Method Article

Real-Time Void Spot Assay

DOI:

10.3791/64621

⸱

February 10th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode om het ledigingsgedrag van muizen te bestuderen door videobewaking op te nemen in de conventionele void spot-assay. Deze benadering biedt tijdelijke, ruimtelijke en volumetrische informatie over de ledigingsgebeurtenissen en details van muisgedrag tijdens de lichte en donkere fasen van de dag.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Normaal ledigingsgedrag is het resultaat van de gecoördineerde functie van de blaas, de urethra en de urethrale sluitspieren onder de juiste controle van het zenuwstelsel. Om vrijwillig ledigingsgedrag in muismodellen te bestuderen, hebben onderzoekers de void spot assay (VSA) ontwikkeld, een methode die het aantal en de oppervlakte van urinevlekken meet die zijn afgezet op een filterpapier dat de vloer van de kooi van een dier bekleedt. Hoewel technisch eenvoudig en goedkoop, heeft deze test beperkingen wanneer deze wordt gebruikt als een eindpunttest, waaronder een gebrek aan tijdelijke oplossing van ledigingsgebeurtenissen en problemen met het kwantificeren van overlappende urinevlekken. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een video-bewaakte VSA ontwikkeld, die we real-time VSA (RT-VSA) noemen, en waarmee we de ledigingsfrequentie kunnen bepalen, het lege volume en de ledigingspatronen kunnen beoordelen en metingen kunnen doen over 6 uur tijdvensters tijdens zowel de donkere als de lichte fase van de dag. De methode die in dit rapport wordt beschreven, kan worden toegepast op een breed scala aan op muizen gebaseerde studies die de fysiologische en neurobehaviorale aspecten van vrijwillige mictie in gezondheids- en ziektetoestanden onderzoeken.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urineopslag en mictie worden gecoördineerd door een centraal circuit (centraal zenuwstelsel) dat informatie ontvangt over de blaasvulstatus via de bekken- en hypogastrische zenuwen. Het urothelium, het epitheel dat de urinewegen van het nierbekken naar de proximale urethra bekleedt, vormt een strakke barrière voor de metabole afvalproducten en pathogenen die in de urine aanwezig zijn. Het is een integraal onderdeel van een sensorisch web, dat de vultoestand van de blaas detecteert en communiceert naar onderliggende weefsels en afferente zenuwen 1,2. Verstoring van de urotheliale barrière, of veranderingen in urotheliale mechanotransductieroutes, kan leiden tot ledigingsstoornissen samen met lagere urinewegsymptomen zoals frequentie, urgentie, nocturie en incontinentie 3,4,5,6,7. Evenzo is bekend dat veroudering, diabetes, lagere urineweginfecties, interstitiële cystitis en andere ziekteprocessen die de urineblaas beïnvloeden, of het bijbehorende circuit dat de functie ervan regelt, blaasdisfunctie veroorzaken 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Een beter begrip van normaal en abnormaal ledigingsgedrag hangt af van de ontwikkeling van methoden die op betrouwbare wijze onderscheid kunnen maken tussen verschillende plaspatronen.

Traditioneel is het vrijwillige ledigingsgedrag van muizen bestudeerd met behulp van de void spot assay (VSA), ontwikkeld door Desjardins en collega's20, en breed aangenomen vanwege de eenvoud, lage kosten en niet-invasieve aanpak 8,21,22,23,24. Deze test wordt meestal uitgevoerd als een eindpunttest, waarbij een muis een bepaalde hoeveelheid tijd doorbrengt in een kooi bekleed met een filterpapier, dat vervolgens wordt geanalyseerd door het aantal te tellen en de grootte van urinevlekken te beoordelen wanneer het filterpapier onder ultraviolet (UV) licht wordt geplaatst (de urinevlekken fluoresceren onder deze omstandigheden)20. Ondanks deze vele voordelen heeft de traditionele VSA enkele grote beperkingen. Omdat muizen vaak in dezelfde gebieden plassen, moeten onderzoekers de duur van de test beperken tot een relatief korte periode (≤4 uur)25. Zelfs wanneer de VSA over kortere tijdsperioden wordt uitgevoerd, is het bijna onmogelijk om kleine lege plekken (SVS'en) op te lossen die over grote lege plekken vallen of om SVS'en te onderscheiden van de overdracht van urine die aan staarten of poten is gehecht. Het is ook erg moeilijk om te onderscheiden of SVS'en een gevolg zijn van frequente maar individuele ledigingsgebeurtenissen (een fenotype dat vaak wordt waargenomen als reactie op cystitis 4,26), of als gevolg van post-mictie dribbelen (een fenotype geassocieerd met obstructie van de blaasuitlaat 27). Bovendien beperkt de wens om de test tijdens werkuren te voltooien, in combinatie met moeilijkheden om toegang te krijgen tot huisvestingsfaciliteiten wanneer de lichten worden uitgeschakeld, deze tests vaak tot de lichtperiode van de circadiane cyclus van 24 uur. Deze tijdsbeperkingen voorkomen dus de evaluatie van het ledigingsgedrag van muizen tijdens hun actieve nachtfase, waardoor het vermogen om specifieke genen of behandelingen te analyseren die worden bepaald door circadiane ritmes, wordt verminderd.

