Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Magnetische resonantie-geleide hoge intensiteit gerichte echografie gegenereerde hyperthermie: een haalbare behandelingsmethode in een Murine Rhabdomyosarcoom-model

2.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64544

⸱

13 januari 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children, 4Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 5Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 6Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary, 7Department of Radiation Oncology, University of Toronto, 8Department of Medical Imaging, University of Toronto, 9Department of Pediatric Surgery, University of Toronto, 10Department of Surgery, University of Toronto

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Hier wordt een protocol gepresenteerd om gecontroleerde hyperthermie te gebruiken, gegenereerd door magnetische resonantiegeleide hoge intensiteit gerichte echografie, om medicijnafgifte te activeren van temperatuurgevoelige liposomen in een rhabdomyosarcoommuismodel.

Samenvatting

Magnetische resonantiegeleide high intensity focused ultrasound (MRgHIFU) is een gevestigde methode voor het produceren van gelokaliseerde hyperthermie. Gezien de real-time beeldvorming en akoestische energiemodulatie maakt deze modaliteit een nauwkeurige temperatuurregeling binnen een bepaald gebied mogelijk. Veel thermische toepassingen worden onderzocht met deze niet-invasieve, niet-ioniserende technologie, zoals hyperthermiegeneratie, om geneesmiddelen vrij te maken van thermogevoelige liposomale dragers. Deze geneesmiddelen kunnen chemotherapieën zoals doxorubicine omvatten, waarvoor gerichte afgifte gewenst is vanwege de dosisbeperkende systemische bijwerkingen, namelijk cardiotoxiciteit. Doxorubicine is een steunpilaar voor de behandeling van een verscheidenheid aan kwaadaardige tumoren en wordt vaak gebruikt bij recidiverende of terugkerende rhabdomyosarcoom (RMS). RMS is de meest voorkomende vaste weke delen extracraniële tumor bij kinderen en jonge volwassenen. Ondanks agressieve, multimodale therapie zijn de overlevingskansen van RMS de afgelopen 30 jaar hetzelfde gebleven. Om een oplossing te onderzoeken voor het aanpakken van deze onvervulde behoefte, werd een experimenteel protocol ontwikkeld om de afgifte van thermosensitieve liposomale doxorubicine (TLD) in een immunocompetent, syngenetisch RMS-muismodel te evalueren met MRgHIFU als de bron van hyperthermie voor medicijnafgifte.

Inleiding

Rhabdomyosarcoom (RMS) is een skeletspiertumor die het meest voorkomt bij kinderen en jonge volwassenen1. Gelokaliseerde ziekte wordt vaak behandeld met multimodale behandeling, waaronder chemotherapie, ioniserende straling en chirurgie. Het gebruik van multi-drug chemotherapieregimes komt vaker voor bij pediatrische patiënten, met verbeterde resultaten in vergelijking met hun volwassen tegenhangers2; Ondanks lopende onderzoeksinspanningen blijft de 5-jaarsoverleving echter ongeveer 30% in de meest agressieve vorm van de ziekte 3,4. De chemotherapie standaard van zorg is een multidrug regime dat vincristine, cyclofosfamide en actinomycine D omvat. In gevallen van recidiverende of terugkerende ziekte worden alternatieve chemotherapieën gebruikt, waaronder standaard (vrij) doxorubicine (FD) en ifosfamide1. Hoewel al deze chemotherapieën systemische toxiciteiten hebben, legt de cardiotoxiciteit van doxorubicine een levenslange dosisbeperkingop 5-7. Om de hoeveelheid van het geneesmiddel dat aan de tumor wordt afgegeven te verhogen en systemische toxiciteit te minimaliseren, zijn alternatieve formuleringen ontwikkeld, waaronder liposomale inkapseling. Dit kunnen niet-thermosensitieve doxorubicine zijn, die is goedgekeurd voor de behandeling van borstkanker en hepatocellulair carcinoom, of thermosensitief doxorubicine, waarvoor klinische onderzoeken lopen 8,9,10,11,12,13. Alternatieve methoden voor het leveren van liposomaal ingekapselde geneesmiddelen zoals multi-vesiculaire liposomen en ligand-gerichte liposomen zijn geëvalueerd en zijn veelbelovend voor de behandeling van tumoren9. In deze studie heeft de toevoeging van warmte multifactoriële effecten, waaronder medicijnafgifte14. De combinatie van hyperthermie (HT) gegenereerd met magnetische resonantiegeleide high intensity focused ultrasound (MRgHIFU) en thermosensitieve liposomale doxorubicine (TLD) is een nieuwe multimodale therapeutische benadering voor het gebruik van dit toxische maar effectieve medicijn om RMS te behandelen, terwijl dosisbeperkende toxiciteit wordt geminimaliseerd en mogelijk de immuunrespons op de tumor wordt verhoogd.

