Dit artikel beschrijft een protocol om het proces te vereenvoudigen en de bereiding van autoloog geconditioneerd serum (ACS) goedkoper te maken. Er zijn geen speciale spuiten of glasparels met een oppervlaktecoating nodig. Bovendien heeft het gemodificeerde ACS (mACS) concurrentievoordelen ten opzichte van conventioneel autoloog serum in de hoornvlieswondgenezing van muriene ogen ex vivo.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Productie van gemodificeerd autoloog geconditioneerd serum en ex vivo beoordeling van het genezingspotentieel ervan in murine cornea-epitheel
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Van menselijk bloed afgeleide topische therapieën zijn de afgelopen decennia een zegen geweest voor clinici. Autoloog serum (AS) en bloedplaatjesrijk plasma (PRP) zijn verrijkt met epitheliotrope groeifactoren die essentieel zijn bij de genezing van hoornvlieswonden. In tegenstelling tot AS is PRP gebaseerd op een differentieel centrifugatiesysteem, wat meer van bloedplaatjes afgeleide groeifactoren oplevert. Autoloog geconditioneerd serum (ACS) behoudt niet alleen de bereiding van AS en PRP, maar richt zich ook op immuunmodulerende eigenschappen, die belangrijk zijn bij ontstekingsziekten.
Het ontbreken van gestandaardiseerde protocollen en hoge voorbereidingskosten zijn beperkingen voor de klinische toepassing van ACS. Dit video-experiment demonstreert een standaard werkwijze voor het bereiden van gemodificeerde autologe geconditioneerde serum (mACS) oogdruppels. Eerst werd glycerol toegevoegd aan heparinespuiten als de bloedcelstabilisator tijdens hypoxische incubatie. Om de bloedcellen te activeren, werd een incubatie van 4 uur bij 37 °C gestart. Vervolgens werden de bloedmonsters gecentrifugeerd bij 3.500 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na filtratie van het supernatant door een filter van 0,22 μm werden de mACS-oogdruppels volledig voorbereid.
Een voorzichtige try-out van het therapeutische effect van mACS toonde aan dat het concurrentievoordelen kan hebben ten opzichte van conventionele AS in de hoornvlieswondgenezing in ex vivo muizenogen. De AS die in deze studie werd gebruikt, werd opgesteld volgens gepubliceerde studies en de klinische praktijk in ons ziekenhuis. Daarom kan de werkzaamheid van mACS op oculaire oppervlakteziekten in toekomstig onderzoek worden geëvalueerd door middel van in vivo dierstudies en klinische proeven.
Inleiding
De therapeutische effecten van autoloog serum (AS) bij droge ogen werden voor het eerst gemeld in de jaren 1980 door Fox et al.1. Er wordt aangenomen dat zowel de smerende eigenschap als de essentiële epitheliotrope biochemische componenten in AS, die natuurlijke tranen nabootsen, de proliferatie van cornea-epitheelcellen ten goede komen. In de afgelopen decennia zijn op basis hiervan verschillende onderzoeken uitgevoerd. Trofische componenten omvatten epidermale groeifactor (EGF), vitamine A, transformerende groeifactor β (TGF-β) en andere cytokines. Interessant is dat het serum rijk is aan TGF-β en vitamine A, waarvan wordt aangenomen dat ze ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen aan het begin van het protocolgedeelte. Alle protocollen en procedures werden uitgevoerd volgens de Verklaring van Helsinki en werden beoordeeld en goedgekeurd door de Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board. Alle vrijwilligers werden geïnformeerd over de aard van deze studie en ondertekenden een geïnformeerd toestemmingsformulier voorafgaand aan hun opname. De verbruiksartikelen die nodig zijn voor de gehele experimentele procedure zijn weergegeven in figuur 1 en figuur 2, evenals in de materiaaltabel
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 en figuur 2 tonen de materialen die nodig zijn voor het experiment en figuur 3 toont de opeenvolgende stappen en de succesvolle tussenproducten tijdens de bereiding van mACS. Eerst werd 0,5 ml 10% glyceroloplossing toegevoegd aan elke steriele reageerbuis van 10 ml (figuur 3A). Vervolgens werd 60-70 ml veneus bloed van de patiënt verkregen en 10 ml bloed in elke buis geïnjecteerd (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie wordt een protocol voor de bereiding van mACS beschreven en wordt het voordeel van mACS oogdruppels bij de wondgenezing van diermodellen verder aangetoond. De cruciale wijziging van dit mACS-protocol is de toevoeging van ongeveer 0,5 ml 10% glyceroloplossing in elke reageerbuis, die geschikte hypoxische omstandigheden creëert tijdens de incubatie van 4 uur bij 37 °C. Deze instelling voorziet de AS van de juiste stress en zet cellen ertoe aan om de nodige groeifactoren af te scheiden die de wondgenezing he.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Ya-Lan Chien en Chia-Ying Lee voor de uitstekende technische assistentie, en OnLine English company voor de taalkundige editie. Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door Chang Gung Medical Research Project (Grant No. CMRPG3L1491).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96-wells kweekplaat | Merck KGaA, Duitsland | CLS3997 | |
| Barraquer ooglid spreider | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer naaldhouder | Katena | K6-3310 | zonder vergrendeling |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | voor het snijden van filterpapier |
| BD 10.0 mL vacutainerbuisjes met heparine 158 USP-eenheden | Becton, Dickinson and Company, VS | 367880 | Ten minste 6 buisjes, nodig om bloed te verzamelen voor volgende experimenten en om bloedklontering te voorkomen |
| BD 21 G vlinder-vleugelinfusieset | Becton, Dickinson and Company, VS | 367281 | Voor gelijkmatige verdeling van glyceroloplossing |
| C57BL/6 muizen | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | voor muismodel |
| Castroviejo pincet 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Duitsland | 5811000428 | 3.500 x g gedurende 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL gesteriliseerde oogdruppelfles | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Moet steriel zijn en als opslagcontainer voor het eindproduct |
| Hoornvliesroestring verwijderaar met 0.5 mm frees | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | voor het afdoen van het hoornvliesepitheel |
| Dulbecco's gemodificeerd minimaal essentieel medium | Merck KGaA, Duitsland | D6429 | |
| Filterpapier | Toyo Roshi Kaisha, Ltd. | 1.11 | |
| Fluoresceïne natrium oogdruppelstrips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | kleuring voor hoornvliesepitheeldefect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C gedurende 4 uur |
| Kanam steriele handschoenen | Kanam Latex Industries, India | EN455 | Voor aseptische werking |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Duitsland | PR05359 | Ten minste 2 filters voor mACS-filtratie |
| Nang Kuang 250 mL 10% glyceroloplossing | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | Om een geschikt membraanstabilisatie-effect en extracellulaire osmotische druk voor bloedcellen te bieden |
| Normale zoutoplossing | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Huidbiopsie punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscoop | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscoop voor chirurgie |
| Terumo 18 G naald | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL spuit met 18 G naald om het supernatant na centrifugatie te extraheren |
| Terumo 20.0 mL spuit | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Kan worden gebruikt om serum te verzamelen na de eerste centrifugatie en het te gebruiken voor secundaire centrifugatie. |
| Terumo 3.0 mL spuit met de 23 G naald | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL spuit wordt gebruikt om het supernatant na centrifugatie te extraheren. Vervolgens worden de filter en de 23 G naald aangesloten voor injectie in de oogdruppelflesjes. |
| Westcott Tenotomy Schaar Medium | katena | K4-3004 |
Referenties
- Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca. Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).
- Noble, B. A., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