Om een aantal van deze beperkingen te overwinnen, hebben onderzoekers alternatieve methoden ontwikkeld om het ledigingsgedrag in realtime te beoordelen 26,28,29,30,31,32. Sommige van deze benaderingen omvatten het gebruik van dure apparatuur zoals metabole kooien26,28,29, of het gebruik van thermische camera's 30; Ook deze hebben echter beperkingen. In metabole kooien heeft urine bijvoorbeeld de neiging zich te hechten aan de draden van de gaasvloer en aan de wanden van de trechter, waardoor de hoeveelheid urine die wordt verzameld en gemeten, wordt verminderd. Het kan dus moeilijk zijn om nauwkeurig gegevens over kleine holtes te verzamelen. Bovendien geven metabole kooien geen informatie over de ruimtelijke verdeling van de ledigingsgebeurtenissen (d.w.z. urineren in de hoeken versus het midden van de kamer). Aangezien infraroodstraling met een lange golflengte die door de thermografische camera's wordt gebruikt, niet doordringt in vaste stoffen, moet de ledigingsactiviteit die wordt beoordeeld door videothermografie worden uitgevoerd in een open systeem, wat een uitdaging kan zijn met actieve muizen, omdat ze enkele centimeters in de lucht kunnen springen. Een ander systeem is de geautomatiseerde voided beits on paper (aVSOP) approach33, die bestaat uit gewalst filterpapier dat met een constante snelheid onder de gaasvloer van een muizenkooi terechtkomt. Deze aanpak voorkomt papierschade en de overlap van urinevlekken die voorkomen in de klassieke VSA, en de implementatie ervan stelt de onderzoeker in staat om experimenten gedurende meerdere dagen uit te voeren. Het biedt de onderzoeker echter geen precieze timing van de voiding-gebeurtenissen en er is geen mogelijkheid om gedrag te onderzoeken en hoe het correleert met spotting. Om deze informatie te verkrijgen, hebben onderzoekers videomonitoring opgenomen in voiding-assays, een aanpak die de gelijktijdige beoordeling van muisactiviteit en urinegebeurtenissen mogelijk maakt31,32. Eén benadering bestaat uit het plaatsen van een blauw licht emitterende diode (LED) en een videocamera met een groen fluorescentie-eiwitfilter onder de experimentele kooi om de ledigingsgebeurtenissen te visualiseren, en een infrarood-LED en een videocamera boven de kooi om muispositie32 vast te leggen. Deze opstelling is gebruikt om het ledigingsgedrag te controleren tijdens het uitvoeren van vezelfotometrie; De fel verlichte omgeving van dit systeem vereiste echter dat de onderzoekers hun muizen behandelden met een diureticum om lediging te stimuleren. In een ander experimenteel ontwerp werden groothoekcamera's boven en onder de experimentele kooi geplaatst om respectievelijk de motorische activiteit van de muis en de plasgebeurtenissen te visualiseren. In dit geval werden urinevlekken afgezet op een filterpapier dat de vloer van de kooi bekleedde, onthuld door het filterpapier te verlichten met UV-lampen die onder de kooiwaren geplaatst 31. Deze opstelling werd gebruikt in korte assays, 4 minuten lang, tijdens de lichte fase van de dag om de hersenstamneuronen te bestuderen die betrokken zijn bij vrijwillig ledigingsgedrag31. De geschiktheid van dit systeem voor gebruik tijdens de donkere fase of voor perioden >4 minuten werd niet gemeld.

In dit artikel wordt een methode beschreven die de traditionele VSA verbetert door langdurige videomonitoring van muisledigingsgedrag mogelijk te maken. Deze kosteneffectieve aanpak biedt tijdelijke, ruimtelijke en volumetrische informatie over ledigingsgebeurtenissen gedurende langere tijd tijdens de lichte en donkere fasen van de dag, samen met details met betrekking tot muisgedrag 3,4,34. Gedetailleerde informatie voor de bouw van de ledigingskamers, de implementatie van een real-time VSA (RT-VSA) en de analyse van de gegevens wordt verstrekt. De RT-VSA is waardevol voor onderzoekers die de fysiologische mechanismen willen begrijpen die de functie van het urinewegstelsel regelen, farmacologische benaderingen willen ontwikkelen om mictie te beheersen en de moleculaire basis van ziekteprocessen willen definiëren die de lagere urinewegen beïnvloeden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urotheliale piëzo1 /2 dubbele knock-out muizen (Pz1/2-KO, genotype: Piezo1 fl/fl; Piëzo2 fl/fl; Upk2CRE+/-) en controles (Pz1/2-C, genotype: Piezo1 fl/fl; Piëzo2 fl/fl; Upk2CRE-/-) werden intern gegenereerd uit ouderstammen verkregen uit de Jax-laboratoria (Piezo1 fl/fl stam # 029213; Piezo2 fl/fl soort # 027720; Upk2CRE+/- stam # 029281). Zowel vrouwelijke (1,5-3 maanden oud en 17-20 g in gewicht) als mannelijke (2-4 maanden oud en 23-29 g in gewicht) muizen werden gebruikt in de experimenten. Voor cyclofosfamide-geïnduceerde cystitis-experimenten werden wild-type C57Bl / 6J-vrouwtjes (3 maanden oud en ~ 20 g in gewicht) gebruikt (de Jackson-laboratoria, stam # 000664). Dieren werden gehuisvest en de experimenten werden uitgevoerd aan de University of Pittsburgh Animal Care Facility onder goedkeuring van de University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met relevante richtlijnen en voorschriften van het GGD-beleid humane zorg en gebruik van proefdieren en de Dierenwelzijnswet.

