Expansiemicroscopie gebruiken om Drosophila-embryo's in het geheel fysiek te vergroten voor beeldvorming met superresolutie

Samenvatting

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implementatie van expansiemicroscopie in vroege Drosophila-embryo's om beeldvorming met superresolutie te bereiken met behulp van een conventionele confocale microscoop met laserscanning.

Samenvatting

Het werkpaard van de ontwikkelingsbiologie is de confocale microscoop, waarmee onderzoekers de driedimensionale lokalisatie van gelabelde moleculen in complexe biologische monsters kunnen bepalen. Terwijl traditionele confocale microscopen het mogelijk maken om twee aangrenzende fluorescerende puntbronnen op te lossen die zich een paar honderd nanometer uit elkaar bevinden, vereist het observeren van de fijnere details van subcellulaire biologie het vermogen om signalen in de orde van tientallen nanometers op te lossen. Er zijn tal van op hardware gebaseerde methoden voor superresolutiemicroscopie ontwikkeld om onderzoekers in staat te stellen dergelijke resolutielimieten te omzeilen, hoewel deze methoden gespecialiseerde microscopen vereisen die niet voor alle onderzoekers beschikbaar zijn. Een alternatieve methode om het oplossend vermogen te vergroten, is door het monster zelf isotroop te vergroten door middel van een proces dat bekend staat als expansiemicroscopie (ExM), dat voor het eerst werd beschreven door de Boyden-groep in 2015. ExM is niet per se een soort microscopie, maar eerder een methode om een monster op te zwellen met behoud van de relatieve ruimtelijke organisatie van de samenstellende moleculen. Het geëxpandeerde monster kan vervolgens met een effectief verhoogde resolutie worden waargenomen met behulp van een traditionele confocale microscoop. Hier beschrijven we een protocol voor het implementeren van ExM in Drosophila-embryo's met de hele mont, dat wordt gebruikt om de lokalisatie van Par-3, myosine II en mitochondriën in de oppervlakte-epitheelcellen te onderzoeken. Dit protocol levert een ongeveer viervoudige toename van de steekproefomvang op, waardoor subcellulaire details kunnen worden gedetecteerd die niet zichtbaar zijn met conventionele confocale microscopie. Als bewijs van het principe wordt een anti-GFP-antilichaam gebruikt om verschillende pools van myosine-GFP te onderscheiden tussen aangrenzende celcortex, en fluorescerend gelabeld streptavidine wordt gebruikt om endogene gebiotinyleerde moleculen te detecteren om de fijne details van de mitochondriale netwerkarchitectuur te onthullen. Dit protocol maakt gebruik van gemeenschappelijke antilichamen en reagentia voor fluorescentie-etikettering en zou compatibel moeten zijn met veel bestaande immunofluorescentieprotocollen.

Inleiding

In de cel- en ontwikkelingsbiologie is zien geloven, en het vermogen om de lokalisatiepatronen van eiwitten nauwkeurig te bepalen is fundamenteel voor veel soorten experimenten. Laserscanning confocale microscopie is het standaardinstrument voor het afbeelden van fluorescerend gelabelde eiwitten in drie dimensies in intacte monsters. Conventionele confocale microscopen zijn niet in staat om aangrenzende fluorescerende signalen te onderscheiden (op te lossen) die worden gescheiden door minder dan de helft van de golflengte van het licht dat ze uitzenden¹. Met andere woorden, twee puntbronnen moeten worden gescheiden door ten minste 200-300 nm in de laterale richting (500-700 nm in de axiale richting) om ze op te lossen als twee verschillende signalen. Deze technische barrière staat bekend als de diffractielimiet en is een fundamentele hindernis voor studies van complexe subcellulaire structuren (bijv. de actomyosine-, cytoskeletale of mitochondriale netwerken) met ruimtelijke kenmerken onder de diffractielimiet. Daarom zijn technieken om het oplossend vermogen van conventionele confocale microscopen te vergroten van algemeen belang voor de biologische gemeenschap.

Om de diffractielimiet te omzeilen, zijn een aantal verschillende superresolutiemicroscopietechnologieën ontwikkeld die een resolutie in de orde van grootte van tientallen nanometers of minder ^1,2,3 mogelijk maken^, waardoor een wereld van biologische complexiteit wordt onthuld die voorheen alleen toegankelijk was via elektronenmicroscopie. Ondanks de voor de hand liggende voordelen van deze op hardware gebaseerde methoden, hebben microscopen met superresolutie vaak specifieke vereisten voor het labelen van monsters en lange acquisitietijden, waardoor hun flexibiliteit wordt beperkt, of ze zijn gewoon te duur voor sommige laboratoria om toegang te krijgen. Een alternatief voor op microscoop gebaseerde superresolutie is expansiemicroscopie (ExM), wat niet per se een type microscopie is, maar eerder een methode om een monster op te zwellen met behoud van de relatieve ruimtelijke organisatie van de samenstellende moleculen⁴. De isotroop geëxpandeerde monsters kunnen vervolgens met een effectief verhoogde resolutie worden waargenomen met behulp van een traditionele fluorescentieconfocale microscoop. ExM werd voor het eerst beschreven door de Boyden-groep in 2015⁵, en de basistechniek is sindsdien aangepast voor gebruik in een verscheidenheid aan experimenten ^6,7,8. ExM is ook aangepast voor gebruik in embryo's met een hele mont, met name in Drosophila 9,10,11, C. elegans¹² en zebravis ^13, waardoor het een krachtig hulpmiddel is voor ontwikkelingsbiologen.

