Methodenartikel

Expressie van transgenen in native blaasurotheel met behulp van adenovirus-gemedieerde transductie

DOI:

10.3791/64584

⸱

6 oktober 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er worden methoden beschreven voor het genereren van grote hoeveelheden recombinante adenovirussen, die vervolgens kunnen worden gebruikt om het inheemse knaagdier urotheel te transduceren, waardoor expressie van transgenen of downregulatie van endogene genproducten mogelijk is.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naast het vormen van een barrière met hoge weerstand, wordt verondersteld dat het urotheel dat het nierbekken, urineleiders, blaas en proximale urethra bekleedt, informatie over zijn omgeving waarneemt en doorgeeft aan de onderliggende weefsels, waardoor de ledigingsfunctie en het gedrag worden bevorderd. Verstoring van de urotheliale barrière, of de sensorische / transducerfunctie, kan leiden tot ziekte. Het bestuderen van deze complexe gebeurtenissen wordt belemmerd door een gebrek aan eenvoudige strategieën om de gen- en eiwitexpressie in het urotheel te veranderen. Hier worden methoden beschreven waarmee onderzoekers grote hoeveelheden adenovirus met een hoge titer kunnen genereren, die vervolgens kunnen worden gebruikt om knaagdier urotheel met hoge efficiëntie en op een relatief eenvoudige manier te transduceren. Zowel cDNA's als kleine storende RNA's kunnen worden uitgedrukt met behulp van adenovirale transductie, en de impact van transgenexpressie op de urotheliale functie kan 12 uur tot enkele dagen later worden beoordeeld. Deze methoden zijn breed toepasbaar op studies van normale en abnormale urotheliale biologie met behulp van muis- of rattendiermodellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het urotheel is het gespecialiseerde epitheel dat het nierbekken, de urineleiders, de blaas en de proximale urethra1 bekleedt. Het bestaat uit drie lagen: een laag van sterk gedifferentieerde en gepolariseerde vaak bi-nucleate paraplucellen, waarvan de apicale oppervlakken baden in urine; een tussenliggende cellaag met een populatie van bi-nucleaat transit-versterkende cellen die aanleiding kunnen geven tot oppervlakkige paraplucellen als reactie op hun acute verlies; en een enkele laag basale cellen, waarvan een subset functioneert als stamcellen die het geheel van het urotheel kunnen regenereren als reactie op chronische schade. Paraplucellen zijn voornamelijk verantwoordelijk voor het vormen van de urotheliale barrière met hoge weerstand, waarvan componenten een apicale membraan (rijk aan cholesterol en cerebrosiden) met een lage permeabiliteit voor water en opgeloste stoffen omvatten, en een apicale junctionele complex met hoge weerstand (bestaande uit tight junctions, adherens junctions, desmosomen en een bijbehorende actomyosinering)1 . Zowel het apicale oppervlak van de paraplucel als de junctionele ring zetten uit tijdens het vullen van de blaas en keren snel terug naar hun voorgevulde toestand na het legen van 1,2,3,4,5. Naast zijn rol in de barrièrefunctie, wordt ook verondersteld dat het urotheel sensorische en transducerfuncties heeft die het mogelijk maken om veranderingen in het extracellulaire milieu (bijv. Stretch) te detecteren en deze informatie via afgifte van mediatoren (waaronder ATP, adenosine en acetylcholine) door te geven aan onderliggende weefsels, waaronder suburotheliale afferente zenuwprocessen 6,7,8 . Recent bewijs van deze rol wordt gevonden bij muizen zonder urotheliale expressie van zowel Piezo1 als Piezo2, wat resulteert in een veranderde ledigingsfunctie9. Bovendien ontwikkelen ratten die het tight-junction porievormende eiwit CLDN2 in de paraplucellaag overexpressie overexpressie, ontsteking en pijn analoog aan die bij patiënten met interstitiële cystitis10. Er wordt verondersteld dat verstoring van de urotheliale sensorische / transducer- of barrièrefunctie kan bijdragen aan verschillende blaasaandoeningen 6,11.