Doxorubicine komt snel vrij uit TLD bij temperaturen >39 °C, ruim boven de gemiddelde menselijke lichaamstemperatuur van 37 °C, maar niet hoog genoeg om weefselschade of ablatie te veroorzaken; dit begint te gebeuren bij 43 °C, maar treedt sneller op naarmate de temperatuur de 60 °C15 nadert. Verschillende methoden zijn gebruikt om HT in vivo te genereren, waaronder lasers, microgolven, radiofrequente ablatie en gerichte echografie, waarvan vele invasieve verwarmingsmethoden zijn16. MRgHIFU is een niet-invasieve, niet-ioniserende verwarmingsmethode die nauwkeurige temperatuurinstellingen in het doelweefsel in situ mogelijk maakt. Magnetische resonantie (MR) beeldvorming biedt cruciaal real-time beeldvorming, waarbij computersoftware kan worden gebruikt, om een thermometriemeting van het weefsel tijdens de behandeling te berekenen; Vervolgens kunnen deze gegevens worden gebruikt om de ultrasone therapie in realtime te regelen om een gewenst temperatuurinstelpunt17 te bereiken en te behouden. MRgHIFU is getest in verschillende weefseltypen en kan worden gebruikt voor een breed scala aan temperatuurbehandelingen, van milde HT tot ablatie, maar ook klinisch om pijnlijke botmetastasen met succes te behandelen18. Bovendien is aangetoond dat HT tumorcytotoxiciteit veroorzaakt, eiwitexpressie moduleert en de immuunrespons in de tumormicro-omgeving verandert 19,20,21,22. Eén studie combineerde milde HT met TLD, gevolgd door ablatie met MRgHIFU, in een synergetisch R1-rattenmodel23, resulterend in necrose in de tumorkern en medicijnafgifte aan de periferie. Traditioneel wordt radiotherapie gebruikt als een aanvullende therapie om tumorcellen te beschadigen en de terugkeer van lokale ziekten te verminderen. Het gebruik ervan wordt echter beperkt door levenslange dosering en off-target schade1. HT is dus uniek omdat het enkele van dezelfde effecten kan veroorzaken zonder dezelfde toxiciteiten of beperkingen.

Preklinische diermodellen voor RMS omvatten syngene, immunocompetente modellen en patiënt-afgeleide xenografts (PDX) in immuungecompromitteerde gastheren. Hoewel de immuungecompromitteerde modellen de groei van de menselijke tumoren mogelijk maken, missen ze de juiste tumormicro-omgeving en zijn ze beperkt in hun vermogen om immuunrespons te bestuderen24. FGFR4-activerende mutatie is een veelbelovende marker voor slechte prognose en een potentieel therapeutisch doelwit bij volwassen en pediatrische RMS 1,25. In de syngenetische RMS-modellen die in het Gladdy-lab zijn ontwikkeld, kunnen de tumoren groeien in een immunocompetente gastheer, die aangeboren en adaptieve immuunresponsen op de tumorontwikkelt 26. Omdat HT de immuunrespons beïnvloedt, is observatie van de verandering in de muizenimmuunrespons een waardevol voordeel van dit tumormodel. Om zowel de tumorrespons op TLD in vergelijking met FD te testen, als de verandering in de immuunrespons van de tumor op zowel chemotherapie als HT, werd een protocol ontwikkeld en gebruikt om syngenetische murine RMS-tumoren in vivo te behandelen met behulp van MRgHIFU en TLD, wat de focus van deze studie is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de dierverzorgingscommissies met goedgekeurde diergebruiksprotocollen onder toezicht van een toezichthoudende dierenarts bij de dieronderzoeksfaciliteiten van het Centre for Phenogenomics (TCP) en het University Health Network (UHN) Animal Resource Centre (ARC). Alle procedures, met uitzondering van de MRgHIFU, waarbij de dieren betrokken waren, werden uitgevoerd in een biologisch veiligheidskabinet (BSC) om de blootstelling van dieren aan externe lucht of vatbare infectie te minimaliseren.

1. Muizen fokken

OPMERKING: In totaal werden 65 muizen (stam B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J) opgenomen in de pilotstudie (mannetje: n = 23; vrouw: n = 42). Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen werden gebruikt op de leeftijd van 7-9 weken. Hun pups werden gespeend en gegenotypeerd, en de p53 heterozygote muizen werden gebruikt voor de experimenten.

  1. Huis twee vrouwelijke muizen met elke mannelijke muis om fokkooien te maken. Tel de leeftijden van hun pups vanaf de geboorte (geboorte = dag 0).
  2. Identificeer op dag 10 de pups met een oorinkeping. Verzamel staartsnippers voor genotypering voorafgaand aan cellijninjectie.

2. Genotypering van de muis

  1. Extraheer DNA uit de verzamelde 2 mm staartknipsels met behulp van een commerciële DNA-extractiekit (zie materiaaltabel), volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Bepaal de DNA-concentratie en -zuiverheid door de absorptie bij 260-280 nm te meten op een spectrofotometer (zie materiaaltabel).
  3. Voer polymerasekettingreactie (PCR) uit.
    1. Maak een hoofdmix met een commerciële PCR-mix (met Taq-polymerase, dNTPS en MgCl 2; zie Materiaaltabel), primer en dH2O in een verhouding van 12,5:0,25:10,75 (μL) voor het vereiste aantal monsters. Voeg 1 μL DNA-monster toe aan elke PCR-buis en voeg dH2O, een nulmonster (homozygoot voor p53-mutatie), een heterozygoot monster (heterozygoot voor p53-mutatie) en een wildtype (homozygoot voor normaal p53) monster toe als PCR-controles.
    2. Voeg 24 μL van het hoofdmengsel toe aan elke PCR-buis die DNA bevat. Pipetteer de oplossing in elke PCR-buis op en neer om het DNA door de hoofdmix te verdelen.
    3. Plaats de reactiebuizen in een thermische cycler en cyclus volgens de volgende specificaties: 95 °C gedurende 2 minuten, 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 15 s en 72 °C gedurende 1 minuut, en houd vervolgens op 4 °C totdat u klaar bent om op de gel te analyseren.
  4. Analyseer de PCR-producten met behulp van agarose-gel-elektroforese.
    1. Bereid een 2% gel (50 ml 1x TAE en 1 g agarose) door de agarose in de TAE te verhitten en te mengen tot het is opgelost. Voeg bij afkoeling en nog steeds vloeibaar 2,5 μL DNA-gelkleuring toe aan de agarose en meng. Giet de gel in een geldoos met een kam. Plaats de gel in het elektroforetische apparaat (zie materiaaltabel) en dek af met 1x TAE.
    2. Laad 10 μL van 1 kB DNA Ladder op de gel. Laad 12,5 μL van elk monster. Laat de gel 25 minuten lopen op 135 V.
    3. Maak een afbeelding van de gel met behulp van de juiste instellingen voor de gebruikte DNA-gelvlek op een gel-imager (zie Materiaaltabel), volgens de instructies van de fabrikant.

