Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Lentivirale vectorvoorbereiding voor efficiënte gen- en microRNA-modulatie van macrofagen in buikholte in vivo bij muizen

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64926

⸱

16 februari 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Systems Immunity Research Institute, Division of Infection and Immunity, Cardiff University, 2Biomedical Sciences Unit, Faculty of Medicine, Health and Life Science, Swansea University, 3UK Dementia Research Institute

In dit artikel

Samenvatting

We demonstreren een stapsgewijs protocol voor het onderzoek naar de genfunctie in macrofagen in peritoneaal weefsel in vivo, met behulp van lentivirale vectoren.

Samenvatting

Peritoneale weefsel-residente macrofagen hebben brede functies bij het handhaven van homeostase en zijn betrokken bij pathologieën in lokale en naburige weefsels. Hun functies worden bepaald door micro-omgevingssignalen; Het is dus essentieel om hun gedrag te onderzoeken in een in vivo fysiologische niche. Momenteel maken specifieke methodologieën voor het targeten van peritoneale macrofagen gebruik van transgene modellen van hele muizen. Hier wordt een protocol beschreven voor effectieve in vivo modulatie van de expressie van mRNA en kleine RNA-soorten (bijv. microRNA) in peritoneale macrofagen met behulp van lentivirusdeeltjes. Lentiviruspreparaten werden in HEK293T cellen gemaakt en gezuiverd op een enkele sucroselaag. In vivo validatie van de effectiviteit van het lentivirus na intraperitoneale injectie toonde een overheersende infectie van macrofagen aan die beperkt was tot lokaal weefsel. Targeting van peritoneale macrofagen was succesvol tijdens homeostase en thioglycolaat-geïnduceerde peritonitis. De beperkingen van het protocol, waaronder ontsteking op laag niveau veroorzaakt door intraperitoneale toediening van lentivirus en tijdsbeperkingen voor mogelijke experimenten, worden besproken. Over het algemeen presenteert deze studie een snel en toegankelijk protocol voor de snelle beoordeling van de genfunctie in peritoneale macrofagen in vivo.

Inleiding

Weefsel-residente macrofagen (Mφ) zijn een heterogene populatie van fagocytische immuuncellen die binnendringende ziekteverwekkers detecteren en erop reageren 1,2. Bovendien spelen ze een essentiële rol bij weefselontwikkeling, remodellering en het handhaven van homeostase 1,3. Veel weefsel Mφ zijn afkomstig van voorlopers van dooierzakjes tijdens de embryogenese en blijven gedurende het hele leven in het weefselaanwezig 4,5. Het fenotype en de functies van deze cellen worden bepaald door collaboratieve en hiërarchische interacties van specifieke transcriptiefactoren en de lokale micro-omgeving 6,7,8,9. Een groeiend begrip van deze afhankelijkheid vergroot de behoefte aan effectieve in vivo methoden voor genmanipulatie van Mφ binnen hun fysiologisch relevante niche.

Lentivirale vectoren zijn een vaak gebruikt hulpmiddel voor de manipulatie van nucleïnezuren in specifieke celpopulaties in vivo 10,11,12, met name vanwege hun vermogen om zowel delende als niet-delende cellen te infecteren en stabiel te integreren in het genoom van de gastheer 13,14. In de afgelopen twee decennia is de technologie voor lentivirustoediening geoptimaliseerd en zijn alternatieve enveloppen en synthetische promotors onderzocht om de afstammingsspecifieke targeting te verhogen 8,15. Vanwege zijn brede celtropisme is vesiculaire stomatitisvirus envelop glycoproteïne (VSV-G)16,17 de "gouden standaard" envelop geworden die wordt gebruikt in de lentivirustechnologie.