1. Assemblage van kooien voor real-time void spot assay (RT-VSA)

  1. De RT-VSA-rig bestaat uit een UV-standaard met twee UV-lampen en twee groothoekcamera's (onderste camera's), die worden gebruikt om ledigingsactiviteit tijdens de lichtfase van de dag te registreren. Schik twee muiskamers om op de standaard te rusten. Bevestig groothoekcamera's (bovenste camera's) aan het deksel van elke muiskamer, die worden gebruikt om ledigingsactiviteit tijdens de donkere fase van de dag vast te leggen (figuur 1A).
  2. Construeer het frame van de UV-standaard en muiskamers van 1 in x 1 in T-sleuf aluminium profielen. Zie tabel 1 voor een lijst van de componenten die zijn gebruikt om twee muiskamers en de UV-standaard te bouwen en figuur 1B-D voor de verschillende weergaven van de geassembleerde componenten en afmetingen.
  3. Bouw elke muiskamer met acht T-sleuf aluminium profielen gesneden tot 10 in en vier gesneden tot 14,75 inch. Begin met het monteren van de onderkant van de muiskamer en gebruik standaard eindbevestigingen (tabel 1) om de T-sleufprofielen te monteren volgens figuur 1. Monteer het 38,5 cm x 26,5 cm UV-doorlatende acrylaat in het interne kanaal van de profielen om de vloer van de muiskamers te bouwen.
    OPMERKING: Voor gedetailleerde informatie over het monteren van de T-sleufprofielen met standaard eindbevestigingen, gaat u naar de webpagina van het bedrijf.
  4. Bouw de wanden van de muiskamer met de rest van de profielen. Monteer de 38,5 cm x 21,5 cm en 26,5 cm x 21,5 cm slijtvaste (AR) polycarbonaatpanelen in de profielen om de buitenwanden van de muizenkamer te monteren. Gebruik de 37,5 cm x 23,9 cm en 24,4 cm x 23,9 cm AR polycarbonaat panelen om de binnenkant van de muiskamer te bouwen.
  5. Bevestig de AR polycarbonaat panelen met standaard eindbevestiging 1/4-20 loopvlak. Zie de instructies voor het monteren van de panelen in de profielen op de webpagina in de OPMERKING van stap 1.3. Gebruik commerciële siliconenkit om de verbindingen tussen de interne panelen af te dichten.
  6. Gebruik twee 12 inch en twee 14.75 in T-sleufprofielen om het deksel van de kooi te monteren zoals aangegeven in figuur 1B. Monteer een 38,5 cm x 26,5 cm AR polycarbonaat paneel in het interne kanaal van de profielen om het deksel te voltooien.
  7. Monteer de 12 in cameraprofielsteun loodrecht op de lange assen van de bovenkant van de kooi en bevestig met twee lite-overgang in hoekbeugels (gemarkeerd met 3 in figuur 1B). Gebruik een rechte vlakke plaat (gemarkeerd met 2) als ondersteuning voor webcammontage en monteer deze zoals weergegeven in figuur 1B. Bevestig de camera aan de steun met de bevestigingsschroef van de camera.
  8. Gebruik het standaard lift-off scharnier van de 10-serie rechts om het deksel aan het lichaam van de muiskamer te bevestigen (gemarkeerd met 1 in figuur 1B).
  9. Bouw de UV-standaard met vier T-sleufprofielen gesneden tot 40 inch, vier T-sleufprofielen gesneden tot 32 inch en vier T-sleufprofielen gesneden tot 10 inch, volgens figuur 1C, D. Monteer een acrylspiegelplaat van 82,5 cm x 26,5 cm in de profielen om de onderkant van de UV-kamer te bouwen.
  10. Gebruik de 82,5 cm x 30,5 cm en 26,5 cm x 30,5 cm acryl spiegelplaat om de wand van de UV-standaard te construeren.
  11. Bevestig de 10-serie vijfgats T-vlakke platen (gemarkeerd met 2 in figuur 1 C), de 10-serie vijfgats L-vlakke platen (gemarkeerd met 3 in figuur 1 C) en de 10-serie vijfgats T-platte platen (gemarkeerd met 1 in figuur 1C) om de UV-standaard vast te zetten.
  12. Monteer de onderste camera's in een T-sleufprofiel dat tot 32 inch is gesneden en bevestig aan de onderkant van de standaard met twee lite-overgangshoekbeugels zoals weergegeven in figuur 1D. Gebruik rechte platte platen om de webcams aan het T-sleufprofiel te bevestigen.
  13. Monteer de UV-lampen aan de binnenkant, de voor- en achterkant en bevestig ze aan de rechte vlakke platen zoals weergegeven in figuur 1D.
  14. Sluit de vier webcams aan op de USB-poorten van een computer met videobewakingssoftware.

2. Huisvesting van dieren voorafgaand aan experimenten

  1. Huisexperimentele muizen, speciaal gefokt of verkregen van een externe site, in groepen van vier. Gebruik indien mogelijk op leeftijd afgestemde vrouwelijke of mannelijke muizen voor deze experimenten. Als dieren worden verkregen uit een externe bron, laat ze dan minstens 7 dagen acclimatiseren voordat ze experimentele procedures uitvoeren.
  2. Plaats de dieren gedurende hun tijd in de dierenfaciliteit in standaardkooien met strooisel en verrijking (bijv. Plastic iglo, wiel, stuk papier om te versnipperen) en houd ze onder een dag/ nachtcyclus van 12 uur, met toegang tot water en droge muizenchow ad libitum.