3. Voorbereiding van het tumormodel (figuur 1)

  1. Kweek de M25FV24C cellijn (passage 12-15) 1 week voor de injectiedatum in volledige groeimedia (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] met additieven: 10% FBS, 1% Penicilline/Streptomycine en 2 mM L-alanyl-L-glutaminedipeptide) in een kolf van 75 ml, bij 37 °C en 5% CO2. Zodra de cellen ~ 80% confluent zijn, zuigt u de media op en wast u de cellen 1x met 5 ml Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS).
    OPMERKING: M25FV24C is een muizencellijn die is ontworpen om mutant FGFR4V550E tot overexpressie te brengen, die wordt waargenomen in pediatrische en volwassen RMS 1,26.
  2. Til de cellen op door 0,5 ml 0,25% trypsine-oplossing aan de zijkant van de plaat toe te voegen en het vat gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Zodra de cellen losgemaakt lijken, voegt u 2,5 ml volledige groeimedia bij kamertemperatuur toe om de trypsine te inactiveren. Gebruik een monster van 10 μL om de celconcentratie van levensvatbare cellen te bepalen met behulp van een hemocytometer en trypan blauwe uitsluiting.
  3. Bereid het juiste volume DPBS-gesuspendeerde cellen voor injectie voor en plaats het in een microcentrifugebuis van 1,5 ml: volume om te centrifugeren = (aantal muizen × aantal cellen per muis)/ (concentratie van cellen), waarbij het aantal muizen = de muizen die moeten worden geïnjecteerd + 10 extra muizen voor fouten, en het aantal cellen per muis = 104.
  4. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 153 x g. Resuspendeer de celpellet in het juiste volume (10 μL per muis × aantal muizen) myo-injectiebuffer (F10 media + 0,5% FBS) en injecteer de muizen binnen 1 uur na bereiding van deze suspensie.

4. Intramusculaire celinjectie

OPMERKING: M25FV24C-cellen worden geïnjecteerd in de rechter achterpoot van muizen tussen 4 en 6 weken oud. Injectie na 4 weken produceert een kleine muis met een tumor die moeilijker te behandelen kan zijn omdat er minder omringend weefsel is voor HT-dispersie; Wachten tot 6 weken levert een grotere muis op, waardoor het gemakkelijker wordt om de tumor te behandelen.

  1. Keer de celsuspensie meerdere keren om voorafgaand aan de aspiratie om de cellen gelijkmatig in de oplossing te verdelen. Zuig 10 μL (104 cellen) op met een spuit van microliter (zie materiaaltabel). Kraag de muis; Eenmaal in bedwang gehouden, kan toegang tot de caudale dijspieren worden verkregen door het achterbeen te strekken. Scheer het been met een tondeuse en veeg af met 70% ethanol.
  2. Injecteer de M25FV24C celsuspensie (10 μL, 10 4 cellen) in de rechter achterste ledematen dijbeenmusculatuur van een4-6 weken oude muis met behulp van een gasdichte microliterspuit met een 26s G naald.
    OPMERKING: De naald moet parallel aan het dijbeen in de richting van de knie worden ingebracht, waarbij ervoor moet worden gezorgd dat de heupzenuw niet wordt geraakt. Plaats alleen de punt van de naald (ongeveer 2 mm) vanwege de kleine spiermassa van de achterpoot.
  3. Dien de oplossing in een gestage beweging toe. Verwijder de naald en zorg ervoor dat er geen bloeding optreedt. Breng de muis terug naar een tweede kooi.
  4. Evalueer de dieren dagelijks en controleer hun achterpoten op tumorgroei door palpatie. Euthanaseer de muizen met behulp van koolstofdioxide als een van de volgende vroege eindpunten wordt aangetroffen: tumorgrootte met een diameter van meer dan 1,5 cm, tumorzweren of systemische tekenen van ziekte (piloerection, gebogen houding, inactiviteit of verminderde inname van voedsel of water).

