizen en kunnen osteoblasten uitbreiden of repliceren tot late osteocytendifferentiatie wanneer ze in verschillende media worden gekweekt⁴. Vergeleken met MLO-A5, MLO-Y4 en andere cellijnen is het waarschijnlijker dat het expressieprofiel van functionele eiwitten, het vermogen om calciumzoutafzetting uit te voeren en de reacties op verschillende hormonen in IDG-SW3-cellen hetzelfde zijn als die van primaire osteocyten in het botweefsel⁴.

In vergelijking met 2D-systemen zijn 3D-kweeksystemen beter in staat om de in vivo cellulaire groeiomgeving na te bootsen, inclusief de nutriëntengradiënt, de lage mechanische stijfheid en het omringende mechanische bereik (tabel 1). De meeste van de voorgaande methoden voor het kweken van osteoblastische cellen in een 3D-systeem gebruikten collageen I als de unieke component in formuleringen ^4,5,6, omdat collageen I-vezels dienen als de plaats van calcium- en fosforafzetting. Een onmisbaar bestanddeel in de osteoïde, de extracellulaire matrix, bevat echter een grote groep cellulaire factoren die cellulaire groei, adhesie en migratie bevorderen ^7,8 en is transparant en handig voor beeldvormingsobservatie. Dit protocol gebruikt dus Matrigel (hierna te noemen basale membraanmatrix) als secundaire component voor de osteocytogenesestudie.

Protocol

Dit protocol is geschikt voor het kweken van cellen in vier putjes met platen met 24 putjes. Bij de bereiding van meerdere monsters of platen moeten de hoeveelheden van de reagentia dienovereenkomstig worden verhoogd.

1. Bereiding van het collageen I-mengsel

OPMERKING: Collageen I en basaalmembraanmatrixgel snel bij kamertemperatuur. Daarom moet collageen op ijs (2 °C tot 8 °C) worden behandeld. Alle gebruikte tips en tubes moeten worden voorgekoeld, tenzij anders aangegeven. Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een veiligheidskap.

1. Leg alle reagentia en centrifugebuisjes op ijs.
2. Pipetteer langzaam 0,48 ml collageen I (5 mg/ml) en 0,1 ml 10x minimum essential medium (MEM) (met fenolrood) in een steriele centrifugebuis van 15 ml die op ijs wordt bewaard. Meng goed door zachtjes op en neer te pipetteren.
3. Gebruik volgens het kleurenpalet van de fenolroodindicator een geschikt volume van 7,5% (w/v) NaHCO₃ (ongeveer 0,2 ml) om de fenolroodindicator op oranje te zetten, wat aangeeft dat de pH-waarde tussen 7,0 en 7,4 ligt.
   OPMERKING: Afhankelijk van de pH van het medium wordt een volume NaHCO₃ gebruikt om de pH op ongeveer 7,0-7,4 te brengen. Bovendien wordt NaOH gebruikt voor pH-neutralisatie.
4. Breng het uiteindelijke volume van het mengsel op 1 ml door een geschikt volume ddH₂O toe te voegen. Meng goed door zachtjes op en neer te pipetteren om het gebruik voor te bereiden.
   OPMERKING: Het uiteindelijke volume van ddH₂O is afhankelijk van de hoeveelheid NaHCO 3 of NaOH die in stap_1.3 wordt gebruikt.

2. Bereiding van het cel-matrixmengsel

1. Pipetteer langzaam 0,9 ml basale membraanmatrix in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml op het ijs.
2. Kweek de IDG-SW3-cellen in een T25-kolf met 4 ml compleet medium (alfa-MEM met 10% foetaal runderserum [FBS]) aangevuld met 50 E/ml INF-γ bij 33 °C.
3. Zodra de IDG-SW3-cellen 90% confluentie hebben bereikt, verwijdert u het medium en wast u de cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4 gedurende het hele protocol) met een pipet. Vergist de cellen met 0,5 ml 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) bij 37 °C gedurende 30 s.
4. Inactiveer de trypsine door 3,5 ml compleet medium toe te voegen (alfa-MEM met 10% foetaal runderserum [FBS]). Breng de celsuspensie van 4 ml over in een centrifugebuis van 15 ml.
5. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in 1 ml van het volledige medium op ijs.
6. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en pas de uiteindelijke celdichtheid met het volledige medium aan tot 4 × 10⁵ cellen/ml. Voeg 0,1 ml van de bereide celsuspensie toe aan 0,9 ml van de extracellulaire matrix uit stap 2.1. Meng goed door zachtjes op en neer te pipetteren.
   OPMERKING: Als een celvrije controle nodig is, voeg dan 0,1 ml van het volledige medium toe aan 0,9 ml extracellulaire matrix als negatieve controle.