In dit protocol18 worden VSV-G pseudogetypeerde lentivirale deeltjes gebruikt om gerichte en effectieve afgifte van kort haarspeld-RNA (shRNA) en microRNA (miR) aan peritoneale Mφ (pMφ) van muizen in vivo aan te tonen, bij steady-state19. Transgenexpressie werd aangedreven door de promotor van het miltfocusvormende virus (SFFV). Productieve infectie van cellen werd gedefinieerd door de expressie van van lentivirus afgeleid versterkt groen fluorescerend eiwit (GFP). Door gebruik te maken van deze aanpak konden in vivo lentivirusexperimenten gemakkelijk worden uitgelezen om de optimale dosis en het experimentele tijdsbestek te bepalen. Ten slotte onthulde in vivo lentivirale provocatie van muizen tijdens thioglycolaat-geïnduceerde ontsteking de natuurlijke neiging tot selectieve pMφ-infectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Al het dierenwerk werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de instelling en het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken.

OPMERKING: Alle in vivo onderzoeken met lentivirus moeten worden uitgevoerd volgens de lokale en nationale richtlijnen voor het ethisch gebruik van dieren in onderzoek, en moeten worden nageleefd volgens alle voorschriften die verband houden met het gebruik van infectieus materiaal van categorie II. Het dierenwelzijn moet ook worden gecontroleerd in overeenstemming met de lokale regelgeving. In deze stap van het protocol moet uiterste voorzichtigheid worden betracht bij het werken met lentivirale deeltjes en scherpe voorwerpen.

1. Voorbereiding van HEK293T cellen voor transfectie

OPMERKING: Voer deze stappen uit onder een steriele biologische veiligheidskast voor weefselkweek.

  1. Bereid volledig Dulbecco's Modified Eagle Medium (cDMEM) voor HEK293T cellen door de 450 ml DMEM te combineren met 10% (v/v) foetaal kalfsserum (50 ml) en een eindconcentratie van 100 E/ml penicilline/streptomycine.
  2. Ontdooi HEK293T cellen ten minste 1 week voor de geplande transfectie. Zorg voor gezonde groeiomstandigheden en passage om de 2-3 dagen met behulp van trypsine + EDTA om de cellen los te maken van de kolf.
  3. Zuig een dag voor de transfectie voorzichtig het groeimedium uit de cellen en was de cellen voorzichtig met steriel DPBS. Voeg 1-5 ml trypsine toe aan de kolf en incubeer bij 37 °C in een 5% CO2 -incubator gedurende 2-5 minuten.
  4. Voeg 5-10 ml cDMEM toe en draai de cellen gedurende 5 minuten op 350 x g . Verwijder de vloeistof en resuspendeer de celkorrel in 10 ml cDMEM. Tel de cellen en zaai 10-11 x 106 levensvatbare HEK293T cellen per T175-kolf in 20 ml cDMEM.
  5. Incubeer 's nachts bij 37 °C in een 5% CO2 -incubator om de HEK293T cellen 70%-80% confluentie te laten bereiken.
  6. Bevestig de volgende dag de samenvloeiing van cellen onder een lichtmicroscoop.
  7. Verwijder het medium uit de kolf met een serologische stripette van 25 ml zonder de monolaag van de cellen te verstoren.
  8. Voeg voorzichtig 10 ml DPBS toe en schud de plaat om de cellen te wassen, zorg ervoor dat u de monolaag van de cellen niet verstoort.
  9. Verwijder DPBS met een serologische stripette van 25 ml.
  10. Voeg 15 ml nieuw cDMEM toe aan de wand per T175-kolf om de monolaag van de cellen niet te verstoren en plaats de plaat terug in de incubator bij 37 °C.