5. Screening MRI-scan

  1. Verdoof de muis, tot een niveau waar er geen beweging is met pootknijpen, met isofluraan onder de volgende parameters: induceer in een kamer met 4% bij 1,5 LPM, breng vervolgens over naar de neuskegel op de MRI-scannerslee en ga door met isofluraanonderhoud op de neuskegel met 1,5% -2% bij 0,75 LPM. Bevestig de ademhalingsmonitor. Gebruik veterinaire zalf op de ogen om uitdroging te voorkomen terwijl u onder narcose bent.
  2. Stel de verdoofde muis voor met behulp van de MRI-scanner (zie Materiaaltabel). Noteer op de T2-gewogen afbeelding (Ax_Screen acquisitie, tabel 1) de afmetingen in het vlak en het aantal axiale segmenten waarin de tumor verschijnt. Let op de locatie van de tumor met betrekking tot het dijbeen en het laterale oppervlak van de dij, waar de ultrasone golf zou binnenkomen.
    OPMERKING: De tumor verschijnt als een hyperintense massa in de spier die asymmetrisch is van de andere kant. Een goede starttumorgrootte voor meerdere behandelingen is 2 mm x 2 mm x 2 mm voor acute of overlevingsstudies. Als het veel groter is, zal het alleen goed zijn voor acute studies, omdat de tumor een eindpunt van grootte zal bereiken voordat drie wekelijkse behandelingen worden voltooid. Uitsluitingscriteria voor HIFU-behandeling zijn onder meer: gewikkeld rond het dijbeen, te dicht bij het dijbeen, te achterste op de muis, mediaal bij het dijbeen, te dicht bij het rectum.
  3. Verwijder de muis uit de scanner en zorg voor een basislijngewicht. Scheer de muis van hun middenlichaam tot aan hun voeten onder narcose met een elektrisch scheerapparaat.
    OPMERKING: Idealiter wordt het scheren 1 dag voorafgaand aan de behandeling gedaan, omdat het de muis in staat stelt om verzorging uit te voeren, waardoor de ontharingscrème efficiënter kan werken.
  4. Herstel de muis in de BSC, met behulp van een verwarmingspad onder het ene uiteinde van de kooi. Breng de muis terug naar zijn kooi wanneer hij de sternale lighouding terugkrijgt.