Een beter begrip van de biologie van het urotheel in normale en ziektetoestanden hangt af van de beschikbaarheid van hulpmiddelen waarmee onderzoekers gemakkelijk endogene genexpressie kunnen downreguleren of de expressie van transgenen in het inheemse weefsel mogelijk maken. Hoewel een benadering om genexpressie te downreguleren is om voorwaardelijke urotheliale knock-out muizen te genereren, hangt deze aanpak af van de beschikbaarheid van muizen met floxed allelen, is arbeidsintensief en kan maanden tot jaren duren om12 te voltooien. Het is dan ook niet verrassend dat onderzoekers technieken hebben ontwikkeld om het urotheel te transfecteren of te transduceren, wat kan leiden tot resultaten op een kortere tijdschaal. Gepubliceerde methoden voor transfectie omvatten het gebruik van kationische lipiden13, anti-sense fosforothioated oligodeoxynucleotiden 14, of antisense nucleïnezuren gebonden aan het HIV TAT-eiwit dat 11-mer peptide15 penetreert. De focus van dit protocol ligt echter op het gebruik van adenovirale gemedieerde transductie, een goed bestudeerde methodologie die efficiënt is in genafgifte aan een breed scala aan cellen, is getest in tal van klinische onderzoeken en werd onlangs gebruikt om het cDNA dat codeert voor het COVID-19 capsid-eiwit te leveren aan ontvangers van één variant van het COVID-19-vaccin16, 17. Voor een meer grondige beschrijving van de levenscyclus van het adenovirus, adenovirale vectoren en klinische toepassingen van adenovirussen, wordt de lezer verwezen naar referentie17.

Een belangrijke mijlpaal in het gebruik van adenovirussen om het urotheel te transduceren, was een rapport van Ramesh et al. dat korte voorbehandelingen met detergentia, waaronder N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) dramatisch verbeterde transductie van het urotheel door een adenovirus dat codeert voor β-galactosidase18. Met behulp van deze proof-of-principle studie als leidraad, is adenovirale transductie van het urotheel nu gebruikt om een verscheidenheid aan eiwitten tot expressie te brengen, waaronder Rab-familie GTPases, guanine-nucleotide uitwisselingsfactoren, myosine motorfragmenten, porievormende tight junction-geassocieerde claudinen en ADAM17 10,19,20,21,22 . Dezelfde aanpak werd aangepast om kleine interfererende RNA's (siRNA) tot expressie te brengen, waarvan de effecten werden gered door co-expressie van siRNA-resistente varianten van het transgen22. Het hier beschreven protocol omvat algemene methoden om grote hoeveelheden sterk geconcentreerd adenovirus te genereren, een vereiste voor deze technieken, evenals aanpassingen van de methoden van Ramesh et al.18 om transgenen in het urotheel met hoge efficiëntie tot expressie te brengen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Experimenten met het genereren van adenovirussen, waarvoor BSL2-certificering vereist is, werden uitgevoerd onder goedkeuring van de milieugezondheids- en veiligheidskantoren van de Universiteit van Pittsburgh en het Institutional Biosafety Committee. Alle uitgevoerde dierproeven, inclusief adenovirale transductie (waarvoor ABSL2-certificering vereist is), werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen / voorschriften van het beleid van de volksgezondheidsdienst inzake humane zorg en gebruik van proefdieren en de dierenwelzijnswet, en onder de goedkeuring van de University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Handschoenen, oogbescherming en geschikte kleding worden gedragen voor alle procedures waarbij recombinante virussen betrokken zijn. Alle vloeibare of vaste afvalstoffen moeten worden verwijderd zoals hieronder beschreven. Het strooisel van de dieren na transductie en eventuele resulterende kadavers van dieren moeten worden behandeld als biologisch gevaarlijk materiaal en worden verwijderd volgens het institutionele beleid.

1. Bereiding van adenovirusvoorraden met een hoge titer

OPMERKING: Effectieve transductie van knaagdierblazen hangt af van het gebruik van gezuiverde en geconcentreerde virale voorraden, meestal 1 x 107 tot 1 x 108 infectieuze virale deeltjes (IVP) per μL. Dit deel van het protocol is gericht op het genereren van adenovirusvoorraden met een hoge titer uit bestaande viruspreparaten. Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een celkweekkap met behulp van steriele reagentia en hulpmiddelen. Hoewel de beschikbare stammen van adenovirus die tegenwoordig worden gebruikt, replicatiedefect zijn, hebben de meeste instellingen goedkeuring nodig om adenovirussen en recombinant DNA te gebruiken. Dit omvat vaak de aanwijzing van een celkweekruimte als een BSL2-goedgekeurde faciliteit om adenovirussen te produceren en te versterken. Enkele algemene overwegingen omvatten het gebruik van maskers, oogbescherming, handschoenen en passende kleding in alle stadia van virusproductie en -zuivering. Bij het uitvoeren van centrifugeren worden veiligheidsdoppen aanbevolen als de centrifugebuizen geen nauwsluitende doppen hebben. Alle niet-wegwerpmaterialen, inclusief mogelijk verontreinigde veiligheidsdoppen, flessen en rotoren van centrifuge, worden behandeld met een antivirale oplossing (zie materiaaltabel) en vervolgens gespoeld met water of 70% ethanol. Vloeibaar afval wordt behandeld door bleekmiddel toe te voegen tot een eindconcentratie van 10% (v/v). De verwijdering van deze vloeibare afvalstoffen zal afhangen van het institutionele beleid. Vast afval wordt doorgaans verwijderd in biologisch gevaarlijk afval.