ExM is gebaseerd op twee verschillende hydrogelchemie: 1) zwelbare polyelektrolythydrogels, die sterk in omvang toenemen wanneer ze in water worden gedrenkt¹⁴, en 2) polyacrylamidehydrogels, die een extreem kleine polymeerafstand hebben om isotrope monsterexpansie mogelijk te maken¹⁵. Hoewel er veel gepubliceerde ExM-protocollen zijn, delen ze over het algemeen de volgende stappen: monsterfixatie, etikettering, activering, gelering, spijsvertering en expansie⁴. De fixatieomstandigheden en fluorescentie-etiketteringsstrategieën zullen natuurlijk variëren op basis van de behoeften van het experiment en het systeem, en in sommige protocollen vindt etikettering plaats na expansie. De doelmoleculen in het monster moeten worden geprimed (geactiveerd) voor binding aan de hydrogel, wat kan worden bereikt met behulp van verschillende chemische stoffen⁴. Tijdens de geleringsstappen wordt het monster verzadigd met monomeren van de toekomstige hydrogel (natriumacrylaat, acrylamide en het cross-linker bisacrylamide), en de hydrogel wordt vervolgens gevormd door polymerisatie van vrije radicalen die wordt gekatalyseerd door een initiator, zoals ammoniumpersulfaat (APS), en een versneller, zoals tetramethyleendiamine (TEMED)⁴. Na gelering wordt het monster enzymatisch verteerd om de weerstand van het monster tegen zwelling te homogeniseren en de isotrope uitzetting van de hydrogel te garanderen⁴. Ten slotte wordt de verteerde hydrogel in water geplaatst, waardoor het uitzet tot ongeveer vier keer de oorspronkelijke lineaire grootte⁴.

Figuur 1: Overzicht van expansiemicroscopie in Drosophila embryo's. ExM is een protocol met meerdere stappen dat ten minste 4 dagen in beslag neemt. Het verzamelen, fixeren en devitelliniseren van embryo's duurt 1 dag of langer, afhankelijk van of embryo's uit meerdere collecties worden samengevoegd. Immunofluorescentie-etikettering duurt 1 dag of 2 dagen, afhankelijk van of de embryo's 's nachts worden geïncubeerd met de primaire antilichamen. Activering van het embryo, gelering, spijsvertering en expansie kunnen op één dag worden uitgevoerd. De gels kunnen direct na expansie worden gemonteerd en in beeld worden gebracht, hoewel het om praktische redenen vaak wenselijk is om de volgende dag met beeldvorming te beginnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Dit protocol beschrijft hoe ExM moet worden uitgevoerd op Drosophila-embryo's in het hele tot middenstadium¹⁶ om subcellulaire eiwitlokalisatiepatronen met superresolutie te visualiseren (Figuur 1). Deze methode maakt gebruik van methylacrylzuur N-hydroxysuccinimidylester (MA-NHS) chemie om eiwitmoleculen te activeren en te verankeren aan de hydrogel¹⁷, en het is een wijziging van een eerder gepubliceerd ExM-protocol voor gebruik in Drosophila-embryo's en -weefsels in een laat stadium¹¹. Dit protocol maakt gebruik van polydimethylsiloxaan (PDMS) putjes om de hydrogels te vormen en de uitwisseling van oplossingen tijdens activering en gelering te vergemakkelijken. Een alternatieve methode waarbij geen PDMS-putjes hoeven te worden gemaakt, is het laten zakken van embryo's die aan dekglaasjes zijn bevestigd in druppels monomeeroplossing die op een stuk laboratoriumafdichtingsfolie^{zitten 22}. Bovendien beschrijft dit protocol een methode voor het handmatig verwijderen van het ondoordringbare vitelline-membraan dat Drosophila-embryo's omringt, wat een voorwaarde is voor immunofluorescentiekleuring. Belangrijk is dat deze methode voor het met de hand schillen van embryo's kan worden gebruikt om alleen correct geënsceneerde Drosophila-embryo's te selecteren voorafgaand aan het labelen van monsters, wat de kans op uitgebreide monsters van het juiste stadium en de juiste oriëntatie aanzienlijk vergroot en dus de stroomafwaartse gegevensverzameling veel efficiënter maakt.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van de Universiteit van Arkansas (UARK) voor onderzoek op ongewervelde dieren, zoals Drosophila melanogaster, en is goedgekeurd door het UARK Institutional Biosafety Committee (protocol #20001).

1. Fixatie en devitellinisatie van Drosophila-embryo's

OPMERKING: Stap 1 beschrijft een procedure (met de hand schillen) voor het handmatig verwijderen van het vitelline-membraan, een transparant ondoordringbaar membraan dat het embryo omringt. Belangrijk is dat met de hand schillen de selectie van correct geënsceneerde embryo's aan het begin van het ExM-protocol mogelijk maakt, waardoor de kans op het verkrijgen van embryo's in een bruikbare oriëntatie aan het einde van het ExM-protocol aanzienlijk wordt vergroot. Dit ExM-protocol is echter volledig compatibel met bulkembryoverzameling en standaardprocedures voor verwijdering van het vitellinemembraan op basis van methanol, in welk geval men direct naar stap 2 (immunofluorescentie-etikettering) kan gaan.