6. Experiment: HIFU-behandelingsdag diervoorbereiding

  1. Om het HIFU-systeem met kleine boring (zie Materiaaltabel) voor te bereiden, zet u de generator aan en vult u de transducer met voldoende gedeïoniseerd water totdat het membraan onder de transducer is uitgebreid, maar niet zo stevig dat het de muis zou comprimeren. Ontgast het water in het transducercircuit gedurende 30 minuten om opgeloste zuurstof uit het medium te verwijderen.
  2. Bereid het bijbehorende computersysteem voor.
    1. Schakel de besturingscomputer in en zorg ervoor dat deze via ethernet is aangesloten op de HIFU-generator en via USB op het display van de thermische sonde. Start de software en klik op Home om de transducer te starten voordat u de muis plaatst.
    2. Kalibreer de fiberoptische thermische sondes: haal de basistemperatuur in de kamer op en noteer de temperatuurverandering in de MRI-kamer. Let op de grootte van de temperatuurdrift voor elke sonde als gevolg van de magnetische veldsterkte. Plaats de temperatuurvoeler van de driftbuis in een met gadolinium gevulde glazen buis voor temperatuurkalibratie tijdens het scannen en zet de driftbuis vast met tape.
      OPMERKING: De basislijntemperatuur bij kamertemperatuur (driftbuis) wordt handmatig toegevoegd als thermometrieparameter in de GUI in de software. Een interessegebied (ROI) wordt ingesteld in de driftbuis in het MR-beeld om elke temperatuurafwijking te detecteren en corrigeert automatisch de thermometriebeelden.
    3. Zuig het te injecteren geneesmiddel op in een spuit van 1 ml en plaats het in de pomp voor automatische toediening (zie materiaaltabel). Bereid de lijn voor die verbinding maakt met de staartaderkatheter van de muis totdat het medicijn de lijn volledig heeft gevuld door op de handmatige afgifteknop op de automatische toedieningspomp te drukken.
    4. Gebruik een warmtelamp om de muizen in de kooien gedurende ~ 20 minuten te verwarmen voordat ze naar de anesthesiekamer worden overgebracht.
      OPMERKING: Voorverwarmen bevordert vaatverwijding, die zal optreden zodra de muis wordt verdoofd en helpt bij het plaatsen van de katheter.
  3. Verdoof de muis met isofluraan (inductie: 4% bij 1,5 LPM; onderhoud: 1,5%-2% bij 0,75 LPM) en breng over naar een neuskegel. Breng een cornea-glijmiddel aan op de ogen om schade te voorkomen als gevolg van het ontbreken van knipperreflex onder anesthesie.
  4. Breng ontharingscrème aan op het geschoren gebied, inclusief de gehele rechterachterpoot, en volg de instructies van de fabrikant voor ontharing.
    OPMERKING: Plaats de muis onder een warmtelamp terwijl u in de BSC bent om te helpen met thermoregulatie tijdens ontharing onder anesthesie.
  5. Na het afwassen van de ontharingscrème met warm water, weegt u de muis op een digitale weegschaal en registreert u de dosering van het medicijn.
  6. Beweeg de muis naar een MRI-compatibele neuskegel op de MRI-slee. Plaats een warmtelamp op de muis om deze warm te houden terwijl u zich voorbereidt op de MRI. Plaats de muis in de laterale decubituspositie met de niet-tumordragende kant naar beneden en de tumor superieur in een 3D-geprinte muishouder op de slee (aanvullende figuur 1 en figuur 2). Zorg voor een juiste positionering van de tumor (d.w.z. in het midden van de spoel horizontaal en verticaal, met de hoogte net boven de randen van de muishouder om rekening te houden met compressie door de ultrasone transducer).
    OPMERKING: Snijd indien nodig een gecomprimeerd ultrasoon gelpadsegment om onder de muis te plaatsen, langs de onderkant van de houder, met een dikte om de tumor naar de bovenkant van de houder te egaliseren.
  7. Stop het niet-betrokken been weg van het tumorbeen, hetzij onder de muis of uitgestrekt met het tumorbeen gebogen. Zorg ervoor dat de voeten zich niet in het nabije veld of het verre veld van de tumor en het ultrasone straalpad bevinden. Plaats de warmtelamp op 15 cm van de staart om op te warmen voor het inbrengen van de katheter in de staartader.
  8. Plaats de slokdarmtemperatuursonde.
    1. Rijg de slokdarmsonde door de neuskegel en krab de nek van de muis. Kantel de neus van de muis omhoog om een lijn van zijn mond rechtstreeks naar zijn maag te maken door het hoofd uit te strekken. Schuif de thermische sonde ongeveer 0,5 cm boven de tong in de slokdarm van de muis en vervang de neuskegel rond de neus van de muis. Bevestig de slokdarmsonde en neuskegel aan de bovenkant van de slee.
      OPMERKING: Controleer op tekenen van ademnood onmiddellijk na het inbrengen, omdat het onjuist in de luchtpijp kan worden ingebracht.
  9. Plaats de rectale temperatuursonde.
    OPMERKING: De rectale en slokdarmtemperatuurvoelers moeten zich binnen 3 °C van elkaar bevinden.
  10. Plaats de ademhalingsmonitor met de aansluitkabel in de richting van de kop van de muis, zodat deze de plaatsing van de ultrasone transducer niet verstoort. Vastzetten met tape.
  11. Plaats een 27 G vlindernaaldstaartkatheter in een laterale staartader die is bevestigd aan microtubing met 20 μL dode ruimte en tape stevig. Zorg er na het tapen voor dat de katheter nog goed spoelt.
  12. Gebruik twee personen om de voorbereide muis, muizenslee, anesthesielijn, ademhalingslijn, staartaderkatheter en thermische sondekoorden in de MRI-scanner te dragen en in de MRI-sledehouder te plaatsen.
  13. Laat de operator van de HIFU-software (zie materiaaltabel) de meniscus van de transducer direct over de tumor bewegen door visuele inspectie voor een eerste uitlijning27. Breng oogglijmiddel of ontgaste ultrasone gel aan op de haarloze huid boven de tumor en koppel de HIFU-transducer aan het tumorgebied.
  14. Sluit de medicijnafgifteleiding van de automatische pomp aan op de staartaderkatheter. Bereken de hoeveelheid dode ruimte in de staartaderlijn en de verbindingslijn. Schuif de HIFU-slee van de muis op MRI-rails in het midden van de MRI.
  15. Stel de hoeveelheid geneesmiddelinfusie op de pomp in, afhankelijk van het type geneesmiddel en de concentratie en het gewicht van het dier, en voeg de hoeveelheid dode ruimte toe. Stel de pomp in op een infusiesnelheid van 200 μl/min.
    OPMERKING: In deze studie werden FD en TLD gebruikt in een concentratie van 2 mg/ml en een dosis van 5 mg/kg lichaamsgewicht.
  16. Noteer de basistemperatuur van de thermische sonde.
  17. Plaats de luchtconvectieverwarming (zie materiaaltabel) op de warmste stand. Richt de buis die lucht blaast naar de muis in het midden van de MRI-boring en zet vast met tape. Het verwarmingsapparaat wordt later op de laagste stand (32 °C) gezet om oververhitting van de muis tijdens ultrasoonapparaat te voorkomen.
  18. Verkrijg de enquête-MR-afbeeldingen (Ax_Loc, Sag_Loc; Tabel 1) om de tumorlocatie te bepalen voor ultrasoonapparaattargeting inclusief diepte. Pas de positie van de transducer dienovereenkomstig aan met behulp van de HIFU-software door de gewenste bewegingsafstand in te voegen zoals gemeten op de afbeelding en vervolgens op de pijlrichting te klikken om te bewegen (figuur 3A). Let ook op de locatie van de driftbuis. Herhaal indien nodig.
  19. Bepaal de locatie van de brandpuntspunt van de transducer in het coronale vlak door een korte 5 s x 50 mV amplitude continue 'testshot'-ultrasoonapparaat uit te voeren tijdens de Test_Shot thermometrie-acquisitie (tabel 1).
  20. Stem de MR-enquêtebeelden af op de coronale weergave van de brandpuntsplek in de HIFU-software. Bekijk de afbeeldingen op tumorlocatie, ten opzichte van de benige structuur en het rectum, en pas de positionering van de transducer aan als dat nodig wordt geacht.
  21. Herhaal de ultrasoonapparaat van de testopname tijdens thermbeeldvorming met negen herhalingen (tabel 1) om te bevestigen of er een gelijkmatige en nauwkeurige verwarming in het tumorvolume is met minimale off-target verwarming. Pas de locatie van de slice, de locatie van de transducer en de stuurdiepte aan en bevestig de verwarmingsprestaties met herhaalde "testopnamen" als dat nodig wordt geacht.
  22. Met behulp van de HIFU-behandelingsbewakingssoftware definieert u de ROI voor thermometriebewaking binnen het uiteindelijke verwarmingsprofiel door de te verplaatsen afstand te meten en vervolgens de rastercoördinaten in het programma te wijzigen. Stel een ROI in rond de driftbuis voor driftcorrectie. Voer de basistemperatuur in op basis van de rectale sondetemperatuur voor thermometriemetingen. Het HIFU-systeem wordt gebruikt om HIFU-behandelingssonificatie te initiëren en voor thermometriebewaking.
  23. Open de 20 minuten durende hyperthermiebehandelingsspecificaties in de software en start de ultrasoonapparaat zodra de referentie-MR-beelden zijn verzameld en de thermometrie begint.
  24. Voer een behandeling van 20 minuten uit (figuur 3B) tijdens thermbeeldvorming (tabel 1) met behulp van de ingebouwde pid-controllersoftware (proportional-integrative-derivative). Injecteer het geselecteerde medicijn na 1,5 minuut, nadat de temperatuur in de ROI is opgewarmd tot de gewenste temperatuur (40 °C).
  25. Controleer de kerntemperatuur tijdens de behandeling. Als de rectale temperatuur tijdens de behandeling snel toeneemt, kan herpositionering van de muis nodig zijn om rectale opwarming gedurende de behandelingsduur van 10 of 20 minuten te voorkomen. Stop de behandeling als de rectale temperatuur stijgt tot >40 °C.