  1. Kweek HEK293T cellen
    1. Ontdooi een bevroren injectieflacon met HEK293T-cellen in een waterbad bij 37 °C en gebruik een pipet van 5 ml om de cellen over te brengen naar een celkweekschaal met een diameter van 15 cm. Voeg met behulp van een pipet van 25 ml langzaam 20 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% (v / v) foetaal runderserum en penicilline / streptomycine-antibioticum (DMEM-FBS-PS) toe aan het gerecht. Incubeer de cellen in een 37 °C celkweekincubator vergast met 5% (v/v) CO2 totdat ze 80%-90% samenvloeiing bereiken (~2 x 107 cellen).
    2. Gebruik een glazen pipet die aan een vacuümbron is bevestigd, zuig het medium op en spoel de cellen vervolgens af door 20 ml steriele PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 136,9 mM NaCl en 8,9 mM Na2HPO4) met een pipet van 25 ml over te brengen naar de schaal. Zuig de gebruikte PBS aan en gebruik vervolgens een pipet van 5 ml om 3 ml warme (37 °C) proteïnase-oplossing (zie materiaaltabel) over te brengen naar de schaal, waarbij de schaal in de celkweekincubator wordt geïncubeerd totdat de cellen loskomen (~ 3-4 min).
      OPMERKING: Effectieve proteolyse kan het beste worden beoordeeld door de schaal langzaam heen en weer te kantelen op zoek naar afgifte van cellen uit alle delen van de schaal in de bewegende vloeistof. HEK293T-cellen zijn gevoelig voor uitgebreide proteïnasebehandeling en zullen sterven als ze langer dan een paar minuten in proteïnase-oplossing worden achtergelaten.
    3. Gebruik een pipet van 10 ml om 7 ml DMEM-FBS-PS over te brengen naar de schaal van losgemaakte cellen en gebruik vervolgens dezelfde pipet om de cellen en het medium op te zuigen. Breng de gesuspendeerde cellen over in een conische buis van 50 ml en pelleteer de cellen vervolgens door de suspensie gedurende 5 minuten in een klinische centrifuge met lage snelheid bij 200 x g te centrifugeren. Zuig het supernatant op met behulp van een glazen pipet die aan een vacuümbron is bevestigd. Gebruik een pipet van 25 ml om de celpellet te resuspenderen in 15 ml DMEM-FBS-PS.
    4. Voeg 1 ml van de celsuspensie toe aan elk van de vijftien schalen van 15 cm met 19 ml DMEM-FBS-PS.
    5. Laat de cellen groeien in een weefselkweekincubator totdat ze 85% -90% samenvloeiing bereiken (~ 3-4 dagen).
  2. Bereid een verdunde virusoplossing
    1. Voeg ~1,5 x 10 9 tot 3 x 109 IVP van een bestaande virusvoorraad (5-10 IVP/cel) toe aan een 50 ml conische buis gevuld met 45 ml DMEM zonder FBS of antibiotica.
      OPMERKING: Het is mogelijk om een lagere concentratie van het virus te gebruiken (1-5 IVP / cel); Het zal echter langer duren voordat de virusproductie volgt.
  3. Infecteer de gekweekte cellen met het virus.
    1. Gebruik een glazen pipet die aan een vacuümbron is bevestigd en zuig het medium uit de bijna samenvloeiende cellen in stap 1.1.5.
    2. Gebruik een pipet van 25 ml om 3,0 ml verdunde virusoplossing (bereid in stap 1.2.1) over te brengen naar elke celkweekschaal. Gebruik vervolgens een pipet van 10 ml om 7,0 ml DMEM-medium (zonder FBS of antibiotica) aan elk gerecht toe te voegen. Incubeer gedurende 60 minuten in een celkweekincubator en voeg vervolgens 10 ml DMEM met 20% (v / v) FBS en 2x PS toe aan elk gerecht.
      OPMERKING: Het gebruik van een van de 15 schotels als controleplaat (waarin geen virus is toegevoegd) maakt het gemakkelijker om virus-geïnduceerde celafronding en dood in geïnfecteerde cellen in de volgende stap te identificeren.
    3. Incubeer de cellen in de celkweekincubator gedurende 2-4 dagen totdat de meerderheid van hen begint af te ronden en >60% van de cellen is losgekomen.
      OPMERKING: Als u een lagere titer van het virus gebruikt, kan het tot een week duren voordat celdood optreedt. Als celdood niet binnen een week optreedt, is het waarschijnlijk dat het proces moet worden herhaald met een hogere titer van het virus.
  4. Herstel virus van cellysaten