2. Transfectie van HEK293T cellen met behulp van niet-liposomaal lipidetransfectiereagens

  1. Bereid in een centrifugebuis van 15 ml de lentivirale componenten: 2 μg lentiviraal plasmide, 1,5 μg pΔ8,91 (pCMV-Δ8,91) en 1 μg pMD2.G (pCMV-MD2.G) met Buffer EC (Transfection-reagenskit) tot een eindvolume van 600 μL.
  2. Voeg 36 μL enhancer-oplossing toe. Meng de componenten met behulp van een pipet van 1 ml door herhaaldelijk een deel van de vloeistof op te zuigen en druppelsgewijs direct op de resterende oplossing terug te plaatsen. Laat 5 minuten op kamertemperatuur (RT) intrekken.
  3. Voeg 120 μL transfectiereagens toe en meng ongeveer 20 keer zoals hierboven. Incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
  4. Voeg 5,2 ml cDMEM toe en meng zoals hierboven met een serologische stripette van 5 ml.
  5. Voeg met behulp van een wegwerptransferpipet het transfectiemengsel druppelsgewijs rechtstreeks toe aan de monolaag van de HEK293T cellen (vermijd de wanden van de kolf) en verdeel het mengsel op verschillende plaatsen in de kolf.
  6. Verdeel het plasmide door de kolf zachtjes heen en weer te wiegen. Zorg ervoor dat er geen vloeistof in het deksel van de kolf komt.
  7. Incubeer de kolf bij 37 °C gedurende 48 uur in een incubator van 5 % CO2 . Bevestig de effectieve transfectie van HEK293T cellen door het verschijnen van een fluorescerende marker, hier GFP, binnen 24 uur na transfectie gecontroleerd onder een fluorescerende microscoop voor celbeeldvorming.
    OPMERKING: Voor constructen zonder de fluorescerende marker moeten HEK293T cellen worden getest op de aanwezigheid van het gebruikte markergen of op expressieverandering in het gen/eiwit van belang door middel van geschikte technieken, bijv. qPCR. Als alternatief kan succesvolle transfectie indirect worden geverifieerd tijdens het testen van de lentiviruscollectie op Jurkat-cellen in de latere stadia van het protocol door middel van de bovenstaande technieken.
    LET OP: Getransfecteerde HEK293T cellen worden als besmettelijk beschouwd en er moeten passende veiligheidsmaatregelen worden genomen bij het hanteren van deze cellen. Lokale regels moeten worden gevolgd, waaronder doorgaans het werken onder een biologieveiligheidskast van categorie II, het gebruik van dubbele handschoenen en een geschikte ontsmettingsoplossing voor desinfectie, bijvoorbeeld een verhoogde concentratie van afvalbleekmiddel (2,000 ppm) of een gelijkwaardige oplossing volgens de richtlijnen voor bioveiligheid van de instelling. Alle oplossingen en kunststoffen die in contact komen met lentiviruspreparaat moeten worden gedesinfecteerd volgens de bioveiligheidsprocedures van de instelling.

3. Verzameling van lentivirale deeltjes

  1. Bereid een ontsmettingsoplossing, een bleekmiddel (natriumhypochloriet) met een hoge concentratie (2,000 ppm) of een gelijkwaardig middel volgens de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen voor in een emmer en plaats deze in de biologieveiligheidskast.
  2. Bereid de biologieveiligheidskast voor door overtollige items te verwijderen, zoals lege buisrekken enz.
  3. Label een centrifugebuis van 50 ml per T175 HEK293T cellen kolf vooraf en verwijder het deksel van de centrifugebuis. Plaats de buizen in een stabiel rek.
  4. Haal de kolf uit de incubator en bevestig de GFP-expressie met behulp van een fluorescentiemicroscoop met een laser van 488 nm (figuur 1A). De intensiteit van het signaal hangt af van de transfectie-efficiëntie van de procedure en de gebruikte constructies.
  5. Verzamel de media uit de cellen in de vooraf geëtiketteerde centrifugebuis van 50 ml. Kantel de T175 HEK293T kolf met getransfecteerde cellen zodat het medium zich in de benedenhoek van de kolf verzamelt. Gebruik een serologische stripette van 25 ml om het medium te verzamelen zonder de monolaag van de cel te verstoren. Sommige zwevende cellen kunnen op dit punt zichtbaar zijn. Breng het medium over in een schone centrifugebuis van 50 ml en sluit het deksel.
    1. Voeg met een serologische strip van 25 ml 25 ml verse, warme cDMEM toe aan de kolf. Zorg ervoor dat de mediumstroom op de wanden van de kolf wordt gericht om de monolaag van de cel niet te verstoren. Plaats de kolf met getransfecteerde HEK293T cellen terug in de incubator (37 °C, 5% CO2).
      OPMERKING: Een tweede verzameling van lentivirus en verdere zuivering kan na nog eens 24 uur worden uitgevoerd volgens de procedure die in de bovenstaande stappen wordt beschreven.
  6. Wanneer de verzameling van het lentivirus na 24 uur of 48 uur is voltooid, voegt u ontsmettingsoplossing toe aan de cellen en zorgt u ervoor dat deze de monolaag van de cel bedekt. Houd de kolf de volgende 24 uur horizontaal en gooi hem vervolgens weg volgens de toepasselijke voorschriften van categorie II.