7. Experiment: Beeldvorming van muismodellen en ultrasoonapparaatprocedure voor acute studies

  1. Na voltooiing van de behandeling verwijdert u de muis uit de MRI-boring en zorgt u voor hemostase op de plaats van het inbrengen van de staartaderkatheter. Breng de muis over naar de BSC en plaats deze op de neuskegel voor verdere anesthesie.
  2. Plaats de muis op zijn rug op een blauw absorberend kussen met zijn ledematen in bedwang en het hart bloot.
  3. Euthanaseer de muizen door exsanguinatie via hartpunctie gevolgd door verwijdering van het hart. Neem het bloed onmiddellijk en centrifugeer voor plasmascheiding bij 10,621 x g gedurende 10 minuten.
  4. Voer obductie uit en bewaar de organen zoals vereist voor analyse. Bevries de organen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C gedurende enkele maanden of langdurig in een tank met vloeibare stikstof.
  5. Mechanisch homogeniseren van het tumorweefsel door een negenvoudige overmaat (w / w) van gedeïoniseerd water toe te voegen en het weefsel af te breken met behulp van een parelkloppende homogenisator. Extraheer doxorubicine uit 600 μL gehomogeniseerd weefsel door achtereenvolgens 75 μL 300 mg/ml zilvernitraat, 75 μL 10 mM zwavelzuur en 2,5 ml 1:1 isopropanol:chloroform toe te voegen. Vortex gedurende 20 minuten en 's nachts bewaren bij −20 °C.
  6. Om monsters voor te bereiden voor high performance vloeistofchromatografie (HPLC), centrifugeert u de oplossing uit stap 7.5 bij 4.500 x g, verwijdert u de organische oplosmiddellaag en droogt u de isopropanol:chloroform onder een stroom stikstofgas. Resuspendie in 100 μL van 2:1 MeOH:H2O. Meet de doxorubicineconcentratie met HPLC-MS/MS28.

8. Experiment: Beeldvorming van muismodellen en ultrasoonapparaatprocedure voor overlevingsstudies

OPMERKING: Volg voor overlevingsstudies de HIFU-behandelingsdag voor de voorbereiding van dieren (stap 6.1 tot 6.25).

  1. Na voltooiing van de behandeling plaatst u de muis onder een warmtelamp om hem te laten herstellen en controleert u de ademhaling en beweging totdat hij de sternale lighouding terugkrijgt. Breng het dier vervolgens terug naar zijn kooi.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de helft van de kooi in lijn is met een warmtelamp, omdat de thermische regulatie van de dieren wordt beïnvloed door de anesthesie en HT-behandeling.
  2. Controleer de muizen dagelijks op gedrag, voedingspatronen en ademhalingsfrequentie voor tekenen van nood.
  3. Voer eenmaal per week behandelingen uit volgens de stappen 6.1 tot 6.25 gedurende 3 opeenvolgende weken.
  4. Voer tweemaal per week MRI-beeldvorming van de muizen uit voor tumormeting. Voer gedurende de weken tijdens de behandeling elke week één MRI-scan en één echo uit. Nadat de behandeling is voltooid, voert u tweewekelijkse echografie uit.
  5. Euthanaseer de muis 60 dagen na het voltooien van de reeks behandelingen, of wanneer een humaan eindpunt is bereikt (tumorgrootte >1,5 cm3 of morbiditeit van de tumor), gevolgd door obductie met tumor- en orgaanverwijdering voor analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van het MRgHIFU-gegenereerde hyperthermieprotocol konden de tumoren in de achterpoot consistent worden verwarmd tot de gewenste ingestelde temperatuur voor de duur van de behandeling (figuur 4 toont een representatieve behandeling, 10 of 20 min, n = 65). Om een behandeling als succesvol te beschouwen, moest de ROI gedurende de gehele behandeling boven 39 °C worden gehouden, met <6 °C-variatie gedurende de behandeling en zonder verhitting van off-target weefsel. Bovendien moest de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hierin ontwikkelde protocol werd gebruikt om achterpoottumoren aan te pakken met behulp van MRgHIFU voor milde HT-behandeling en ingekapselde geneesmiddelen uit liposomen in vivo vrij te geven. Tijdens de pilotstudie werden verschillende kritieke stappen in dit protocol aangetroffen en het optimaliseren van deze kritieke stappen was verantwoordelijk voor het verbeterde behandelingssucces ten opzichte van de pilotstudie. De eerste is de volledige verwijdering van het haar op het te soniceren gebied. Elke gasv...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen financiële belangen of belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