    1. Gebruik een celschraper om de bodem van elke schaal te schrapen en gehechte cellen in het medium vrij te geven.
    2. Gebruik een pipet van 25 ml om het medium, de cellen en het celafval van elke celkweekschaal te verzamelen en samen te voegen tot een conische celkweekbuis van 50 ml.
      OPMERKING: Om middelen te besparen, kan het medium van twee gerechten worden gecombineerd tot één buis van 50 ml.
    3. Pellet het celmateriaal door centrifugeren met behulp van een tafelcentrifuge met lage snelheid: 5 min bij kamertemperatuur bij 3.000 x g. Gebruik een glazen pipet die aan een vacuümapparaat is bevestigd om het supernatant op te zuigen.
    4. Gebruik een pipet van 10 ml, gecombineerd met trituratie, om al het resulterende gepelletiseerde materiaal te consolideren in een totaal van 7 ml steriel gefilterde 100 mM Tris-HCl pH 7,4 met 10 mM EDTA (Tris-EDTA-oplossing). Breng het samengevoegde materiaal over in een steriele conische buis van 15 ml celkweek en plaats het op ijs.
      OPMERKING: Op dit punt kan de virusvoorbereiding voor onbepaalde tijd worden ingevroren bij -80 °C.
  5. Cellysaten bereiden
    1. Voer drie vries-dooicycli uit om de resterende cellen te verstoren en zo de gevormde virusdeeltjes verder vrij te maken. Bevries het samengevoegde materiaal in stap 1.4.4 door de buis onder te dompelen in vloeibare stikstof (~ 30-60 s). Ontdooi het monster snel door de buis in een incubator van 37 °C te plaatsen. Draai het monster gedurende 15 s en herhaal vervolgens de snelle vries- en ontdooiprocedure nog eens 2x.
      OPMERKING: De virusoplossing kan snel worden ontdooid in een 37 ° C in een waterbad, maar voorzichtigheid is geboden omdat de temperatuurschommelingen ervoor kunnen zorgen dat de buis barst, waardoor virusoplossing in het waterbad vrijkomt. Om dit te voorkomen, plaatst u de buis met het virale supernatant in een grotere buis, die vervolgens in het waterbad wordt geplaatst.
    2. Gebruik een pipet van 10 ml om het driemaal bevroren ontdooide celmateriaal over te brengen naar een centrifugebuis met supersnelheid. Centrifugeer het materiaal in de buis gedurende 30 minuten bij 4 °C supersnelle centrifuge bij ~ 18.500 x g.
    3. Herstel de ~ 7 ml virusrijk supernatant met een pipet van 10 ml en breng deze over in een conische buis van 15 ml. Bewaar het monster op ijs tot de volgende stap.
      OPMERKING: Overweeg op dit punt een aliquot van het ongezuiverde virale supernatant te bewaren als een preambule om een nieuw viruspreparaat te starten (of als back-up). Bewaar dit aliquot bij -80 °C.
  6. Isoleer en zuiver het virus met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie.
    1. Bereid een discontinue gradiënt van CsCl in een 12 ml PET dunwandige, heldere ultracentrifugebuis (zie materiaaltabel) of gelijkwaardig. Gebruik een spuit van 3 ml uitgerust met een naald van 18 G om voorzichtig 2,5 ml 1,4 g/ml CsCl-oplossing in de bodem van de buis te brengen en gebruik vervolgens een nieuwe spuit/naald om deze te bedekken met 2,5 ml 1,25 g/ml CsCl-oplossing.
      OPMERKING: Het direct op een reeds bestaande laag laten vallen van oplossingen zal aanzienlijke en ongewenste vermenging veroorzaken. Plaats in plaats daarvan het afgeschuinde deel van de naald tegen de rand van de buis en druk vervolgens heel langzaam op de zuiger van de spuit, waarbij u de positie van de naald verhoogt terwijl de oplossing de buis vult.
    2. Laad de ~ 7 ml viraal supernatant op de top van de gradiënt op een vergelijkbare manier met behulp van een spuit van 10 ml. Als er meer dan 2-3 mm ruimte is tussen het virale supernatant en de bovenkant van de buis, voeg dan extra Tris-EDTA-oplossing toe om de buis te vullen totdat er slechts 2-3 mm ruimte overblijft.
    3. Maak een op dezelfde manier geprepareerde balansbuis, die lagen CsCl bevat, maar Tris-EDTA-oplossing vervangt voor het virale supernatant.
      OPMERKING: De twee buizen moeten identieke gewichten (en vergelijkbare dichtheden) hebben om een potentieel gevaarlijke onevenwichtige belastingssituatie in de ultracentrifuge te voorkomen.