1. Bereid of koop een aantal fijne glazen naalden. De werkelijke afmetingen van de naaldpunt zijn niet kritisch, maar zorgen ervoor dat de naalden stijf en scherp genoeg zijn om de vitelline-membranen van vaste embryo's te doorboren. Maak naalden van glazen capillaire buisjes (1 mm buitendiameter, 0,75 mm binnendiameter) met behulp van een micropipettrekker, zoals men naalden zou voorbereiden voor embryo-micro-injecties¹⁸; U kunt ook kant-en-klare naalden kopen.
2. Verzamel embryo's met behulp van standaard Drosophila-technieken¹⁹ door >100 volwassen Drosophila in een geventileerde plastic beker te plaatsen die is afgesloten met een fruitsap-/agarplaat²⁰. Gebruik getimede verzamelvensters om te verrijken voor embryo's van het juiste stadium¹⁶. Om bijvoorbeeld te verrijken voor de stadia van gastrulatie (stadium 6) en convergente extensie (stadium 7), vervangt u de vruchtensapplaat, verzamelt u de embryo's gedurende 2 uur bij 25 °C, verwijdert u de plaat en rijpt u deze nog eens 2 uur bij 25 °C om embryo's te verkrijgen die ~2-4 uur oud zijn.
3. Om het eierschaalachtige chorion uit de embryo's te verwijderen, bedek je het oppervlak van de vruchtensapplaten met 50% bleekmiddel (tabel 1), maak je de embryo's los van het oppervlak van de agar door ze met een klein penseel te roeren en wacht je 3 minuten totdat het chorion is opgelost.
4. Breng de gedechorioneerde embryo's met een penseel over in een scintillatieflacon van 30 ml met 4 ml heptaan (organische topfase) en 4 ml fixatiebuffer (waterige bodemfase; Tabel 1). Verdun de formaldehyde vers uit een vers bereide of recent geopende bouillon en meng met 10x PBS en gedeïoniseerd water onmiddellijk voordat u de embryo's toevoegt.
   NOTITIE: Bereid de formaldehyde uit paraformaldehydekracht of 16% EM-kwaliteit formaldehyde in glazen ampullen. Voorraden geconcentreerd formaldehyde (bijv. 37% formaldehyde) kunnen worden gebruikt, hoewel de resultaten minder consistent kunnen zijn.
5. De embryo's zullen zich ophopen op het grensvlak tussen de organische en de waterige fase. Voeg zoveel embryo's toe als er een enkele laag vormen op het grensvlak. Als er te veel embryo's aan een injectieflacon worden toegevoegd, zullen ze niet zo goed fixeren.
6. Immobiliseer met sterke tape de scintillatieflacons op hun zijkant op een tafelschudder en schud ze gedurende 20 minuten bij 220 tpm. Voor een optimale fixatie moet gedurende de gehele fixatie een krachtige emulsie tussen de organische en de waterige fase worden aangehouden.
7. Bereid tijdens de fixatietijd een van de volgende voor elk van de monsters.
   1. Neem een plastic petrischaaltje van 6 cm dat voor de helft gevuld is met 3% agar en kerf met een scheermesje of scalpel een rechthoek van ~5 cm x 3 cm in de agar. Hiervoor kunnen ook vruchtensap/agarplaten worden gebruikt.
   2. Verwijder met een kleine laboratoriumspatel de agarplaat. Keer de bodem van de petrischaal om en zet deze op de bank. Leg de agarplak op de omgekeerde schaal (Figuur 2A).
   3. Pak de deksel van de petrischaal erbij en zorg dat deze droog is. Draag handschoenen en plaats een stuk dubbelzijdig plakband aan de binnenkant van het deksel (het stuk tape moet iets groter zijn dan de agarplak; Figuur 2B).
8. Haal de flacons uit de shaker, zet ze rechtop op de bank en laat de organische en waterige fasen scheiden. Goed gefixeerde embryo's blijven op het grensvlak tussen de twee fasen.
9. Breng de gefixeerde embryo's over op de agarplaat met behulp van een glazen pasteurpipet voorzien van een latexbol. Om te voorkomen dat de embryo's zich aan de binnenkant van de pipet hechten, probeert u de embryo's binnen de smalle hals van de pipet te houden en de embryo's in meerdere kleine batches over te plaatsen in plaats van allemaal tegelijk. Zodra alle embryo's op de agarplaat liggen, verwijdert u het grootste deel van het resterende heptaan rond de embryo's met behulp van een P200-pipettor. Voer deze stap zo snel mogelijk uit (<3 min) om uitdroging van de gefixeerde embryo's te voorkomen, wat de morfologie negatief kan beïnvloeden.
10. Laat vanaf een hoogte van ~2 cm het deksel met de dubbelzijdige tape op de agarmat vallen om de embryo's aan de tape te hechten (Figuur 2C). Verwijder voorzichtig het deksel van de agarplaat, plaats deze ondersteboven op de bank en voeg vervolgens voldoende PBS-Tween toe (tabel 1) om de embryo's in het deksel te bedekken.
11. Gebruik een stereo-ontleedmicroscoop met een vergroting van ongeveer 100x en indirecte verlichting, identificeer correct geënsceneerde embryo's met behulp van morfologische markers. Gebruik voor embryo's in stadium 6 markers zoals een zichtbare cephalische groef en geïnvaginateerd mesoderm; Gebruik voor embryo's in stadium 7 markers zoals een verlengde kiemband; Gebruik voor embryo's in stadium 11 markers zoals een volledig verlengde kiemband en zichtbare segmentatie langs de kop-staartas¹⁶.
    1. Om de gewenste embryo's te verzamelen, prikt u eerst met een fijne glazen naald in het vitelline-membraan (een transparant ovaal membraan rond het embryo) in de buurt van het voorste of achterste uiteinde van het embryo; Het membraan zal een beetje leeglopen als de druk wegvalt. Duw vervolgens met een fijne pincet of een metalen sonde het embryo aan het andere uiteinde voorzichtig door het gat; Het Vitelline-membraan blijft op de dubbelzijdige tape kleven. Laat ongewenste embryo's aan de tape kleven.
12. Verzamel periodiek de drijvende gedevitelliniseerde embryo's met een glazen Pasteur-pipet en verplaats ze naar een microfuge-buis van 1,5 ml.
13. Voer nu een van de volgende stappen uit.
    1. Ga direct verder met de stappen voor het labelen van immunofluorescentie. De gedevitelliniseerde embryo's kunnen direct in de blokkerende oplossing gaan (stap 2.2). Laat de embryo's niet langer dan 16 uur in PBS-Tween of blokkerende oplossing (tabel 1) blijven voordat u doorgaat naar de volgende stap.
    2. Verplaats de embryo's in methanol voor opslag. Verwijder zoveel mogelijk van de PBS-Tween en voeg vervolgens 1 ml methanol toe. Zodra de embryo's tot rust zijn gekomen, verwijdert u zoveel mogelijk methanol en voegt u 1 ml verse methanol toe. Bewaar de embryo's voor onbepaalde tijd bij -20 °C. De opslag van methanol maakt het ook mogelijk om embryo's uit meerdere collecties te poolen.