We willen graag onze financieringsbronnen voor dit project en het betrokken personeel erkennen, waaronder: C17 Research Grant, Canada Graduate Scholarship, Ontario Student Opportunity Trust Fund en James J. Hammond Fund.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5mL Eppendorf tubesEppendorf22363204
1kb plus DNA LadderFroggabioDM015-R500
2x HS-Red Taq (PCR mix)Wisent801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpecBrukerT18493170/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany
C1000 Thermal cyclerBiorad1851148
ClippersWhal Peanut8655
Compressed ultrasound gelAquaflexHF54-004
Convection heating device3M Bair Hugger70200791401
Depiliatory creamNair61700222611Shopper's Drug Mart
DMEMWisent219-065-LK
DNeasy extraction kitQiagen 69504
DPBSWisent311-420-CL
Drug injection systemHarvard ApparatusPY2 70-2131PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump
Eye lubricantOptixcare50-218-8442
F10 MediaWisent318-050-CL
FBSWisent081-105
FroggaroseFroggaBioA87
Gel Molecular ImagerBioRadGelDocXR
GlutamaxWisent609-065-EL
Heat LampMorganville ScientificHL0100 Similar to this product
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G)SAI infusionPE-20-100
IsofluraneSigma792632
M25FV24C Cell lineGladdy LabN/A
Microliter SyringeHamilton01-01-7648
Molecular Imager Gel Doc XRBiorad170-8170
Mouse holderThe 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine N/ADimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm. 
MyRun MachineCosmo Bio Co LtdCBJ-IMR-001-EX
Nanodrop 8000 SpectrophotometerThermo ScientificND-8000-GL
p53 primersEurofinsN/ACustom Primers
PCR tubesDiamedSSI3131-06
Penicillin/StreptomycinWisent450-200-EL
Proteus software Pichardo labN/A
Respiratory monitoring systemSAIIModel 1030MR-compatible monitoring and gating system for small animals
Small Bore HIFU device, LabFUSImage Guided TherapyN/ALabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8
frequency 2.5 MHz
diameter  25 mm
radius of curvature 20 mm
Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm

Motor: axes 2

Generator:
Number of channels 8
Maximum electrical power/channel Wel 4
Maximum electrical power Wel 32
Bandwidth 0.5 - 5 MHz
Control per channel: Freq., Phase and. amplitude
Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta)
Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min.

Transducer:
Number of elements 8
frequency  2.5 MHz
diameter 25 mm
radius of curvature 20 mm
Focal spot size  0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm
SYBR SafeThermoFisher ScientificS33102
TAEWisent811-540-FL
Tail vein catheter (27G 0.5" )Terumo Medical Corp15253
Thermal probesRugged MonitoringL201-08
Trypan blueThermoFisher Scientific15250061
TrypsinWisent325-052-EL
Ultrasound GelAquasonicPLI 01-08