  7. Isoleer het virus met behulp van rate-zonale ultracentrifugatie.
    1. Laad de hellingen gevormd in stappen 1.6.2-1.6.3 in de bakken van een SW41-rotor of gelijkwaardig. Schroef de emmerdoppen in, plaats de rotor in een ultracentrifuge (voorgekoeld tot 4 °C) en centrifugeer gedurende 1 uur bij ~ 150.000 x g.
    2. Breng tijdens het centrifugeren de in stap 1.9.1 beschreven kolom in evenwicht.
  8. Geïsoleerde virusdeeltjes terugwinnen
    1. Maak aan het einde van de centrifugatiestap de emmers voorzichtig los van de rotor en verwijder in een celkweekkap de emmerdoppen en verwijder vervolgens de buizen en plaats ze in een rek.
    2. Verzamel het gestreepte materiaal, rijk aan virusdeeltjes, dat drijft op het grensvlak tussen de 1,25 g/ml en 1,4 g/ml CsCl-oplossing. Houd de buis met de gradiënt over de onderste helft van een celkweekschaal (die gemorst materiaal zal vangen), gebruik een naald van 1 inch 18 G die is bevestigd aan een spuit van 3 ml om de buis voorzichtig door te prikken, net onder het gestreepte virus. Zuig het virus langzaam op, dat meestal wordt hersteld in ~ 1 ml.
    3. Verwijder de naald uit de buis, waardoor het resterende materiaal in de gradiënt uit de buis in de onderste helft van de celkweekschaal stroomt (eventuele vloeistoffen moeten als gevaarlijk afval worden behandeld).
    4. Breng de virusoplossing in de spuit over in een steriele microcentrifugebuis op ijs.
      OPMERKING: Wanneer u het virus in deze stap herstelt, plaatst u de naald zo dat het lumen van de naald naar boven is gericht met de naaldopening een paar mm onder de virusrijke band. Vermijd besmetting door de dunne band van onjuist geassembleerd virus die soms 2-3 mm boven het gestreepte virus wordt waargenomen (zie dunne zwarte pijl in figuur 1A).
  9. Verwijder CsCl uit het monster door gelfiltratie.
    1. Balanceer een PD-10-kolom (voorverpakt met Sephadex G-25M), vastgeklemd aan een steunstandaard, met 50 ml steriel gefilterd PBS van 0,2 μm met 10% (v / v) glycerol.
      OPMERKING: De eerste evenwichtsstap duurt 2-3 uur om te voltooien en is noodzakelijk om te zorgen voor volledige uitspoeling van conserveermiddelen die door de fabrikant worden gebruikt om de kolom te stabiliseren.
    2. Laat de wasoplossing zich terugtrekken onder de fries (een beschermende schijf van wit materiaal aan de bovenkant van het kolommedium) en breng vervolgens voorzichtig de gezuiverde virusoplossing die in stap 1.8 is verzameld over naar de bovenkant van de kolom. Laat de virusrijke oplossing zich terugtrekken onder de frit en begin dan met het vullen van de kolom met PBS-glycerol.
      OPMERKING: Een functie van de frit is om te voorkomen dat de kolom droogloopt. Als gevolg hiervan worden korte vertragingen getolereerd voordat er meer eluant aan de kolom wordt toegevoegd.
    3. Verzamel het eluaat in 12 steriele microcentrifugebuizen, 0,5 ml per fractie.
  10. Bepaal de virale opbrengst.
    1. Bepaal de piekvirusfracties met behulp van spectrofotometrie. Bereid een verdunning van 1:100 van elke fractie in PBS en meet de OD260 in een spectrofotometer, met behulp van een 1:100 verdunning van alleen buffer als blanco. De virusdeeltjes moeten in het leegtevolume elueren, te beginnen rond fractie 6. Bundel de fracties met de hoogste OD260-waarden .
    2. Maak een verdunning van 1:100 van de gepoolde virale fracties en meet de OD260 opnieuw. Bereken de uiteindelijke concentratie van virusdeeltjes en het aantal IVP in de gepoolde fracties met behulp van de volgende formule: Virusdeeltjes per ml = OD260 × 100 (dit corrigeert voor de verdunningsfactor) × 1012. Een algemene schatting is dat 1% van de virusdeeltjes IVP is, als zodanig: IVP/ml = OD 260 × 100 × 10 10 of IVP/μL = OD260 ×100 × 10 7.
  11. Aliquot de gepoolde virusfracties (met 5 x 107 tot 1 x 108 IVP) in steriele microcentrifugebuizen of cryovialen. Bewaar de monsters bij -80 °C.

