Real-Time Void Spot Assay

Summary

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode om het ledigingsgedrag van muizen te bestuderen door videobewaking op te nemen in de conventionele void spot-assay. Deze benadering biedt tijdelijke, ruimtelijke en volumetrische informatie over de ledigingsgebeurtenissen en details van muisgedrag tijdens de lichte en donkere fasen van de dag.

Abstract

Normaal ledigingsgedrag is het resultaat van de gecoördineerde functie van de blaas, de urethra en de urethrale sluitspieren onder de juiste controle van het zenuwstelsel. Om vrijwillig ledigingsgedrag in muismodellen te bestuderen, hebben onderzoekers de void spot assay (VSA) ontwikkeld, een methode die het aantal en de oppervlakte van urinevlekken meet die zijn afgezet op een filterpapier dat de vloer van de kooi van een dier bekleedt. Hoewel technisch eenvoudig en goedkoop, heeft deze test beperkingen wanneer deze wordt gebruikt als een eindpunttest, waaronder een gebrek aan tijdelijke oplossing van ledigingsgebeurtenissen en problemen met het kwantificeren van overlappende urinevlekken. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een video-bewaakte VSA ontwikkeld, die we real-time VSA (RT-VSA) noemen, en waarmee we de ledigingsfrequentie kunnen bepalen, het lege volume en de ledigingspatronen kunnen beoordelen en metingen kunnen doen over 6 uur tijdvensters tijdens zowel de donkere als de lichte fase van de dag. De methode die in dit rapport wordt beschreven, kan worden toegepast op een breed scala aan op muizen gebaseerde studies die de fysiologische en neurobehaviorale aspecten van vrijwillige mictie in gezondheids- en ziektetoestanden onderzoeken.

Introduction

Urineopslag en mictie worden gecoördineerd door een centraal circuit (centraal zenuwstelsel) dat informatie ontvangt over de blaasvulstatus via de bekken- en hypogastrische zenuwen. Het urothelium, het epitheel dat de urinewegen van het nierbekken naar de proximale urethra bekleedt, vormt een strakke barrière voor de metabole afvalproducten en pathogenen die in de urine aanwezig zijn. Het is een integraal onderdeel van een sensorisch web, dat de vultoestand van de blaas detecteert en communiceert naar onderliggende weefsels en afferente zenuwen ^1,2. Verstoring van de urotheliale barrière, of veranderingen in u....

Protocol

Urotheliale piëzo1 /2 dubbele knock-out muizen (Pz1/2-KO, genotype: Piezo1 fl^/fl; Piëzo2 fl^/fl; Upk2^CRE+/-) en controles (Pz1/2-C, genotype: Piezo1 fl^/fl; Piëzo2 fl^/fl; Upk2^CRE-/-) werden intern gegenereerd uit ouderstammen verkregen uit de Jax-laboratoria (Piezo1 fl^/fl stam # 029213; Piezo2 fl/^fl soort # 027720; Upk2^CRE+/- stam # 029281). Zowel vrouwelijke (1,5-3 maanden oud en 17-20 g in gewicht) als mannelijke (2-4 maanden oud en 23-29 g in gewicht) muizen werden gebruikt in de experimenten. Voor cyclofosfamide-geï....

Results

Ledigingsgedrag van urotheliale piëzo1/2 knock-out muizen

Tijdens de opslagfase van de mictiecyclus wordt verondersteld dat het urotheel de spanning waarneemt die wordt uitgeoefend door de urine die zich in de blaas heeft opgehoopt en om deze mechanische stimulus om te zetten in cellulaire reacties zoals serosale ATP-afgifte ^1,3. We hebben eerder aangetoond dat mechanisch geactiveerde PIEZO1- en PIEZO2-kanalen.......

Discussion

De integratie van videobewaking is een kosteneffectieve wijziging die verschillende voordelen biedt ten opzichte van de klassieke VSA. In de klassieke VSA, die meestal wordt gebruikt als eindpunttest, is het moeilijk om overlappende leegteplekken te onderscheiden. Dit is geen triviale zorg, omdat muizen de neiging hebben om meerdere keren in hetzelfde gebied te plassen wanneer de test enkele uren wordt verlengd, meestal in de hoeken van hun kooi. Het eerste voordeel van RT-VSA is dus dat de onderzoeker gemakkelijk indivi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches	80/20	1010	Aantal: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches	80/20	1010	Aantal: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches	80/20	1010	Aantal: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches	80/20	1010	Aantal: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches	80/20	1010	Aantal: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut	80/20	3280	Aantal: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut	80/20	3287	Aantal: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support	80/20	14061	Aantal: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate	80/20	4118	Aantal: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate	80/20	4081	Aantal: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate	80/20	4080	Aantal: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate	80/20	4140	Aantal: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly	80/20	2064	Aantal: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket	80/20	4509	Aantal: 6
24”-long UV tube lights	ADJ Products LLC	T8-F20BLB24	Aantal: 2 20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Aantal: 1 82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Aantal: 2 26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Aantal: 2 82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Aantal: 2 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Aantal: 4 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Aantal: 4 4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Aantal: 4 4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Aantal: 4 4.5mm Thick, Clear, 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)	Thermo Fisher Scientific	57144
Cosmos blotting paper (thick paper)	Blick Art Materials	10422-1005
Excel	Microsoft Corporation
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 9.4.0	graphing and statistics software
ImageJ FIJI	NIH
Parafilm	Merck		transparent film
Quick Time Player 10.5 software	Apple		multimedia player
Security spy	Ben software		video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20	80/20	3381	Aantal: 80
UV transmitting acrylic	Spartech	Polycast Solacryl SUVT	Aantal: 2 38.5 cm x 26.5 cm
Water gel: HydroGel	ClearH2O	70-01-5022	(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam	Logitech	C930e	Aantal: 4