3. RT-VSA opnames tijdens de lichte en donkere fasen van de dag

OPMERKING: Het onderstaande protocol beschrijft het gebruik van RT-VSA om het ledigingsgedrag van muizen tijdens de lichte en donkere fasen van de dag te beoordelen. De dieren worden gehouden op een 12 uur lichte en 12 uur donkere cyclus met Zeitgeber tijd (ZT) = 0 om 07:00 uur. De opnames starten tussen 10.30 en 11.00 uur (ZT = 3.5-4.0) voor de lichtfase-experimenten en tussen 18.00 en 18.30 uur (ZT = 11.0-11.5) voor de donkere fase-experimenten. Wanneer dieren onder beide omstandigheden worden getest, worden experimenten meestal op twee afzonderlijke dagen uitgevoerd, met ten minste 5 opeenvolgende dagen tussen de lichte en donkere tests. Experimenten mogen niet worden uitgevoerd op dagen dat de dierenkamers worden schoongemaakt of de kooien worden vervangen, omdat deze kunnen leiden tot spanningen die het ledigingsgedrag beïnvloeden. Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder omstandigheden van minimale stress voor de muizen.

  1. Vervoer de proefdieren van hun huisvestingslocatie naar de procedureruimte waar de RT-VSA-opnamekamers zich bevinden.
  2. RT-VSA opnamekamer voorbereiding
    1. Plaats een stuk filterpapier (24,3 cm x 36,3 cm) in de bodem van elke RT-VSA-opnamekooi. Gebruik afhankelijk van het tijdstip van de dag dun (lichte fase experimenten) of dik (donkere fase experimenten) filterpapier.
      OPMERKING: Dik filterpapier wordt gebruikt tijdens de actieve donkere fase omdat het beter bestand is tegen versnippering dan dun filterpapier. Topcamera's worden gebruikt om urinevlekken te visualiseren die tijdens de donkere fase op dik filterpapier zijn afgezet. Tijdens de lichtfase worden daarentegen de onderste camera's gebruikt omdat het omgevingslicht voorkomt dat de bovenste camera's urinevlekken detecteren die op het filterpapier zijn afgezet. In dit geval wordt dun filterpapier gebruikt. We ontdekten dat de onderste camera's niet effectief zijn in het detecteren van kleine ledigingsgebeurtenissen die op dik filterpapier zijn afgezet.
    2. Plaats bovenop het filterpapier de volgende items: een plastic iglo (die een slaapruimte biedt), een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml voor verrijkingsdoeleinden en een plastic schaal van 60 mm x 15 mm met twee of drie stukjes muisdroog chow en 14-16 g water in de vorm van een gel-pack (niet-bevochtigende watergel; Figuur 2).
      OPMERKING: Het gebruik van 1,5 ml microcentrifugebuizen voor verrijkingsdoeleinden was specifiek voor de behuizing die in dit onderzoek werd gebruikt.
    3. Zodra de opnamekamers klaar zijn, plaatst u de experimentele muizen voorzichtig binnen door ze zachtjes op het filterpapier te leggen. Zorg ervoor dat de overdracht van de dieren van de huisvestingskooi naar de registratiekooien met minimale stress gebeurt.
    4. Zodra alle proefdieren zich in hun opnamekooien bevinden, met hun deksels gesloten, bedek je de bovenkant van de deksels met een absorberend blauw kussen om directe reflecties van omgevingslicht op het plexiglas dekseloppervlak te minimaliseren.
    5. Schakel de UV-lampen in de onderste kamer in.
      OPMERKING: De dieren hebben geen direct contact met het UV-licht. Het aanbevolen UV-licht wordt gedetailleerd beschreven in de sectie materialen.
  3. RT-VSA opnames
    1. Als u video van de bovenste en onderste camera's wilt opnemen, gebruikt u een videobewakingsopnamesoftware, die kan worden geconfigureerd om op te nemen van meerdere webcams of netwerkcamera's tegelijk.
    2. Start bij het openen van het programma de opname door op Command en R in het programmavenster te drukken. Voer video-opnamen uit met een snelheid van 1 frame per s.
    3. Onmiddellijk na het initiëren van de opnames, verlaat u de kamer en sluit u de deur voorzichtig. Zorg ervoor dat de ruimte stil blijft gedurende de gehele duur van het experiment.
  4. RT-VSA-opnames voltooien
    1. Keer terug naar de procedurekamer na 7 uur (lichtfase-experimenten) of de volgende ochtend (donkere fase-experimenten).
    2. Stop de opnames door op Command en T te drukken. Doe de UV-lampen uit.
    3. Na het stoppen van de opname genereert de software automatisch een filmbestand (in .m4v formaat) voor elke camera en slaat het op onder de naam van de camera in een eerder geselecteerde doelmap. Controleer of de experimenten in elke cameramap zijn geordend in mappen op datum.
    4. Controleer in elke datum-/experimentmap of er één .m4v bestand en alle afzonderlijke .jpeg bestanden zijn die overeenkomen met elk van de filmframes.
    5. OPMERKING: De .jpeg bestanden kunnen worden gebruikt om het experiment te herstellen voor het geval filmbestanden beschadigd raken.
    6. Maak een map op het bureaublad met de naam en datum van het experiment en breng alle .m4v bestanden over naar deze map. Verwijder indien nodig de .jpeg bestanden zodra de filmbestanden zijn opgeslagen en er een back-up van is gemaakt.
    7. OPMERKING: Voor lichtfase-experimenten genereert de software één film per camera, terwijl het voor donkerefase-experimenten twee films voor elke camera genereert. Dit komt omdat een nieuw .m4v bestand wordt gegenereerd na middernacht wanneer de datum verandert.
    8. Kopieer de map met de films naar een flashstation voor analyse op een externe computer. Deze stap kan enkele minuten duren en kan parallel aan de stappen 3.5.1 tot en met 3.5.3 worden uitgevoerd.
  5. Reiniging van opnamekooien en terugplaatsing van experimentele muizen naar hun huisvestingslocatie
    1. Verwijder het bluepad dat de deksels van de kooien bedekt. Breng de dieren over van de registratiekooien naar hun huisvestingskooi.
    2. Verwijder de accessoires en voedingsmiddelen in de opnamekamers (d.w.z. plastic iglo's, plastic buizen, schaal met resten van chow en watergel en filtreerpapier) en gooi ze weg bij biologisch gevaarlijk afval.
    3. Reinig de kooien met een handstofzuiger en verwijder chow en fecale pellets die op de bodem van de kooi aanwezig zijn. Spuit vervolgens de vloer en binnenwanden van de kooi met 70% ethanol en reinig het interieur met een stuk zachte doek. Laat het deksel van de kooien open om ze aan de lucht te laten drogen.
    4. Plaats de opvangkooi met de dieren in een secundaire container en vervoer de dieren terug naar hun huisvestingslocatie.