2. Transductie van knaagdierblaas

OPMERKING: Als deze techniek nieuw is, wordt aanbevolen het aantal dieren dat in één keer wordt getransduceerd te beperken tot 2-4. Dit kan worden bereikt door de starttijden voor elk dier te spreiden, met name tijdens de wasmiddelbehandeling in stap 2.2 en vervolgens de virusincubatie in stap 2.3. Ervaren onderzoekers kunnen maximaal zes dieren tegelijk transduceren.

  1. Catheteriseer de blaas
    1. Verdoof vrouwelijke C57Bl/6J muizen (meestal 8-10 weken oud, ~20-25 g) of vrouwelijke Sprague Dawley ratten (meestal 2-3 maanden oud, ~250 g) met behulp van een vaporizer met een aangehechte neuskegel. Kalibreer de vaporizer om 3,0% (v/v) isofluraan, 97% (v/v) O 2 voor muizen of 4,0% (v/v) isofluraan, 96% (v/v) O2 voor ratten te produceren. Bevestig dat de dieren verdoofd zijn door ervoor te zorgen dat ze niet reageren op teenknijpen (meestal na 1-2 minuten).
    2. Handhaaf de lichaamstemperatuur van het dier door de dieren op een verwarmd pad te plaatsen. Controleer het dier gedurende het transductieprotocol om ervoor te zorgen dat de dieren worden verdoofd en geen pijn ervaren tijdens deze procedure.
    3. Verlaag isofluraan tot 1,5% (v/v) voor muizen of 2,0% (v/v) voor ratten en houd de dieren onder narcose voor de duur van het protocol.
    4. Om te voorkomen dat er lucht in de blaas wordt gebracht, vult u het plastic kathetergedeelte van een infuuskatheter (zie materiaaltabel) en de bijbehorende naaf met steriele PBS met behulp van een transferpipet.
    5. Met het dier in rugligging, veeg de externe meatus met 70% alcohol en breng de steriele katheter in de externe meatus, vervolgens de urethra en vervolgens in de blaas.
      1. Om deze taak uit te voeren, gebruikt u een fijne tang om het weefsel dat de externe meatus vormt voorzichtig vast te pakken en verticaal uit te breiden, weg van het dier. Breng met de andere hand de katheter voorzichtig verticaal ongeveer 3-4 mm in de urethrale meatus (een hoop vlees net boven de opening van de vagina). Laat vervolgens, vanwege een bocht in de urethra, de katheter zakken, ingebracht in de externe meatus, in de richting van de staart van het dier, wat de toegang tot het deel van de urethra dat onder het schaambeen passeert, en uiteindelijk in de blaas vergemakkelijkt
        . OPMERKING: Vooral in het geval van de muis kan de katheter te lang zijn en mag niet meer dan 1,0-1,1 cm ervan in het dier worden ingebracht. Anders zal schade aan het blaasslijmvlies ontstaan. Om dit te voorkomen, markeert u de katheter ~ 1 cm onder de punt en plaatst u de katheter vervolgens niet verder dan deze markering.
    6. Laat de urine in de blaas uitlekken. Verwijder eventuele resterende urine door de manoeuvre van Credé uit te voeren: masseer en druk zachtjes op de blaasbult in de onderbuik.
  2. Maak het urotheel ontvankelijk voor transductie door het te behandelen met een reinigingsmiddeloplossing.
    1. Was de muis- of rattenblaas door een steriele spuit van 1 ml gevuld met PBS aan de katheterhub te bevestigen. Injecteer 100 μL steriele PBS in de muizenblaas (of 450 μL in het geval van de rattenblaas). Maak de spuit los van de katheterfitting en laat de PBS leeglopen. Voer indien nodig Crede's manoeuvre uit om overtollig blaasvocht te verwijderen.
    2. Inbreng 100 μL van 0,1% (m/v) N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) (opgelost in PBS en 0,2 μm filter-gesteriliseerd) in de muizenblaas met behulp van een steriele spuit van 1 ml. Houd de DDM gedurende 10 minuten in de blaas door de spuit op zijn plaats te laten. Bij ratten wordt het volume DDM verhoogd tot 450 μL.
    3. Verwijder de DDM uit de blaas door de spuit los te maken en uit te laten lopen. Voer Crede's manoeuvre uit indien nodig.
  3. Introduceer het virus in de blaas.
    1. Bevestig een steriele spuit van 1 ml aan de katheterhub en breng 0,5 x 107 tot 1 x 108 IVP adenovirus (bereid in stap 1), verdund in 100 μL steriele PBS voor muizen of 450 μL voor ratten, in de blaas. Laat de spuit op de katheter zitten om te voorkomen dat de virusoplossing ontsnapt.