2. Etikettering van immunofluorescentie

OPMERKING: Afgezien van de incubatiestappen van antilichamen, zijn exacte vloeistofhoeveelheden en -tijden niet kritisch in deze sectie. Om te spoelen of te wassen, laat u de embryo's naar de bodem van de buis zakken, verwijdert u zoveel mogelijk vloeistof zonder embryo's op te zuigen en voegt u vervolgens ~1 ml nieuwe vloeistof toe; gebruik een glazen Pasteurpipet voorzien van een latexbol voor optimale helderheid en controle. Voor de spoelstap worden de embryo's niet geschud, maar mogen ze gewoon bezinken; Voor de wasstap worden de embryo's gedurende de aangegeven tijd op een nutator gewiegd en vervolgens laten bezinken.

1. Als de embryo's niet in methanol zijn bewaard, gaat u verder met stap 2.2. Als de embryo's in methanol zijn bewaard, spoel dan twee keer met PBS-Tween en was vervolgens twee keer gedurende 20 minuten met PBS-Tween.
2. Was de embryo's gedurende 30-60 minuten in 1 ml blokkerende oplossing.
3. Incubeer de embryo's met primaire antilichamen verdund in een antilichaamoplossing (tabel 1) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of bij voorkeur een nacht bij 4 °C. Voer deze stap uit in een zo klein mogelijk volume (50-300 μL) om de primaire antilichamen te behouden; Schommelen op een nutator is niet strikt vereist.
   1. Verhoog de hoeveelheid primair antilichaam die wordt gebruikt in een typisch immunofluorescentie-experiment met ten minste 50% voor ExM. Gebruik de volgende primaire antilichaamconcentraties: 1:200 voor anti-Par-3 cavia polyklonaal²¹ en 1:100 voor anti-GFP konijn polyklonaal.
4. Verwijder de primaire antilichaamoplossing (bespaar indien gewenst bij 4 °C), spoel tweemaal met PBS-Tween en was vervolgens vier keer gedurende 15 minuten met PBS-Tween.
5. Incubeer de embryo's met fluorescerende secundaire antilichamen in een eindvolume van 300 μl (verdund in antilichaamoplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een nutator. Tijdens deze stap kan fluorescerend gelabelde streptavidine worden toegevoegd. Bescherm de embryo's vanaf deze stap waar mogelijk tegen overmatige en langdurige blootstelling aan licht, bijvoorbeeld door de buisjes af te dekken met een ondoorzichtig deksel van de doos of door de monsters in een lade te bewaren.
   1. Gebruik de volgende concentraties: 1:500 voor anti-konijn IgG geit polyklonaal gefuseerd met Alexa Fluor 488; 1:500 voor anti-cavia IgG geit polyklonaal gefuseerd met Alexa Fluor 568; en 1:1000 voor streptavidin-Alexa Fluor 488.
6. Verwijder de secundaire antilichaamoplossing en gooi deze weg. Spoel de embryo's twee keer met PBS-Tween en was vier keer gedurende 15 minuten met PBS-Tween.
7. Op dit punt kunnen de embryo's bij 4 °C in het donker worden bewaard, maar de monsters zo snel mogelijk (<24 uur) verwerken.

3. PDMS-putten voorbereiden

LET OP: De PDMS-putten kunnen tot 2 weken van tevoren worden gemaakt.

1. Stel een incubator of kookplaat in op 55 °C en stel een centrifuge in die conische buizen tot 15 °C kan laten draaien.
2. Om de PDMS-oplossing te bereiden (tabel 1), plaatst u een conische buis van 50 ml in een secundaire container op een weegschaal en voegt u met een injectiespuit 10 g siliconenelastomeerbasis toe aan de buis. Voeg vervolgens 1 g siliconenelastomeeruithardingsmiddel toe en keer de tube meerdere keren om om te mengen.
3. Maak een balansbuis door een geschikte hoeveelheid water toe te voegen aan een tweede conische buis van 50 ml. Centrifugeer de PDMS-oplossing op 500 x g gedurende 3 minuten bij 15 °C en giet deze vervolgens in een petrischaal van 10 cm tot een diepte van ~1 mm. Verwijder indien nodig luchtbellen door zachtjes met een luchtslang op de oplossing te blazen. Laat de PDMS-oplossing een nacht stollen bij 55 °C.
4. Zodra de PDMS-plaat is gestold, snijdt u met een scalpel vierkante gebieden in die iets kleiner zijn dan een dekglaasje van 22 mm x 22 mm. Scoor in elk vierkant een vierkant van ~8 mm breed en verwijder het.
5. Breng elk vierkant PDMS goed over op een dekglaasje van 22 mm x 22 mm en plak het stevig vast (Figuur 2D). Het voorbereiden van zes of meer dekglaasjes zou een groot aantal geëxpandeerde embryo's moeten opleveren om in beeld te brengen.

4. Hechting van de embryo's aan de dekglaasjes

1. Breng voldoende 0,1% poly-L-lysine aan om het dekglaasje aan de binnenkant van elk putje (~50 μL) te bedekken en plaats ze in een incubator van 55 °C om aan de lucht te drogen. Herhaal deze stap om de kleefkracht te vergroten.
2. Spoel de embryo's eenmaal in 1x PBS kort om het Tween-wasmiddel te verwijderen en breng vervolgens >10 embryo's over in elk van de met poly-L-lysine gecoate putjes.
3. Laat de embryo's naar de bodem van de putjes zakken. Verwijder het overtollige vocht uit de aangehechte embryo's met behulp van een pasteurpipet. Ga onmiddellijk door naar de volgende stap.