3. Het cel-gelmengsel plateren

1. Meng voorzichtig de twee mengsels uit stap 2.6 en stap 1.4 goed tot 2 ml door op en neer te pipetteren op het ijs. Pipetteer 0,5 ml van het uiteindelijke mengsel in elk putje (vier putjes van een bord met 24 putjes). Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C om een cel-gelmengsel te vormen.
2. Voeg 0,5 ml osteogeen medium (compleet medium met 50 μg/ml ascorbinezuur en 4 mM β-glycerofosfaat, ook bekend als osteogeen inductiemedium)⁴ toe aan het cel-gelmengsel in elk putje om de osteogene differentiatie bij 37 °C te starten. Beschouw dit als dag 0.
3. Vervang om de 2 dagen de helft van het medium door vers osteogeen medium dat op 37 °C wordt gehouden. Ga door met kweken gedurende 35 dagen.

4. Identificatie van de levensvatbaarheid van de cellen en cellulaire dendrieten met behulp van een confocale microscoop

1. Cel kleuring
   OPMERKING: Calceïne-acetoxymethylester (calceïne AM) is een celpermeente kleurstof die kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te bepalen. Ethidium homodimeer-I (EthD-1) passeert het membraan van intacte/levensvatbare cellen niet⁹. Calceïne AM/EthD-1 kan dus worden gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen en cellulaire dendrieten te identificeren.
   1. Haal op dag 1 en dag 7 van de kweek de calceïne AM-voorraadoplossing (4 mM in DMSO) en EthD-1 voorraadoplossing (2 mM in DMSO/H₂O 1:4 [v/v]) uit de vriezer en laat ze opwarmen tot kamertemperatuur.
      OPMERKING: De gemineraliseerde matrix heeft een sterk autofluorescentiesignaal, dus het pre-osteocytstadium zonder Dmp1-expressie binnen 7 dagen na kweek⁴ is geschikter voor de observatie van celkleuring.
   2. Voeg 4 μL van de 2 mM EthD-1 stockoplossing en 5 μL van de 4 mM calceïne AM-stockoplossing toe aan 2 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) en meng goed. Dit geeft ongeveer 2 μM calceïne AM en 4 μM EthD-1 als werkende oplossingen.
   3. Pipetteer 0,5 ml van de werkoplossing in de putjes in de plaat met 24 putjes. Incubeer gedurende 30-45 minuten bij kamertemperatuur om de cel-gelmatrix te kleuren.
   4. Voeg na incubatie ongeveer 0,5 ml verse D-PBS toe aan een nieuw kweekschaaltje met glazen bodem van 35 mm. Dek de schaal af om besmetting of uitdroging van de monsters te voorkomen.
   5. Breng met een pincet met elleboogpunt de gekleurde celgelmatrix van stap 4.1.3 voorzichtig over in het kweekschaaltje van 35 mm uit stap 4.1.4. Voorkom beschadiging of afschuiving van de cel-gelmatrix.
   6. Bekijk de gelabelde cellen onder een laser confocale fluorescentiemicroscoop.
2. Microscoop aftasten set
   1. Plaats de 35 mm schotel op de tafel. Selecteer de gebieden van de cel-gelmatrix die door het oculair moeten worden gescand met behulp van een 10x objectief. Objectieven met een hogere vergroting worden niet aanbevolen vanwege de grootte van de verlengde dendrieten.
   2. Selecteer de optische filters. Calceïne kan als groen worden bekeken met een standaard fluoresceïnebanddoorlaatfilter en EthD-1 kan als rood worden bekeken met filters voor propidiumjodide of Texas Red-kleurstof. Selecteer de "lijnmodus" voor scannen en stel het "gaatje" in op 2 μm.
   3. Selecteer een gegevensdiepte van 8 bits gegevensdiepte en een afbeeldingsresolutie van 1.024 pixels x 1.024 pixels.
   4. Beeld met behulp van sequentiële lijnscanning met de optimale laser- en detectorinstellingen (houd een minimale laserenergie aan om mogelijke fotobleken te voorkomen).
      OPMERKING: De optimale instelling van de detector hangt af van de uiteindelijke fluorescentiesignalen.
3. Het verzamelen van een "z-stack" van afbeeldingen
   1. Definieer volgens het groene kanaalsignaal de boven- en onderposities van de cel-gelmatrix die moet worden gescand door scherp te stellen door het monster terwijl u continu scant, .
   2. Zodra de boven- en onderkant van het monster zijn opgegeven, selecteert u het gewenste scanframe. Begin met scannen. Het voorbeeld wordt van boven naar beneden gescand met de geselecteerde instellingen uit stap 4.2, waardoor een galerij met afbeeldingen wordt gegenereerd.
4. Identificatie van de levensvatbaarheid van de cel.
   1. Selecteer een segment uit stap 4.3. De groene en rode kanalen geven respectievelijk levende en dode cellen aan.
5. Identificatie van celdendrieten.
   1. Selecteer het enkele groene kanaal om 3D-reconstructies te genereren met de beeldacquisitiesoftware. De diepte-informatie wordt weergegeven als een reeks regenboog pseudokleurenbeelden. De dendrieten aan de onderkant van de gel worden in rood weergegeven, terwijl die aan de bovenkant in blauw worden weergegeven.