    2. Maak na 30 minuten de spuit los en laat de virusoplossing de blaas evacueren op een wegwerppad. Dep eventuele resterende virusoplossing met een absorberend doekje en gooi het maandverband en doekje weg in biologisch gevaarlijk afval.
      OPMERKING: Glycerol is cytotoxisch. Als zodanig is het maximale volume virusoplossing dat in muizen wordt ingebracht beperkt tot 5 μL (wat bij verdunding in 100 μL PBS zou resulteren in een uiteindelijke glycerolconcentratie van ~ 0,5% [v / v]). Bovendien is het mogelijk om de transductie-efficiëntie te verbeteren door het aantal geïnstilleerde IVP te verhogen en door de virusincubatie uit te breiden tot 45 minuten.
    3. Optionele stap: De blaas kan worden gespoeld met PBS zoals beschreven in stap 2.2.1 hierboven; dit is echter niet verplicht.
  4. Laat het dier herstellen.
    1. Stop de stroom van isofluraan en laat het dier herstellen en volledig mobiel zijn voordat het terugkeert naar zijn kooi, vooral als de dieren in groep zijn gehuisvest.
      OPMERKING: Aangezien virustransductie op zich geen waarneembare symptomen of pijn van de lagere urinewegen veroorzaakt, is er meestal geen behoefte aan postoperatieve behandeling. Als het gecodeerde transgen echter toxisch is, kan analgesie of antibiotica na de procedure nodig zijn, zoals vereist door de instelling.
  5. Analyseer de effecten van transgenexpressie 12-72 h na de behandeling met behulp van methoden zoals mRNA in situ hybridisatie, western blot of immunofluorescentie 9,10,23 (zie de representatieve resultaten).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virusvoorbereiding
Een voorbeeld van viruszuivering door dichtheidsgradiëntcentrifugatie is weergegeven in figuur 1A. De lichtroze band, te vinden op het grensvlak van het geladen celmateriaal en de 1,25 g/ml CsCl-laag, bestaat voornamelijk uit verstoorde cellen en hun puin (zie magentapijl in figuur 1A). Het ontleent zijn roze kleur aan de kleine hoeveelheid cultuurmedium die wordt overgenomen van stap 1.5 in het protocol. De relevante virus...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terwijl Ramesh et al. zich richtten op het ontwikkelen van strategieën om adenovirale transductie te gebruiken bij de behandeling van blaaskanker 18, hebben recentere rapporten het nut van deze technieken aangetoond bij het bestuderen van normale urotheliale biologie / fysiologie en pathofysiologie 10,18,19,20,21 . De belangrijkste kenm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een proefprojectprijs via P30DK079307 (aan M.G.D.), NIH-subsidie R01DK119183 (aan G.A. en M.D.C.), NIH-subsidie R01DK129473 (aan G.A.), een American Urology Association Career Development award en een Winters Foundation-beurs (aan N.M.), door de Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores van het Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), en door S10OD028596 (aan G.A.), die de aankoop financierde van het confocale systeem dat werd gebruikt om enkele van de afbeeldingen in dit manuscript vast te leggen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 mL pipetteCorning Costar (Millipore Sigma)CLS4488steriele, serologische pipet, individueel verpakt
12 mL ultracentrifugebuisThermoFisher06-752PET dunne wand ultracentrifugebuis
15 mL conische centrifugebuisFalcon (Corning)352097steriele
18 G naaldBD 30519618 G x 1,5 inch naald
20 mL pipetteCorning Costar (Millipore Sigma)CLS4489steriele, serologische pipet, individueel verpakt
50 mL conische centrifugebuisFalcon (Corning)352098steriele
5 mL pipetteCorning Costar (Millipore Sigma)CLS4487steriele, serologische pipet, individueel verpakt
CavicideHenry Schein6400012Anti-virale oplossing
Celcultuur schaal - 15 cmFalcon (Corning)353025steriele, weefselcultuur behandelde  (150 mm x 25 mm schaal)
CelschraperSarstedt893.1832handvatlengte 24 cm, bladlengte 1,7 cm
CsClMillipore SigmaC-4306Moleculair Biologische kwaliteit ≥ 98%
DMEM kweekmedium (hoge glucose)Gibco (ThermoFisher)11965092met 4,5 g/L glucose + L-glutamine + fenolrood
EDTAMillipore SigmaEDSBioiultra kwaliteit ≥ 99%
Fetaal bovien serum Hyclone (Cytiva)SH30070.03gedefinieerd serum
Glazen pipetFisher Scientific13-678-20A5,75 inch glazen pipet, geautoclaveerd