4. Genereren van kalibratiecurven

OPMERKING: Een kalibratiecurve is nodig om lege plekken om te zetten in urinevolumes. Als u experimenten uitvoert tijdens de lichte en donkere fasen van de dag, moeten twee kalibratiecurven worden gegenereerd, één voor elk type filterpapier dat wordt gebruikt (dun en dik filterpapier). Kalibratiecurven worden in tweevoud gegenereerd. Elke replicatie wordt uitgevoerd op een filterpapier dat in een RT-VSA-opnamekamer wordt geplaatst. Gezien de complexe samenstelling en UV-prikkelbaarheid, gebruikt u muizenurine om de kalibratiecurven te maken.

  1. Urineverzameling van muizen
    1. Neem een stuk flexibele transparante folie (10 cm x 15 cm) en leg deze op een bankje.
    2. Kies een muis bij zijn staart en krab hem. Masseer zachtjes de onderbuik om plassen op te wekken. Verzamel urine op het oppervlak van de transparante film plastic vel.
    3. Laat het dier voorzichtig los in zijn kooi. Breng met behulp van een pipet de urine over van het oppervlak van de transparante film naar een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml. Herhaal de procedure met meerdere muizen totdat ~ 10 ml muizenurine is verzameld, pool de urine en bewaar bij -20 ° C.
      OPMERKING: Een totaal van ~ 10 ml muizenurine is vereist om dubbele kalibratiecurven te genereren voor de lichte en donkere fasen. Om stress bij experimentele muizen te voorkomen, mag u geen muizen gebruiken die worden onderworpen aan RT-VSA-experimenten voor urineverzameling.
  2. Opnames van kalibratiecurves
    1. Ontdooi de urine verzameld in stap 4.1 en meng het door zachtjes te vortexen gedurende 10-15 s.
    2. Plaats een stuk dun filterpapier (24,3 cm x 36,3 cm) in elk van de twee RT-VSA-opnamekooien.
    3. Pipetteer de volgende urinevolumes (in μL) op elk van de filterpapieren: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 en 750. Om overlapping van vlekken als gevolg van diffusie te voorkomen, wijst u de vlekken op voldoende afstand van elkaar toe.
    4. Sluit het deksel van de kooien en bedek ze met pads.
    5. Begin met opnemen door op Command en R te drukken en dezelfde softwareparameters toe te passen die worden gebruikt om de experimenten op te nemen (stap 3.3.).
    6. Registreer de kalibratiecurve gedurende 1 uur om maximale diffusie van de urinevlekken mogelijk te maken. Druk op Command en T om de opname te stoppen.
    7. Maak een nieuwe map op het bureaublad, plaats de .m4v bestanden erin en breng de gegevens vervolgens over naar een flashstation voor verdere analyse.
    8. Voer een vergelijkbare procedure uit om dubbele curven te genereren met dik filterpapier. Voeg in dit geval extra lagen pads toe om het interieur donkerder te maken en donkere faseomstandigheden te simuleren.
  3. Analyse van de kalibratiecurve-opnamen
    1. Open de .m4v bestanden in een filmspelersoftware en maximaliseer het venster om het scherm te vullen. Om de kalibratiecurven op dik filterpapier te analyseren, gebruikt u de bestanden die zijn verkregen met de bovenste camera's (figuur 3A). Om de kalibratiecurven op dun filterpapier te analyseren, gebruikt u de bestanden die zijn verkregen met de onderste camera's (figuur 3B).
    2. Speel het .m4v bestand af en beweeg de tijdschuifregelaar naar voren en naar achteren om een overzicht te krijgen van de volledige kalibratiecurvefilm van 1 uur.
    3. Identificeer het tijdsbereik waar de kleinere urinevlekken (<25 μL) de grootste intensiteit hebben en zich maximaal hebben verspreid. Maak een screenshot binnen dit tijdsbereik. Geef het screenshotbestand een naam en sla het op als een .png bestand (Figuur 3A, bovenpaneel).
      OPMERKING: Screenshots worden gemaakt door op de toets F6 te drukken. Als u F6 wilt instellen voor het verkrijgen van schermafbeeldingen, selecteert u: Systeemvoorkeuren > Toetsenbord > Sneltoetsen en schrijft u F6 in het vak rechts van de optie Afbeelding van scherm opslaan als bestand .
    4. Identificeer het tijdsbereik waar de middelgrote en grote urinevlekken (>50 μL) een maximaal oppervlak hebben en maak een screenshot. Het is mogelijk dat sommige van de kleinere urinevlekken niet zichtbaar zijn tegen de tijd dat de grotere urinevlekken maximale diffusie vertonen. Geef het bestand een naam en sla de schermafbeelding op als een .png bestand (Afbeelding 3A, onderste paneel).
    5. Open de ImageJ-software (NIH) en sleep vervolgens het pictogram van het .png-bestand dat is verkregen in stap 4.3.3 om het afbeeldingsbestand te openen (Figuur 4A).
    6. Selecteer op de werkbalk het pictogram Polygoonselecties en baken de rand van het filterpapier af.
    7. Selecteer vervolgens Analyseren in de menubalk, kies Metingen instellen in het uitgevouwen menu en selecteer Gebied in het venster dat verschijnt. Klik op OK. Dit maakt het mogelijk om waarden van het gebied te verkrijgen wanneer stap 4.3.8 wordt uitgevoerd.
    8. Selecteer vervolgens opnieuw Analyseren in de menubalk en kies Meten uit de uitgevouwen opties. Er verschijnt een resultatenvenster met een kolomgebied met de gebiedswaarden in pixel2 (figuur 4B-D).
    9. Selecteer het pictogram Selecties uit de vrije hand op de werkbalk en gebruik het om een lijn te tekenen rond de omtrek van een afzonderlijke leegteplek. Meet het gebied zoals in stap 4.3.8. De software werkt de resultatentabel bij wanneer nieuwe metingen worden uitgevoerd. De nieuwe reeks getallen wordt onder de vorige weergegeven. Noteer het nummer dat wordt weergegeven onder het kolomgebied van het resultatenvenster voor elke geanalyseerde plek (figuur 4E-G).
    10. Herhaal stap 4.3.5 tot en met 4.3.7 voor elk van de replicatievlekken.
    11. Stel de totale oppervlakte van het filterpapier in op 100% en bereken het percentage oppervlakte (% oppervlakte) voor elke urinevlek. Deze normalisatie corrigeert fouten die kunnen optreden als gevolg van verschillen in de zoom of positionering van de camera's.
    12. Maak een nieuwe XY-tabel in een grafisch programma en voeg de waarden van het urinevolume (in μL) in de X-kolom en de dubbele waarden van het % -gebied in de Y-kolom in.
    13. Selecteer vervolgens Analyse > Analyseer > XY-analyse > Niet-lineaire regressie (curve fit). Selecteer in het venster parameters dat verschijnt Model > Polynoom > Tweede-Orde Polynoom (kwadratisch).
    14. Klik vervolgens op het tabblad Methode om de volgende selecties te markeren: Regressie van de kleinste kwadraten, Geen weging en Beschouw elke replicerende Y-waarde als een afzonderlijk punt.
    15. Selecteer op het tabblad Beperkingen de optie voor B0, Type beperking > Constante gelijk aan en typ 0 onder de kolom Waarde. Klik op OK.