5. Activering en gelering

OPMERKING: Activering verwijst naar de toevoeging van MA-NHS aan de embryo's, waardoor de monstereiwitten en antilichamen worden gewijzigd zodat ze zich aan de hydrogel kunnen binden. Gelatie verwijst naar het genereren van een hydrogel in en rond de embryo's in elk putje. Tijdens de gelering worden de embryo's doordrongen met een monomeeroplossing en vervolgens behandeld met een geleringsoplossing om de hydrogel te vormen.

1. Activeer de embryo's gedurende 1 uur bij kamertemperatuur door de putjes te vullen met activeringsoplossing (1 mM MA-NHS vers verdund in 1x PBS; Tabel 1). Vervang deze oplossing ongeveer elke 10 minuten in de loop van 1 uur.
2. Spoel de embryo's drie keer met 1x PBS. Incubeer de embryo's in monomeeroplossing (tabel 1) gedurende 45 minuten bij 4 °C.
3. Terwijl de embryo's in de monomeeroplossing zitten, bereidt u de geleringsoplossing voor (tabel 1). Het bereiden van ~2 ml geleringsoplossing is voldoende om de PDMS-putjes uit een hele petrischaal van 10 cm te bedekken. Zorg ervoor dat u de APS als laatste toevoegt, omdat dit de polymerisatie zal initiëren en de gelering zal beginnen.
   1. Verdun het katalytische oxidatiemiddel vers uit poeder (bijv. 1% TEMPO w/v in water). Combineer 1.960 μL monomeeroplossing met 30 μL 10% TEMED en 10 μL 1% TEMPO.
   2. Om te voorkomen dat de hele batch geleringsoplossing in één keer wordt gepolymeriseerd, moet u in kleine batches werken. Verdeel de geleringsoplossing (zonder APS) in aliquots van 125 μl tussen de acht buisjes van een PCR-strip.
   3. Verwijder de monomeeroplossing uit de drie PDMS-putjes met behulp van een vacuüm en zorg ervoor dat de embryo's niet worden verstoord. Voeg 5 μL APS toe aan een van de PCR-buisjes met geleringsoplossing om polymerisatie op gang te brengen. Verdeel de polymeriserende geleringsoplossing snel over de putjes (~40 μL per putje). Herhaal dit totdat alle putjes en embryo's bedekt zijn.
4. Laat de monsters 1,5-2,5 uur geleren bij 37 °C. Roer de hydrogels af en toe om de polymerisatie te controleren. Gestolde hydrogels wiebelen niet. Dikkere hydrogels hebben meer tijd nodig om de polymerisatie te voltooien en te stollen.

6. Vertering en expansie

OPMERKING: Dikkere en grotere gels hebben meer tijd nodig om uit te zetten en het midden van de gels kan enkele uren duren om volledig uit te zetten; Dit kan worden versneld door de randen van de gel bij te snijden. Naarmate de gels uitzetten, wordt hun brekingsindex bijna identiek aan die van water en worden ze erg moeilijk te zien.

1. Nadat de gelering is voltooid, pelt u de PDMS-putjes van het dekglaasje terwijl u probeert de hydrogels niet te verstoren. Knip overtollig hydrogelmateriaal desgewenst weg.
2. Breng de hydrogels (die nog steeds aan de dekglaasjes zijn bevestigd) afzonderlijk over in de putjes van een plaat met zes putjes (figuur 2E). Houd er rekening mee dat de hydrogels tijdens de spijsvertering enigszins kunnen uitzetten.
3. Dek de gels gedurende 1 uur bij 37 °C volledig af met een verteringsbuffer (tabel 1). Over het algemeen is 30 ml spijsverteringsbuffer voldoende om de gels in een bord met 6 putjes te bedekken.
4. Breng na de vertering elke hydrogel afzonderlijk over in een petrischaaltje van 6 cm door ze van het dekglaasje te schuiven. Het kan nodig zijn om een tweede dekglaasje te gebruiken om de gel los te maken. Vul elke petrischaal met gedeïoniseerd water om de gel uit te zetten. Ververs het water drie tot vier keer in de loop van 1-2 uur totdat de gels volledig zijn uitgezet (verwacht een geschatte viervoudige toename in breedte).

7. Montage en beeldvorming

OPMERKING: Geëxpandeerde hydrogels bestaan bijna volledig uit water, waardoor ze bijna transparant en extreem kwetsbaar zijn. De gels kunnen worden gemanipuleerd met behulp van lange dekglaasjes om ze te verplaatsen en op te pakken. Monteer en beeld slechts één of twee gels tegelijk, omdat gels geleidelijk water afgeven en rond het dekglaasje beginnen te glijden.

1. Verwijder met behulp van een pasteurpipet zoveel mogelijk overtollig water uit de petrischaal om te voorkomen dat de gels bij het hanteren gaan bewegen.
2. Manoeuvreer elke geëxpandeerde gel, met de embryo's aan de onderkant, op een groot dekglaasje (bijv. 24 mm x 40 mm) voor beeldvorming.
3. Monteer elk dekglaasje met gel over het objectief van een omgekeerde confocale microscoop met laserscanning. Lokaliseer correct geënsceneerde en georiënteerde preparaten met behulp van de epifluorescentie- of helderveldmicroscopiemodi op de microscoop met luchtobjectieven met een lage vergroting (5x of 10x) of een gemiddelde vergroting (20x).
4. Als u een beeld met een hoge resolutie wilt maken, schakelt u over naar een sterk vergrote (60x, 63x of 100x) olie- of wateronderdompelingsobjectief. Het oppervlak van de embryo's moet zich binnen het focusbereik van het objectief bevinden (<300 μm vanaf het dekglaasje voor een 63x objectief) om te kunnen worden afgebeeld.
5. Verzamel gegevens van monsters met behulp van de confocale modus voor laserscannen op de microscoop. Zorg ervoor dat u niet-verzadigde afbeeldingen met een goed dynamisch bereik verzamelt en gebruik een geschikt aantal pixels per afbeelding om de maximaal mogelijke informatie over het voorbeeld vast te leggen²³.