4. Zuivering van lentivirus

  1. Filter verzamelmedium uit stap 3.5.
    1. Verwijder de zuiger van de spuit van 50 ml en plaats een laag eiwitbindend polyethersulfon of polyvinylideenfluoride 0,45 μm steriel filter in het uiteinde van de spuit. Gebruik een serologische strip van 25 ml om het verzamelde medium uit stap 3.5.1 toe te voegen aan de spuit en de zuiger voorzichtig terug te plaatsen.
    2. Duw de plug langzaam om het medium door het filter in een verse centrifugebuis van 50 ml te leiden. Als de stroom aanzienlijk afneemt, plaatst u de spuit met het filter naar boven gericht en trekt u de zuiger voldoende naar buiten om het medium uit het filter te verwijderen.
    3. Vervang het filter op de spuit voorzichtig door een nieuw exemplaar en gooi het gebruikte filter weg in de ontsmettingsoplossing. Ga door met gemiddelde filtratie. Als u klaar bent, ontsmet u het filter en de spuit door het filter onder te dompelen en de spuit te vullen met de ontsmettingsoplossing.
  2. Koel de ultracentrifuge voor door de temperatuur in te stellen op 4 °C en sluit het deksel om de temperatuur te laten acclimatiseren.
  3. Voeg 3 ml 20 % scharoseoplossing (20 % g/v in ultrapuur water, filter gesteriliseerd met een filter van 0,22 μm) toe aan de bodem van de conische ultracentrifugebuis.
  4. Gebruik een serologische stripette van 25 ml en leg een gefilterd medium op de sucroselaag en zorg ervoor dat de lagen niet worden verstoord.
    1. Gebruik de laagste snelheidsinstelling op de pipetjongen. Kantel de conische ultracentrifugebuis tot ongeveer 45° en voeg langzaam het gefilterde lentivirusbevattende medium uit stap 4.1 toe aan de buiswand. Zorg ervoor dat het medium en de sucrose zich niet vermengen en dat er een duidelijke scheiding van de lagen zichtbaar is (Figuur 1B). Naarmate het volume van de mediumlaag toeneemt, kantelt u de ultracentrifugebuis langzaam terug naar een rechtopstaande positie.
  5. Als het totale volume, inclusief de sucrose en het medium, in de ultracentrifugebuis minder is dan 29 ml, vul dan bij met verse cDMEM om te voorkomen dat de buis tijdens het centrifugeren instort. Voor meerdere verzamelingen van T175 ml, meng gefilterde mediumpreparaten en gebruik meerdere ultracentrifugebuisjes. Vul de laatste ultracentrifugebuis indien nodig bij met het medium.
  6. Zorg ervoor dat de ultracentrifuge-emmers schoon zijn; Er is geen medium residu op de bodem van de emmer of de doppen. Indien nodig, uitwissen met ~70 % alcohol. Plaats de juiste slangadapters op de bodem van elke emmer (Figuur 1C) en laat de ultracentrifugebuisjes voorzichtig in de emmers zakken.
  7. Sluit de bakken goed af en hang ze op de daarvoor bestemde plaatsen op de spin-out rotor.