Referenties

  1. Skapek, S. X., et al. Rhabdomyosarcoma. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), (2019).
  2. Ferrari, A., et al. Impact of rhabdomyosarcoma treatment modalities by age in a population-based setting. Journal of Adolescent and Young Adult Oncology. 10 (3), 309-315 (2021).
  3. Dasgupta, R. Pediatric rhabdomyosarcoma surgery: Background, anatomy, pathophysiology. , Available from: https://emedicine.medscape.com/article/939156-overview#a2 (2019).
  4. Ognjanovic, S., Linabery, A. M., Charbonneau, B., Ross, J. A. Trends in childhood rhabdomyosarcoma incidence and survival in the United States, 1975-2005. Cancer. 115 (18), 4218-4226 (2009).
  5. Mulrooney, D. A., et al. Cardiac outcomes in a cohort of adult survivors of childhood and adolescent cancer: retrospective analysis of the Childhood Cancer Survivor Study cohort. BMJ. 339, (2009).
  6. Lipshultz, S. E., Cochran, T. R., Franco, V. I., Miller, T. L. Treatment-related cardiotoxicity in survivors of childhood cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (12), 697-710 (2013).
  7. Winter, S., Fasola, S., Brisse, H., Mosseri, V., Orbach, D. Relapse after localized rhabdomyosarcoma: Evaluation of the efficacy of second-line chemotherapy. Pediatric Blood & Cancer. 62 (11), 1935-1941 (2015).
  8. Wood, B. J., et al. Phase I study of heat-deployed liposomal doxorubicin during radiofrequency ablation for hepatic malignancies. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23 (2), 248-255 (2012).
  9. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal formulations in clinical use: an updated review. Pharmaceutics. 9 (2), 12(2017).
  10. Zagar, T. M., et al. Two phase I dose-escalation/pharmacokinetics studies of low temperature liposomal doxorubicin (LTLD) and mild local hyperthermia in heavily pretreated patients with local regionally recurrent breast cancer. International Journal of Hyperthermia. 30 (5), 285-294 (2014).
  11. Kim, A. A phase I study of lyso-thermosensitive liposomal doxorubicin and MR-HIFU for pediatric refractory solid tumors. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02536183 (2019).
  12. PanDox: targeted doxorubicin in pancreatic tumours (PanDox). University of Oxford. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04852367 (2021).
  13. Suelmann, B. B. M. Image-guided targeted doxorubicin delivery with hyperthermia to optimize loco-regional control in breast cancer (i-GO). , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03749850 (2018).
  14. De Vita, A., et al. Lysyl oxidase engineered lipid nanovesicles for the treatment of triple negative breast cancer. Scientific Reports. 11 (1), 5107(2021).
  15. Sapareto, S. A., Dewey, W. C. Thermal dose determination in cancer therapy. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 10 (6), 787-800 (1984).
  16. Kok, H. P., et al. Heating technology for malignant tumors: a review. International Journal of Hyperthermia. 37 (1), 711-741 (2020).
  17. Kokuryo, D., Kumamoto, E., Kuroda, K. Recent technological advancements in thermometry. Advanced Drug Delivery Reviews. 163, 19-39 (2020).
  18. Bongiovanni, A., et al. 3-T magnetic resonance-guided high-intensity focused ultrasound (3 T-MR-HIFU) for the treatment of pain from bone metastases of solid tumors. Support Care Cancer. 30 (7), 5737-5745 (2022).
  19. Seifert, G., et al. Regional hyperthermia combined with chemotherapy in paediatric, adolescent and young adult patients: current and future perspectives. Radiation Oncology. 11, 65(2016).
  20. Dewhirst, M. W., Lee, C. -T., Ashcraft, K. A. The future of biology in driving the field of hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 32 (1), 4-13 (2016).
  21. Dewhirst, M. W., Vujaskovic, Z., Jones, E., Thrall, D. Re-setting the biologic rationale for thermal therapy. International Journal of Hyperthermia. 21 (8), 779-790 (2005).
  22. Repasky, E. A., Evans, S. S., Dewhirst, M. W. Temperature matters! And why it should matter to tumor immunologists. Cancer Immunology Research. 1 (4), 210-216 (2013).
  23. Hijnen, N., et al. Thermal combination therapies for local drug delivery by magnetic resonance-guided high-intensity focused ultrasound. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (24), E4802-E4811 (2017).
  24. Shultz, L. D., et al. Human cancer growth and therapy in immunodeficient mouse models. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (7), 694-708 (2014).
  25. De Vita, A., et al. Deciphering the genomic landscape and pharmacological profile of uncommon entities of adult rhabdomyosarcomas. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11564(2021).
  26. McKinnon, T., et al. Functional screening of FGFR4-driven tumorigenesis identifies PI3K/mTOR inhibition as a therapeutic strategy in rhabdomyosarcoma. Oncogene. 37 (20), 2630-2644 (2018).
  27. Zaporzan, B., et al. MatMRI and MatHIFU: software toolboxes for real-time monitoring and control of MR-guided HIFU. Journal of Therapeutic Ultrasound. 1, (2013).
  28. Dunne, M., et al. Heat-activated drug delivery increases tumor accumulation of synergistic chemotherapies. Journal of Controlled Release. 308, 197-208 (2019).
  29. Zhao, Y. X., Hu, X. Y., Zhong, X., Shen, H., Yuan, Y. High-intensity focused ultrasound treatment as an alternative regimen for myxofibrosarcoma. Dermatologic Therapy. 34 (2), 14816(2021).
  30. Vanni, S., et al. Myxofibrosarcoma landscape: diagnostic pitfalls, clinical management and future perspectives. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 14, 17588359221093973(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model
Posted by JoVE Editors on 2/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model . The Authors section was updated from:

Claire Wunker1,2
Karolina Piorkowska3
Ben Keunen3
Yael Babichev2
Suzanne M. Wong3,4
Maximilian Regenold5
Michael Dunne5
Julia Nomikos1,2
Maryam Siddiqui6
Samuel Pichardo6
Warren Foltz7
Adam C. Waspe3,8
Justin T. Gerstle3,9
Rebecca A. Gladdy1,2,10
1 Institute of Medical Science, University of Toronto
2 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital
3 The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children
4 Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto
5 Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto
6 Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary
7 Department of Radiation Oncology, University of Toronto
8 Department of Medical Imaging, University of Toronto
9 Department of Pediatric Surgery, University of Toronto
10 Department of Surgery, University of Toronto

to:

Claire Wunker1,2
Karolina Piorkowska3
Ben Keunen3
Yael Babichev2
Suzanne M. Wong3,4
Maximilian Regenold5
Michael Dunne5
Julia Nomikos1,2
Maryam Siddiqui6
Samuel Pichardo6
Warren Foltz7
Adam C. Waspe3,8
Justin T. Gerstle3,9
James M. Drake1,3,4,10
Rebecca A. Gladdy1,2,10
1 Institute of Medical Science, University of Toronto
2 Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital
3 The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children
4 Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto
5 Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto
6 Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary
7 Department of Radiation Oncology, University of Toronto
8 Department of Medical Imaging, University of Toronto
9 Department of Pediatric Surgery, University of Toronto
10 Department of Surgery, University of Toronto

Tags

Gelokaliseerde hyperthermiethermosensitieve liposomale doxorubicinerabdomyosarcoom-muismodeltumorgerichte hyperthermiemonitoring van geneesmiddelvrijgaveMRI-thermometrieHIFU-behandelingfarmacokinetische analyse
Magnetische resonantie-geleide hoge intensiteit gerichte echografie gegenereerde hyperthermie: een haalbare behandelingsmethode in een Murine Rhabdomyosarcoom-model
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.