Figuur 2: Handmatige devitellinisatie en werken met hydrogels . (A) Snijden van een agar-plak uit een agar/vruchtensapplaat. (B) Dubbelzijdig plakband aanbrengen in het deksel van een petrischaal van 6 cm. (C) Hechtende embryo's aan het afgeplakte deksel. (D) Een PDMS-plaat met een vierkant goed geplakt op een dekglaasje van 22 mm x 22 mm. (E) Dekglaasje met een PDMS-vakje in een plaat met 6 putjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Om de algemene werkzaamheid van ExM in Drosophila-embryo's met de hele berg te karakteriseren, werd de embryolengte langs de kop-staartas gemeten in niet-geëxpandeerde controle-embryo's versus geëxpandeerde embryo's (Figuur 3A-C). De niet-geëxpandeerde controle-embryo's werden onderworpen aan dezelfde fixatieomstandigheden en immunofluorescentie-etiketteringsstappen als de geëxpandeerde embryo's, behalve dat ze voorafgaand aan de beeldvorming werden gemonteerd met behulp van een gestold montagemedium. De individuele niet-geëxpandeerde embryo's besloegen ongeveer de helft van een gezichtsveld bij gebruik van een 10x objectief (Figuur 3A). Daarentegen besloegen de geëxpandeerde embryo's ongeveer twee volledige gezichtsvelden bij gebruik van hetzelfde 10x-objectief (Figuur 3B). Om te beoordelen hoe de mate van expansie zowel binnen als tussen experimenten varieerde, werd hetzelfde ExM-protocol bij drie verschillende gelegenheden uitgevoerd en werd de embryolengte gemeten in drie verschillende gels binnen elk afzonderlijk experiment. De gemiddelde kop-tot-staartlengte van de niet-geëxpandeerde controle-embryo's was 398,8 μm (standaarddeviatie [SD] = 22,93 μm; n = 74; Figuur 3C). Voor experiment 1, experiment 2 en experiment 3 waren de gemiddelde embryolengtes respectievelijk 1.596 μm (SD = 159,9 μm; n = 57), 1.868 μm (SD = 150,5 μm; n = 51) en 1,954 μm (SD = 120,3 μm; n = 44), wat neerkomt op expansiefactoren van respectievelijk 4,0-voudig, 4,7-voudig en 4,9-voudig (Figuur 3C). De intra-experimentele variatie tussen de gels was veel minder opvallend dan de inter-experimentele variatie, die ongeveer 20% bedroeg (Figuur 3C). Om de effecten van ExM op de morfologie van cellen en embryo's te beoordelen, werd een antilichaam tegen de adherens-junctiecomponent Par-3 (Bazooka)21 gebruikt om de apicale celmembranen te labelen, en we beeldden de zich ontwikkelende mondsegmenten van stadium ¹¹ Drosophila-embryo's af - een stadium met een complexe gesegmenteerde structuur (Figuur 3D-F). In de controlesteekproef hadden de cellen in het maxillaire segment een gemiddelde breedte van 4,76 μm (SD = 1,053 μm, n = 25; Figuur 3D,F). In de geëxpandeerde monsters die werden afgebeeld met hetzelfde 40x objectief en zoomfactor (1x), hadden de cellen in het maxillaire segment een gemiddelde breedte van 19,10 μm (SD = 3,966 μm, n = 18; Figuur 3E,F), wat een 4,0-voudige expansie voorstelt. Daarom waren we, in overeenstemming met eerdere rapporten¹¹, in staat om Drosophila-embryo's in het hele huis ongeveer viervoudig uit te breiden in lineaire afmetingen met behulp van ExM zonder monsterscheuren of duidelijke vervormingen in de cellulaire of weefselmorfologie.

Figuur 3: Verviervoudiging van Drosophila-embryo's. (A) Niet-geëxpandeerde en (B) geëxpandeerde Drosophila-embryo's afgebeeld met behulp van een 10x objectief (0,3 NA) bij 1x zoom. Individuele gezichtsvelden (FOV) worden aangegeven met stippellijnen. De embryo's brachten een GFP-gelabelde versie van de myosine lichte keten tot expressie en werden gekleurd met een anti-GFP-antilichaam. (C) Kwantificering van de embryolengte (langs de as van kop tot staart) in drie hydrogels per experiment en van drie afzonderlijke ExM-experimenten in vergelijking met niet-geëxpandeerde controles. (D,E) Maxillaire segmenten van (D) niet-geëxpandeerde en (E) geëxpandeerde stadium 11 Drosophila-embryo's afgebeeld met behulp van een 40x objectief (1,3 NA) bij 1x zoom. De celcontouren (adherens-juncties) werden gedetecteerd met een anti-Par-3/Bazooka-antilichaam (wit). (F) Kwantificering van de celbreedte (lange as) van equivalente groepen cellen van (D) en (E). De boxplots in (C) en (F) tonen het 25e, 50e en 75e percentielbereik; de snorharen geven de minimum- en maximumwaarden aan; De "+"-symbolen geven het gemiddelde aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om aan te tonen dat ExM kan worden gebruikt om subcellulaire details onder de typische diffractielimiet op te lossen, werd het actomyosine-cytoskelet afgebeeld in niet-geëxpandeerde controle versus geëxpandeerde embryo's die convergente extensie ondergaan (stadium 7). De weefselremodelleringsgebeurtenissen van gastrulatie en convergente extensie worden grotendeels gecontroleerd door veranderingen in de lokalisatie van het motoreiwit myosine II²⁴. In het dicht opeengepakte zuilvormige epitheel van het vroege Drosophila ectoderm is het echter moeilijk om veel fijne details van het myosine II-lokalisatiepatroon waar te nemen, zelfs wanneer het wordt afgebeeld met een vergroting van 158x (63x objectief met een 2,5x optische zoom) - een typisch maximaal oplossend vermogen voor een confocale microscoop met laserscanning. Omdat myosine II bijvoorbeeld een corticaal eiwit is (direct onder het plasmamembraan), waren pools van myosine II²⁵ aan weerszijden van cel-celcontacten niet oplosbaar in embryo's van stadium 7 en verschenen ze als een enkele lijn waar naburige cellen elkaar ontmoetten (Figuur 4A). Daarentegen konden in geëxpandeerde stadium 7-embryo's parallelle lijnen van myosine II worden waargenomen bij cel-celovergangen, die corticale eiwitpools in aangrenzende cellen vertegenwoordigen (Figuur 4B). De afstand tussen parallelle myosine II-lijnen in geëxpandeerde monsters was 892,7 nm (SD = 0,171 nm, n = 12); gedeeld door vier, levert dit een voorspelde afstand op van ~220 nm tussen de myosinelijnen in aangrenzende cellen in niet-verlengde embryo's, wat inderdaad net onder de diffractielimiet ligt voor een signaal gedetecteerd met Alexa 488 (piekemissie van ~520 nm/2 = 260 nm).