  8. Zorg ervoor dat de emmers in evenwicht zijn met dezelfde hoeveelheden sucrose en medium. Een spin-out rotor mag nooit zonder bakken worden gebruikt, hoewel tegenoverliggende bakken leeg mogen worden gelaten20 (Figuur 1D).
  9. Plaats de rotor voorzichtig in de ultracentrifuge en zet het vacuüm aan. Stel de versnellings- en vertragingssnelheid van de ultracentrifuge in op de laagste stand en laat de lentiviruspreppen 90 minuten bij 4 °C op 85.000 x g draaien.
  10. Wacht tot de ultracentrifuge de vereiste snelheid heeft bereikt (ongeveer 3-5 minuten) voordat u wegloopt om ervoor te zorgen dat de rotor correct is geplaatst en dat het centrifugeren niet eindigt.
  11. Terwijl de ultracentrifuge draait, ruimt u de werkruimte op volgens de veiligheidseisen van categorie II en bereidt u de ruimte voor op de volgende stappen.
  12. Wanneer het centrifugeren is voltooid, schakelt u het vacuüm uit en verwijdert u voorzichtig de rotor om de monsters niet te verstoren.
  13. Onderzoek de ultracentrifuge op gemorste vloeistoffen en controleer of er geen lekken uit de emmers komen. In geval van morsen, dubbele handschoen en ontsmet de centrifuge en het buitenoppervlak van emmers met antivirale producten.
  14. Haal de emmers uit de ultracentrifuge en transporteer de emmers voorzichtig naar de biologieveiligheidskast van categorie II.
    OPMERKING: Lentivirusdeeltjes verzamelen zich op de bodem van de ultracentrifugebuis. De korrel is niet zichtbaar voor het blote oog.
  15. Giet de sucrose en het medium met één vloeiende beweging rechtstreeks in de afvalcontainer met de ontsmettingsoplossing.
  16. Houd de ultracentrifugebuis omgekeerd, breng deze over naar de dubbele laag weefsel en laat deze 10 minuten drogen. Veeg ondertussen de binnenkant van de emmers af met een met water doordrenkte tissue en laat ze ondersteboven aan de lucht drogen.
  17. Droog de resterende vloeistof van de rand van de ultracentrifugebuis voorzichtig af met een tissue voordat u deze rechtop zet. Desinfecteer het weefsel en het oppervlak eronder.
  18. Resuspendeer de viruspellet in 1 ml serumvrije media of oplossing die nodig is voor verdere experimenten door de oplossing voorzichtig op en neer te pipetteren. Laat het 15 minuten bij RT staan in de categorie II biologie veiligheidskast.
  19. Meng de lentiviruspreparaten voorzichtig met behulp van een pipet van 1 ml voordat u ze in 1,5 ml schroefdopbuisjes doet (bijv. cryobuisjes). Bereid de aliquots voor op het in vivo werk (veelvoud van 100 μL) en op de lentivirustiter in Jurkat T-cellen (1 x 20 μL) (zie stap 5).
  20. Vermijd vries-dooicycli; lentivirale preparaten kunnen tot 6 maanden bij -80 °C worden bewaard zonder een negatief effect op de besmettelijkheid.