5. Uiterlijk identificeren met behulp van een stereomicroscoop

1. Verwijder op dag 1, dag 7, dag 21 en dag 35 van de kweek het kweekmedium en was de gels in de plaat twee keer met D-PBS. Voeg 0,5 ml 4% (v/v) paraformaldehyde in D-PBS toe aan het putje om de cel-gelmatrix gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in de plaat te fixeren.
2. Verwijder het paraformaldehyde in het putje en was de cel-gelmatrix nog twee keer met D-PBS in de plaat. Laat 0,5 ml D-PBS in elk putje achter voor beeldvorming.
3. Plaats de plaat op de tafel en selecteer de optimale positie door het oculair met behulp van een 0.5x objectief. Beeld het volledige veldbeeld van de cel-gelmatrix in de plaat afzonderlijk met behulp van "automatische belichting" onder het heldere veld.

6. Identificatie van minerale afzetting met een XRF-test

1. Controleer op dag 35 van de kweek of de vloeibare stikstof voldoende is. Start het XRF-systeem. Open de monsterkamer en breng de gels met een pincet met elleboogpunt over van de plaat naar het midden van de monstertrap van het instrument. Sluit de monsterkamer en wacht 30 minuten om het instrument te laten afkoelen voor gebruik.
2. Stel de "Belichtingstijd" in op 35 ms, het "Spectrumbereik" op 0-40 keV en de "Elektrische stroom" op 770 μA voor acquisitie-instellingen.
3. Kies drie tot vijf scanlocaties voor analyse door de monsterfase te verplaatsen.
4. Selecteer de elementen (Ca en P) voor detectie. Start de detectie en exporteer de resultaten.
   OPMERKING: Ca en P zijn de meest voorkomende elementen in hydroxyapatiet.

7. Identificatie van functionele genexpressie

1. Verwijder op dag 1, dag 7, dag 21, dag 28 en dag 35 van de kweek het kweekmedium en was de celgelmatrix twee keer met ijskoude D-PBS in de plaat.
2. Breng de gels met een pincet met elleboogpunt over van de plaat naar een buis van 2,0 ml (afhankelijk van de kweektijd zal de cel-gelmatrix geleidelijk krimpen tot ongeveer 0,1 ml op dag 35). Zorg ervoor dat er één gel in één tube wordt gedaan. Voeg 1 ml fenolchloroform en twee steriele roestvrijstalen klopparels (4 mm, als lyseermatrix) toe aan elk buisje. Plaats de buisjes symmetrisch in de voorgekoelde monstergleuf van de mechanische klophomogenisator.
3. Stel het kloppen in op een frequentie van 55 Hz en een amplitude van 1 cm in elke 1 minuut mechanisch kloppen met een pauze van 10 s, met in totaal zes cycli. Begin met het kloppen van de kralen.
4. Haal het totale RNA uit de cel-gelmatrix met behulp van de fenol-chloroform-isoamylachohol-methode. Omgekeerd transcriberen van 2 μg totaal RNA naar cDNA met willekeurige hexameerprimers.
5. Ontwerp primers gericht op β-actine, Pdpn, Dmp1, Sost en Fgf23 voor real-time PCR (tabel 2). β-Actine is het huishoudgen dat wordt gebruikt voor normalisatie. De genen Pdpn¹⁰ en Dmp1 11 komen voornamelijk tot expressie in pre-osteocyten en gemineraliseerde osteocyten, terwijl Sost¹² en Fgf23 ¹³ voornamelijk tot expressie komen in volwassen osteocyten.
6. Plaats de buis op een thermocycler met het verwarmde deksel ingesteld op 105 °C en voer PCR-amplificatie uit met behulp van de volgende PCR-cyclusinstellingen: 95 °C gedurende 5 s en 60 °C gedurende 30 s gedurende 35 cycli met een eerste denaturatiestap bij 95 °C gedurende 5 minuten en een laatste uitbreidingsstap bij 60 °C gedurende 30 s. Analyseer de vouwveranderingen met de ΔΔCt-methode.

Resultaten

Na het kleuren van levende/dode cellen werden de cellen gevisualiseerd met behulp van een confocale lasermicroscoop. Alle cellen waren calceïne AM-positief (groene kleur) en er waren bijna geen EthD-1-positieve cellen (rode kleur) in het veld, wat aangeeft dat het gelsysteem dat met deze methode wordt gemaakt zeer geschikt is voor osteocytogenese (Figuur 1A, links). Om de ruimtelijke verdeling van de cellen beter te kunnen bepalen, werd gekozen voor een pseudokleurenafbeelding om de celdendr...

Discussie

Een kritiek punt in dit protocol is dat stap 1 en stap 2 op ijs moeten worden uitgevoerd om spontane stolling te voorkomen. Bij deze methode was de uiteindelijke concentratie collageen I 1,2 mg/ml. Er moet dus een optimaal ddH₂O-volume worden berekend om overeen te komen met de verschillende collagenen van verschillende fabrikanten.

In vivo omvat osteocytogenese een polaire beweging van osteoblasten van het oppervlak naar het binnenste van trabeculair bot^1...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0,25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7,5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422