Daarnaast testten we ook of ExM gebruikt kon worden om de mitochondriale netwerkarchitectuur op te lossen in dicht opeengepakte cellen van gastrulerende Drosophila embryo's (stadium 6). De mitochondriale functie is nauw verbonden met de netwerkstructuur (d.w.z. gefuseerde versus gefragmenteerde organellen), maar de details van de organisatie van het mitochondriale netwerk zijn moeilijk te visualiseren met conventionele confocale microscopie in celtypen die niet plat en/of dun zijn. Mitochondriën zijn van nature rijk aan gebiotinyleerde moleculen en daarom kunnen mitochondriën worden geëtiketteerd in het vroege Drosophila-embryo met behulp van fluorescerend gelabeld streptavidine²⁶. In de niet-geëxpandeerde stadium 6-embryo's gelabeld met streptavidin-Alexa 488, verscheen het signaal als cytoplasmatische puncta die vaak overlappend en moeilijk op te lossen waren (Figuur 4C). Daarentegen waren in de geëxpandeerde stadium 6-embryo's veel meer fijne details van het mitochondriale netwerk zichtbaar en waren puncta gemakkelijker oplosbaar (Figuur 4D)^26,27. Deze resultaten geven aan dat ExM kan worden gebruikt om de organisatie van mitochondriale netwerken te bestuderen in celtypen die traditioneel niet geschikt zijn voor mitochondriale analyse.

Figuur 4: Details van actomyosine cytoskelet en mitochondriën onthuld door expansiemicroscopie. (A,B) Myosine II-lokalisatie in neuro-ectoderm (kiemband) cellen afgebeeld met een 63x objectief (1,4 NA) bij 2,5x zoom in stadium 7 (A) niet-geëxpandeerde en (B) geëxpandeerde embryo's. Myosine II werd gedetecteerd in de embryo's die een transgene GFP-gelabelde versie van de myosine II-regulerende lichte keten (sqh-GFP) tot expressie brachten, die werd gedetecteerd met een anti-GFP-antilichaam (rood). Verschillende pools van corticale myosine die zich in aangrenzende cellen bevinden, kunnen worden opgelost in het geëxpandeerde embryo (witte pijlen). (C,D) Mitochondriale netwerken in neuro-ectodermcellen afgebeeld met een 63× objectief (1,4 NA) bij 2,5x zoom in stadium 6 niet-geëxpandeerde (C) en geëxpandeerde (D) embryo's. De mitochondriën werden gedetecteerd met streptavidine-Alexa 488 (groen) en de celcontouren werden gedetecteerd met een anti-Par-3/Bazooka-antilichaam (magenta). De experimenten werden uitgevoerd met een confocale microscoop met laserscanning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Oplossingsrecepten. Samenstelling van de oplossingen die in dit protocol worden gebruikt in volgorde van verschijningsvorm. Alle voorraden zijn vloeibaar, tenzij anders vermeld. De chemicaliën werden geresuspendeerd of verdund in geautoclaveerd gefilterd water, tenzij anders vermeld. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Handmatige devitellinisatie
De meeste protocollen voor het fixeren van Drosophila-embryo's omvatten het verwijderen van het vitelline-membraan door gefixeerde embryo's te schudden in een emulsie van methanol en heptaan, waardoor de membranen afbarsten via osmotische ruptuur²⁶. Hoewel devitellinisatie op basis van methanol (methanol popping) effectief en geschikt is voor veel toepassingen, biedt handmatige devitellinisatie (met de hand schillen) enkele belangrijke voordelen. Ten eerste maakt het met de hand schillen mogelijk om nauwkeurig geënsceneerde embryo's te kiezen om te devitelliniseren en te verzamelen, waardoor de kans op het verkrijgen van geëxpandeerde embryo's in een bruikbare oriëntatie aan het einde van het experiment aanzienlijk toeneemt. Deze verrijking is van cruciaal belang bij het bestuderen van specifieke aspecten van snelle ontwikkelingsprocessen (bijv. mesoderm-invaginatie of convergente extensie), waarvoor op de juiste manier geënsceneerde embryo's slechts een paar procent van alle embryo's kunnen vertegenwoordigen, zelfs binnen een strak getimed verzamelvenster. Natuurlijk is voor veel toepassingen het meer traditionele in bulk knallen van embryo's uit een getimed verzamelvenster voldoende, en met de hand schillen is misschien niet de extra moeite waard. Ten tweede wordt de binding van bepaalde primaire antilichamen en kleurstoffen negatief beïnvloed door eerdere blootstelling van het monster aan methanol. Om deze reden kan het met de hand schillen een aanzienlijke toename van de kwaliteit van het immunofluorescentiesignaal opleveren in vergelijking met methanol-gepofte monsters, waardoor het een nuttige algemene techniek is voor ontwikkelingsbiologen van Drosophila .