5. Titrratie van de productie van lentivirus in Jurkat T-cellen

  1. Bereid het volledige Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (cRPMI-1640) voor Jurkat T-cellen voor door 500 ml RPMI-1640 aan te vullen met 10% (v/v) foetaal kalfsserum en een eindconcentratie van 100 E/ml penicilline/streptomycine.
  2. Om een gezonde kweek van Jurkat T-cellen te garanderen, moet u de cellen tot 1 week voor infectie in cultuur houden.
  3. Op de dag van de lentivirustitratie plaatst u levensvatbare Jurkat T-cellen in een plaat met 24 putjes bij 2 x 105 cellen/putje in 200 μL per putje cRPMI-1640.
  4. Gebruik vers opgevangen lentivirus of ontdooi de lentivirusflacon met 20 μl op ijs en meng voorzichtig door op en neer te pipetteren.
  5. Gebruik seriële verdunning in cRPMI-1640 om Jurkat T-cellen te infecteren met 0,25 μL, 0,5 μL, 1 μL, 2,5 μL, 5 μL en 10 μL lentivirusvoorraad. Schud de plaat voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van het lentivirus te garanderen. Niet-geïnfecteerde Jurkat T-cellen dienen als negatieve controle.
  6. Incubeer de plaat bij 37 °C. Vul na 4 uur elk putje bij met cRPMI tot een totaal volume van 400 μL. Plaats de plaat terug in de incubator bij 37 °C gedurende 3 dagen.
  7. Bevestig na 48 uur na infectie de GFP-expressie onder een fluorescerend beeldvormingssysteem.
  8. Verzamel 3 dagen na infectie elk putje van de plaat met 24 putjes in afzonderlijke verzamelbuisjes van 1,5 ml en centrifugeer de cellen bij 350 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten.
  9. Gooi het supernatant weg. Resuspendeer de pellet in 300 μL 2% paraformaldehyde (PFA) bereid tot 2% (g/v) in DPBS en laat het 15 minuten in het donker op ijs staan.
  10. Centrifugeer de cellen bij 350 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten en resuspendeer de pellet in een fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuffer (FACS) (steriel DPBS + 4% FCS + 1 mM steriele EDTA).
  11. Analyseer de GFP-expressiefrequentie en de gemiddelde fluorescerende intensiteit van het met lentivirus geïnfecteerde lentivirus en zijn controlecellen met behulp van flowcytometrie (Figuur 2).

6. In vivo lentivirusinfectie van in weefsel levende peritoneale macrofagen

  1. Plaats in een biologische veiligheidskast van categorie II insulinenaalden met een totaal volume van 200 μL serumvrij mediamedium dat de vereiste hoeveelheid lentivirus bevat (gebruik naalden voor eenmalig gebruik, 30 G voor dierenwelzijn en om vochtverlies in de naald te voorkomen).
  2. Plaats de naaldhuls terug op de naald met behulp van de techniek met één hand schepje. Houd de naald op ijs en injecteer binnen 30 minuten.
  3. Zet in de dierenfaciliteit een categorie II biologische veiligheidskast op voorafgaand aan de injecties (Figuur 1E).
    1. Leg een vel schoon zakdoekje neer. Maak het omhulsel op de insulinenaald met lentivirus los.
    2. Bereid een petrischaal voor met kleine stukjes tissue en een ontsmettingsmiddel op basis van chloorhexidinegluconaat, een tube van 50 ml met ontsmettingsoplossing (2,000 ppm bleekoplossing) en een scherpe veilige container.
  4. Houd de muis in bedwang door de huid in de nek vastte pakken 21. De goed in bedwang gehouden muis is onbeweeglijk en dit is vereist voor de veiligheid.
  5. Met de buik naar boven, richt je de kop van het dier iets naar beneden. Injecteer het lentivirus intraperitoneaal in het kwadrant rechtsonder in de buikholte. Dit is om injectie in peritoneale holteorganen te voorkomen.
  6. Voordat u de muis loslaat, vult u de spuit met ontsmettingsoplossing en gooit u deze veilig weg in de scherpe kluis.
  7. Veeg de injectieplaats op de buik van de muis af met een tissue gedrenkt in een ontsmettingsmiddel en plaats het dier terug in de kooi.
  8. Huisvest de met lentivirus geïnjecteerde muis in categorie II scantainer of individueel geventileerde kooien (IVC) (geïsoleerde kooien met zeer efficiënte luchtfiltratie) gedurende minimaal 72 uur na injectie. Plaats een geschikte informatiekaart op de voorkant van de kooi.
  9. Verplaats de muis naar de nieuwe kooi van categorie I na 72 uur na infectie, afhankelijk van de lokale veiligheidsgoedkeuringen. Controleer muizen dagelijks gedurende in totaal 3 dagen vanaf injectie.