5. Analyse van de experimentele muizenopnamen

  1. Open een filmbestand dat is verzameld tijdens de lichte fase (onderste camera) of donkere fase (bovenste camera) voor analyse.
  2. Beoordeel de kwaliteit van het filmbestand door de tijdscroller naar voren en naar achteren te bewegen en te bevestigen dat het filterpapier intact blijft (zonder scheuren of kauwen) tijdens het te analyseren tijdvenster van 6 uur. Als het papier is gescheurd, voer dan geen verdere analyse uit, omdat de muis mogelijk op het blootgestelde plastic heeft geplast dat niet kan worden gekwantificeerd (figuur 5).
  3. Als u experimenten wilt analyseren die in de lichte of donkere fase zijn verzameld, gebruikt u de opdracht vooruitspoelen of de schuifregelaar voor de tijdbalk om naar het gewenste tijdvenster te gaan. De ledigingsactiviteit tijdens de lichtfase wordt geregistreerd tussen 11.00 en 17.00 uur (ZT = 4.0-10.0) en tijdens de donkere fase tussen middernacht en 06.00 uur (ZT = 17.0-23.0).
  4. Speel de film af in de vooruitspoelmodus door op het pictogram >> te klikken (of blader handmatig door de film), op zoek naar bewijs dat de muis leegloopt. De eenvoudigste manier om te zien dat dit gebeurt, is door te zoeken naar de plotselinge verschijning van heldere vlekken van urine op het filterpapier. Een andere indicator is om te zoeken naar gedragsveranderingen, waaronder beweging naar de hoeken van de kooi en een korte periode van inactiviteit wanneer de muis leegloopt.
    OPMERKING: Naarmate men beter wordt in het detecteren van leegtes, kan men de snelheid van scrollen of snel doorsturen verhogen. Bij muizen met bacteriële en chemisch geïnduceerde cystitis, die zeer grote aantallen kleine holteshebben 4,34, kan men echter ledigingsgebeurtenissen missen als men te snel door de film beweegt.
  5. Registreer het tijdstip waarop elke leegte optreedt. Volgens afspraak wordt de tijd van de leegte geregistreerd bij het eerste teken dat urine wordt gedetecteerd (figuur 6A,B).
  6. Om metingen van de leegte te doen, gebruikt u eerst de schuifbalk om vooruit (of achteruit) in de tijd te gaan, op zoek naar het moment waarop maximale diffusie van de urinevlek heeft plaatsgevonden. Pauzeer de film op dit punt en maak een screenshot zoals beschreven in stap 4.3.3. Plaats de pijl van de computermuis op de plek die wordt geanalyseerd, zodat de plek van belang wordt gemarkeerd in de schermafbeelding (figuur 6C, D).
  7. Geef het screenshotbestand een naam met behulp van correlatieve getallen om rekening te houden met de volgorde van verschijning in de film.
  8. Ga verder met het analyseren van het bestand en herhaal stap 5.5 en 5.7 voor elke lege plek in de film. Zodra alle lege plekken zijn geanalyseerd, meet u de totale oppervlakte van het filterpapier door een screenshot te maken en de stappen te gebruiken die worden beschreven in 4.3.6.
  9. Bereken het % gebied van elk van de urinevlekken zoals beschreven in stap 4.3.9. Zet de waarden van het % gebied om in het volume urine (μL) voor elke lege plek met behulp van de kalibratiecurven die in stap 4 zijn gegenereerd en de interpolatiefunctie in de grafische software.
    1. Open in de grafische software de XY-tabel met de gegevens van de kalibratiecurve en voeg de % oppervlaktewaarden in de Y-kolom in onder de laatste waarde van de kalibratiecurve (figuur 7A).