Confocale microscopie met hoge resolutie in geëxpandeerde Drosophila-embryo's met volledige montage
Hoewel het uitvoeren van confocale microscopie met hoge resolutie op geëxpandeerde monsters conceptueel hetzelfde is als op niet-geëxpandeerde monsters, introduceert ExM enkele technische hindernissen. Met name de oriëntatie van het embryo, die willekeurig is, wordt nog belangrijker naarmate de steekproefomvang toeneemt, omdat sterk vergrote en hoge NA-objectieven alleen licht kunnen concentreren van monstergebieden die zich zeer dicht bij het dekglaasje bevinden²⁷. Daarom is het meestal alleen mogelijk om zich te concentreren op de cellen op of nabij het oppervlak van het embryo die naast het dekglaasje terechtkwamen toen de gel werd gevormd. De beste manier om ervoor te zorgen dat er aan het einde exemplaren van de juiste oriëntatie zijn, is door het ExM-protocol te starten met een strak gefaseerde verzameling van vaste embryo's (bijvoorbeeld door met de hand te schillen) en om veel embryo's in elk putje te zaaien (>10). Om cellen diep in het binnenste van het embryo te visualiseren, kan het nodig zijn om meer gespecialiseerde beeldvormingsopstellingen te gebruiken, zoals light-sheet microscopie²⁸. Bovendien vinden we dat de beeldkwaliteit kan worden verbeterd door het confocale gaatje te openen tot een formaat groter dan één luchtige eenheid. Natuurlijk gaat een grotere pinhole-grootte ten koste van een lagere maximale resolutie, maar in de praktijk kunnen zelfs kleine vergrotingen van de pinhole-grootte de signaalintensiteit aanzienlijk verhogen (gegevens niet weergegeven). Toekomstige studies moeten systematisch ingaan op de grootte van de gaatjes en de effectieve resolutie in ExM-monsters.

Variaties op basis ExM
Het hier beschreven protocol is een relatief eenvoudig voorbeeld van ExM dat voor veel toepassingen zou moeten werken en gemakkelijk te implementeren zou moeten zijn in de meeste laboratoria voor ontwikkelingsbiologie. Er zijn echter talrijke variaties op het basisconcept van ExM ^4,5,7 die kunnen worden gebruikt om de signaalintensiteit te verhogen, nog verdere uitbreidingsgraden te bereiken en nucleïnezuurmoleculen en eiwitten te detecteren. In dit protocol worden de embryo's geïncubeerd met antilichamen voorafgaand aan gelering en expansie. Als alternatief kunnen de monsters worden behandeld met antilichamen nadat ze zijn geëxpandeerd ^6,30, wat de signaalintensiteit kan verhogen als gevolg van een grotere toegankelijkheid van epitoop en verminderd verlies van gebonden antilichamen tijdens de expansiestappen. Bovendien kunnen specifieke crosslinkermoleculen worden gebruikt om RNA-moleculen aan de hydrogel te hechten om de detectie van RNA in geëxpandeerde gels mogelijk te maken met behulp van de hybridisatiekettingreactiemethode³⁰. Ten slotte kunnen de monsters worden onderworpen aan meerdere uitbreidingsrondes, zoals bij iteratieve expansiemicroscopie (iExM)31, pan-ExM³² en expansieonthullende (ExR)³¹, om nog hogere graden van verhoogde resolutie te bereiken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
acrylamide	Milipore Sigma	1490-100ML
ammoniumpersulfaat	VWR	BDH9214-500G
anti-GFP konijn polyklonaal antilichaam	Torrey Pines BioLabs	TP-401
anti-guinea pig IgG geit polyklonaal antilichaam, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11075
anti-konijn IgG geit polyklonaal antilichaam, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11008
bisacrylamide	Research Products International	A11275
runderserum albumine (30% oplossing)	Millipore Sigma	A7284
conische buizen, 50 mL	fisherscientific	21008-940
dekglasje, vierkant 22 mm	VWR	48366-227
dekglasje, rechthoekig 40 mm x 24 mm	VWR	48393-230
glas capillairen voor het trekken van naalden	World Precision Instruments	TW100F-4
glas micro-injectienaalden (voorgebogen)	World Precision Instruments	TIP10LT
guanidine HCl	VWR	101970-606
heptaan	VWR	EM-HX0078-1
latex pipetbulben	VWR	82024-554
methanol	VWR	BDH1135-4LP
methylacrylzuur N-hydroxysuccinimidester	VWR	730300-1G
microfuge buisje, 1.5 mL	VWR	20170-038
multi-well plate, 6-well	Genesee	25-100
paraformaldehyde (16%, EM-kwaliteit, methanol-vrij)	Electron Microscopy Sciences	509804487 (Fisher)
Pasteur pipet (2 mL, korte punt)	VWR	14673-010
PDMS kit (Sylgard 184 Kit, basis en hardingsmiddel)	VWR	102092-312
Petri schotels	Genesee	32-107
fosfaat gebufferde zoutoplossing (10x oplossing)	VWR	97063-660
Poly-L-lysine oplossing (0,1% oplossing)	VWR	P8920-1ooML
Proteinase K	Thermo Fisher Scientific	E00491
scintillatiebuisjes (30 mL)	VWR	66022-128
natriumacrylaat	VWR	101181-226
natriumaziet (poeder)	Millipore Sigma	71289	maak een 1% w/v werkoplossing; acuut GIF op deze concentratie!
Streptavidine, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	S32354
TAE (50x)	VWR	97063-692
tape (dubbelzijdig, 1 inch breed)	Scotch  3M	665 Scotch dubbelzijdig 1inch/1296 inches Boxed
TEMED	Thermo Fisher Scientific	PI17919
TEMPO	VWR	EM8.14681.0005	katalytische oxidant
Tween-20	VWR	97063-872	extreem stroperig wanneer puur; maak een 10% werkoplossing met water
Zeiss LSM 900	Zeiss		Laser scanning microscoop gebruikt zonder AiryScan