7. Verzameling van peritoneale cellen van met lentivirus geïnfecteerde muizen

LET OP: Voor verzamelingen binnen 72 uur na de injectie met het lentivirus, volg de institutionele categorie II biologische veiligheidsregels. Strooisel en houdkooi waar besmette dieren in de eerste 72 uur na de injectie met het lentivirus werden gehouden, moeten worden ontsmet volgens de biologische veiligheidsregels van institutionele categorie II.

  1. Euthanaseer muizen volgens institutionele voorschriften, bijvoorbeeld door inademing van een toenemende concentratie CO2, gevolgd door bevestiging van dood door cervicale dislocatie.
  2. Reinig de buik van de muis met 70% isopropanol en snijd voorzichtig in de huid om het membraan van de buikholte bloot te leggen.
  3. Spoel de peritoneale holte af met 6 ml ijskoude FACS-buffer met behulp van een spuit van 10 ml en een naald van 23 G. Vermijd het doorboren van organen.
  4. Masseer zachtjes het buikvlies om cellen los te maken naar de FACS-buffer.
  5. Verzamel de buikvliesvloeistof met dezelfde spuit en naald.
  6. Verwijder de naald en breng de cellen over in een centrifugebuisje van 15 ml.
  7. Houd de peritoneale spoelingen op ijs.
  8. Verzamel andere benodigde organen en bewaar ze zoals geschikt voor het onderzoek.
  9. Gooi kadavers van dieren weg in overeenstemming met de lokale dier- en veiligheidsrichtlijnen.

8. Kleuring en analyse van peritoneale cellen

  1. Centrifugeer de peritoneale spoeling bij 350 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten, gooi het supernatans weg in de ontsmettingsoplossing en resuspendeer de cellen in 1 ml FACS-buffer.
  2. Tel de verzamelde cellen en plaat 4 x 105 cellen per putje in een V-bodem 96-wells plaat.
  3. Voer levensvatbaarheidskleuring uit met behulp van een fixeerbaar reagens (bijv. Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit die hier wordt gebruikt) volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Als cellen in de afgelopen 72 uur zijn geïnfecteerd, fixeer de cellen dan gedurende 15 minuten in 2% PFA op ijs. Voeg een gelijk volume koude DPBS toe en centrifugeer opnieuw op 350 x g bij 4 °C gedurende 5 min.
  5. Bereid de blokkeringsbuffer voor: Meng 4 μg/ml 2,4G2-antilichaam in 10% (v/v) rattenserum in FACS-buffer voor oppervlaktekleuring of permeabilisatiebuffer voor intracellulaire kleuring.
  6. Resuspendeer elk putje met celpellet in 50 μl blokkeerbuffer en incubeer bij 4 °C gedurende 15 minuten.
  7. Bereid een antilichaammengsel voor in 50 μl FACS-buffer (voor oppervlaktekleuring) of permeabilisatiebuffer (voor intracellulaire kleuring) per elk monster. Het uiteindelijke kleuringsvolume voor elk monster is 100 μL, inclusief 50 μL blokkeerbuffer. Bereken de antilichaamconcentraties dienovereenkomstig (tabel 1).
  8. Voeg 50 μL antilichaammix toe aan monsters en 50 μL isotypecontroles en controlebuffer aan controlemonsters. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten op ijs in het donker. Voeg indien nodig ongekleurde cellen en isotypecontroles toe.
  9. Was elk putje met 100-200 μL ijskoud DPBS en centrifugeer de plaat op 350 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Herhaal deze stap om eventuele ongebonden antilichamen weg te spoelen. Analyseer de monsters op een flowcytometer.