    2. Klik op het tabblad Tabel met resultaten en klik onder het tabblad Model om Onbekenden interpoleren in standaardcurve te selecteren en druk op OK. Er wordt een tabblad met de naam geïnterpoleerde X-gemiddelde waarden weergegeven naast het tabblad Resultatentabel. Dit tabblad bevat een tabel met de geïnterpoleerde waarden die overeenkomen met het volume urine in μL voor elke lege plek. (Figuur 7A,B).
  10. Herhaal stap 5.1 tot en met 5.9 om alle experimentele muizen te analyseren.
  11. Maak een werkmapbestand met de gegevens die zijn verkregen uit stap 5.5 tot en met 5.10, met één spreadsheet per muis (afbeelding 7C). Maak een bestand voor de lichtfase-experimenten en een ander voor de donkere fase-experimenten. Deze masterbestanden bevatten alle ruwe gegevens en noodzakelijke berekeningen die worden gebruikt in verdere analyses.

6. Analyse van het urinepatroon van experimentele muizen

  1. Genereer primaire en secundaire lege vlekprofielen (figuur 8A, B en figuur 9).
    OPMERKING: Volgens frequentieverdelingsstudies 23 vertegenwoordigen lege plekken met een ≥ 20 μL doorgaans >95% van het totale lege volume en worden ze beschouwd als primaire lege plekken (PVS's)8,23,35. Lege plekken die ≤ 20 μL zijn, worden beschouwd als secundaire of kleine lege plekken (SVS'en). Discriminatie tussen PVS'en en SVS'en is een nuttige benadering gebleken om voiding-fenotypen te karakteriseren. Een verhoogd aantal SVS'en duidt op voiding dysfunction35.
    1. Classificeer de vlekken uit het hoofdbestand met belanghebbende voiding-spotgegevens (lichte fase of donkere fase) op basis van hun volume als PVS'en wanneer hun volume ≥ 20 μL is, of SVS'en wanneer hun volume < 20 μL is.
    2. Tel het aantal en bereken het gemiddelde ongeldige volume en het totale volume voor de PVS'en. Tel het aantal en bereken het totale volume voor de SVS'en.
    3. Genereer een grafiekbalk die de controle vergelijkt met de behandelde muizen voor elk van de berekende parameters: aantal PVS'en, ongeldig gemaakt volume PVS'en, totaal volume PVS'en, aantal SVS'en, totaal volume SVS'en.
  2. Optioneel: Genereer een cumulatief leeggemaakt volumeplot (trapfunctie) om het ledigingsgedrag in de loop van de tijd weer te geven (figuur 10 en figuur 11).
    1. Open het hoofdbestand van de werkmap en converteer de tijd van ongeldigheid, die wordt uitgedrukt in uren, minuten en seconden, naar de decimale vorm. Bereken het cumulatieve urinevolume (in μL) voor elk tijdspunt.
    2. Genereer een XY-tabel in de grafische software met tijd in decimale vorm in de X-kolom en cumulatieve urinevolumes in de Y-kolom. Kopieer de tijd- en urinevolumegegevens naar de tabel. Voeg (0; 0) en (6; maximale waarde) gegevenspunten toe. Deze punten zijn nodig om de horizontale lijnen van het waarnemingspunt te voltooien aan het begin van het experiment (tijd: 0 uur) wanneer het lege volume nul is (0; 0), en aan het einde van het experiment (tijd: 6 uur) wanneer de cumulatieve waarde van de geleegde urine gelijk is aan de waarde die is verkregen voor de laatste ledigingsgebeurtenis (6; maximale waarde).
    3. Dubbelklik op de grafiek; Het venster Grafiek opmaken zou moeten verschijnen. Selecteer het tabblad Vormgeving , klik om de knop voor Symbolen weergeven op te heffen en klik om Verbindingslijn/curve weergeven te selecteren. Klik op de optie Stijl en selecteer Overleven.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ledigingsgedrag van urotheliale piëzo1/2 knock-out muizen