GlycerolMillipore SigmaG-5516Moleculair Biologische kwaliteit ≥ 99%
HEK293 cellenATCCCRL-3216HEK293T cellen zijn een variant van HEK293 cellen die het SV40 grote T-antigeen uitdrukken
IsofluraanCovetrus29405
IV-katheter - muisSmith Medical Jelco306324 G x 3/4 inch Safety IV katheter  radiopaque
IV-katheter - ratSmith Medical Jelco306022 G x 1 inch Safety IV katheter radiopaque
KClMillipore SigmaP-9541Moleculair Biologische kwaliteit ≥ 99%
KH2PO4Millipore SigmaP5655Celcultuurkwaliteit  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2OMillipore Sigma431478 ≥ 99,99%
NaClMillipore SigmaS3014Moleculair Biologische kwaliteit ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside Millipore SigmaD4641 ≥ 98%
Neuskoker voor meerdere dierenop maat ontworpencommerciële opties omvatten een van Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 kolom GE Healthcare17-085-01Vooraf gevulde kolommen gevuld met Sephadex G-25M
Penicilline/streptomycine antibioticum (100x)Gibco (ThermoFisher)15070063100x geconcentreerde oplossing
SpectrofotometerEppendorf BioPhotometer
Stand en klemFisher Scientific14-679Q en 05-769-8FQbeschikbaar bij talrijke leveranciers
Steriele filtereenheidFisher Scientific (Nalgene)09-740-65B0,2 µm snelstromende filtereenheid (150 mL)
Steriele filtereenheid 0,2 µm (sering)Fisher Scientific SLGV004SLMillipore Sigma Milex 0,22 µm filtereenheid die aan de spuit bevestigd
SupersnelheidscentrifugeEppendorf 5810Rmet Eppendorf F34-6-38 vaste hoek rotor (12.000 rpm)
Spuit (1 mL)BD 3096281-mL spuit Luer-lok tip - steriele
Spuit (3 mL)BD 3096563-mL spuit slip tip - steriele
Bureaucentrifuge (lage snelheid)Eppendorf 5702met schommelende emmer rotor
Transfer pipettenFisher Scientific13-711-9AMpolyethyleen 3,4 mL transfer pipet
Tris-basisMillipore Sigma648310-MMoleculair Biologische kwaliteit 
TrypLE select protease oplossingGibco (ThermoFisher)12604013TrypLE express enzym (1x), geen fenolrood
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima L-80 XPmet Beckman SW41 rotor (41.000 rpm)
Verdamper General Anesthetic Services, Inc.Tec 3Isofluraan verdamper
Vortex MixerVWR10153-838analoge vortex mixer

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
  2. Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
  3. Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
  4. Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
  5. Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
  6. Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
  7. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
  8. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
  9. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984(2021).
  10. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
  11. Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463(2014).
  12. Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
  13. Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
  14. Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
  15. Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
  16. Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
  17. Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  18. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
  19. Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
  20. Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
  21. Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
  22. Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
  23. Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
  24. Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
  25. Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
  26. Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
  27. Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804(2018).
  28. Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888(2022).
  29. Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Adenovirustransductietransgene expressiecatheterisatietechniekurotheelbarri reWestern blotimmunofluorescentieanalysein situ hybridisatie van mRNAClaudine 2 expressieparaplu cellen

Gerelateerde artikelen