Tijdens de opslagfase van de mictiecyclus wordt verondersteld dat het urotheel de spanning waarneemt die wordt uitgeoefend door de urine die zich in de blaas heeft opgehoopt en om deze mechanische stimulus om te zetten in cellulaire reacties zoals serosale ATP-afgifte 1,3. We hebben eerder aangetoond dat mechanisch geactiveerde PIEZO1- en PIEZO2-kanalen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De integratie van videobewaking is een kosteneffectieve wijziging die verschillende voordelen biedt ten opzichte van de klassieke VSA. In de klassieke VSA, die meestal wordt gebruikt als eindpunttest, is het moeilijk om overlappende leegteplekken te onderscheiden. Dit is geen triviale zorg, omdat muizen de neiging hebben om meerdere keren in hetzelfde gebied te plassen wanneer de test enkele uren wordt verlengd, meestal in de hoeken van hun kooi. Het eerste voordeel van RT-VSA is dus dat de onderzoeker gemakkelijk indivi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een NIH-subsidie R01DK119183 (aan G.A. en M.D.C.), een proefprojectprijs via P30DK079307 (aan M.G.D.), een American Urology Association Career Development award en een Winters Foundation-beurs (aan N.M.), en door de Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores van het Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches80/201010Aantal: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches80/201010Aantal: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches80/201010Aantal: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches80/201010Aantal: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches80/201010Aantal: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut80/203280Aantal: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut80/203287Aantal: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support80/2014061Aantal: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate80/204118Aantal: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate80/204081Aantal: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate80/204080Aantal: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate80/204140Aantal: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly80/202064Aantal: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket80/204509Aantal: 6
24”-long UV tube lightsADJ Products LLCT8-F20BLB24Aantal: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror SheetProfesional PlasticsAantal: 1
82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror SheetProfesional PlasticsAantal: 2
26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror SheetProfesional PlasticsAantal: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Aantal: 2
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Aantal: 4
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Aantal: 4
4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Aantal: 4
4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Aantal: 4
4.5mm Thick, Clear, 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper) Thermo Fisher Scientific57144
Cosmos blotting paper (thick paper)Blick Art Materials10422-1005
ExcelMicrosoft Corporation
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.4.0graphing and statistics software
ImageJ FIJINIH
ParafilmMercktransparent film
Quick Time Player 10.5 software Applemultimedia player
Security spyBen softwarevideo surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-2080/203381Aantal: 80
UV transmitting acrylicSpartechPolycast Solacryl SUVTAantal: 2
38.5 cm x 26.5 cm 
Water gel: HydroGelClearH2O  70-01-5022(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
WebcamLogitechC930eAantal: 4

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621(2020).
  2. de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327(2015).
  3. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), (2021).
  4. Montalbetti, N., et al. Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1(2022).
  5. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070(2015).
  6. Montalbetti, N., et al. Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents. eNeuro. 4 (3), (2017).
  7. Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction. Scientific Reports. 9 (1), 5509(2019).
  8. Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160(2020).
  9. Bartolone, S. N., et al. Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).
  10. de Rijk, M. M., et al. Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium. International Neurourology Journal. 26 (2), 111(2022).
  11. Coyne, K. S., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL. Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230(2013).
  12. Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. Diabetic bladder dysfunction: a review. Urology. 123, (2019).
  13. Irwin, D. E., et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study. European Urology. 50 (6), 1314(2006).
  14. Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review. The Journal of Urology. 177 (2), 450(2007).
  15. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1(2014).
  16. Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion. International Journal of Urology. 21, 79(2014).
  17. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89(2014).
  18. Rosen, J. M., Klumpp, D. J. Mechanisms of pain from urinary tract infection. International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26(2014).
  19. Birder, L., et al. Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms. Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128(2010).
  20. Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns. Science. 182 (4115), 939(1973).
  21. Sugino, Y., et al. Voided stain on paper method for analysis of mouse urination. Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548(2008).
  22. Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).
  23. Rajandram, R., et al. Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).
  24. Ruetten, H., et al. A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31(2021).
  25. Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).
  26. Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume. The Journal of Urology. 165 (2), 653(2001).
  27. Dmochowski, R. R. Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology. 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).
  28. Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice. Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101(2013).
  29. Wang, Z., et al. Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170(2019).
  30. Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. Micturition video thermography in awake, behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449(2020).
  31. Keller, J. A., et al. Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter. Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).
  32. Hou, X. H., et al. Central control circuit for context-dependent micturition. Cell. 167 (1), 73(2016).
  33. Negoro, H., et al. Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm. Nature Communication. 3, (2012).
  34. Montalbetti, N., Carattino, M. D. Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).
  35. Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).
  36. Dalghi, M. G., et al. Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303(2019).
  37. Birder, L., Andersson, K. E. Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome. International Neurourology Journal. 22, (2018).
  38. Okinami, T., et al. Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis. PLoS One. 9 (8), (2014).
  39. Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), (2017).
  40. Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock. The Journal of Urology. 190 (3), (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Void Spot AssayReal Time VSAVoiding BehaviorMouse ModelsUrine Spot AnalysisVoluntary MicturitionVideo MonitoringBladder FunctionUrethral SphincterCyclophosphamide Treatment

Related Articles