9. Extractie van cellen uit organen

  1. Bereid 1 ml spijsverteringsmix per orgaan: Meng Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), 2 mg/ml collagenase type IV en 0,03 mg/ml DNase I (inclusief 1,5 mg/ml hyaluronidase voor de longvertering).
  2. Breng het verzamelde orgaan over in 1 ml spijsverteringsmix en hak het fijn met een schaar.
  3. Filtreer de cellen door een zeef van 40 μm en centrifugeer bij 350 x g bij 4 °C gedurende 5 min.
  4. Als u cellen uit de long, milt of lever isoleert, lyseer dan rode bloedcellen met behulp van ACK-lysisbuffer (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA pH = 7,4). Filtreer de cellen door een zeef van 40 μm en centrifugeer bij 350 x g bij 4 °C gedurende 5 min.
  5. Kleuring en analyseer de cellen zoals beschreven in rubriek 8.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Wanneer dit protocol volledig en correct wordt gevolgd, levert het in totaal 1,5 ml hoogwaardige lentivirusvoorraad op per enkel preparaat, voldoende voor twaalf in-vivo-injecties in het optimale volume dat in deze studie is bepaald18. Het succes van de transfectie kan vroeg in het protocol worden geëvalueerd. Gezonde en confluente HEK293T cellen zouden, indien aanwezig in de plasmiden, na 48 uur na plasmidetransfectie een gemakkelijk detecteerbaar marker...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Weefsel-residente macrofagen voeren een reeks homeostatische en inflammatoire weefselspecifieke functiesuit 1,2 gedicteerd door hun fysiologische omgeving 6,7,8,9. In dit protocol werd een effectieve methode18 geïntroduceerd voor manipulatie van peritoneale residente macrofagen <...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd, geheel of gedeeltelijk, gefinancierd door de Wellcome Trust Investigator Award [107964/Z/15/Z]. P.R.T wordt ook ondersteund door het UK Dementia Research Institute. M.A.C wordt ondersteund door de Biotechnology and Biological Sciences Research Council Discovery Fellowship (BB/T009543/1). Ten behoeve van Open Access heeft de auteur een CC BY-licentie voor openbaar auteursrecht toegepast op elke door de auteur geaccepteerde manuscriptversie die voortkomt uit deze inzending. L.C.D is docent aan de Universiteit van Swansea en ere-onderzoeker aan de Universiteit van Cardiff. Dit werk wordt ondersteund door het werk van Ipseiz et al. 202018.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L of 0.02 mM)Thermo Fisher Scientific25300054
0.22 µm steriele millex GP-filterMerckSLGS033SS
0.45 µm steriele millex GP-filterMerckSLHP033RS
0.5 mL U-100 insulinesyringe met naald, 0,33 mm x 12,7 mm (29 G)BD324892
1 liter Sharps ContainerN/AN/A
2.4G2 antilichaam (TruStain FcX anti-muis CD16/32)Biolegend101320
40 µm zeefThermo Fisher Scientific22363547
AimV medium (onderzoekskwaliteit), AlbuMax SupplementThermo Fisher Scientific31035025
Blocking bufferzelf bereid
Brewer thioglycollaat mediumSigma-AldrichB25514% stockoplossing bereid in water, geautoclaveerd en ingevroren bewaard.
CD11bBiolegend101222Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD11bBD550993Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD11cBiolegend117317Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD11cBiolegend117333Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD19BD560375Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD19Biolegend152410Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD226Biolegend128808Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD3eBD560527Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD3eBiolegend152313Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD4Biolegend100412Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD73eBioscience16-0731-82Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD8aeBioscience48-0081-82Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
Celcultuurkolf (T175 kolf, 175 cm2, 550 mL)Greiner Bio One658175
Centrifugebuizen, conische bodembuizen 25 mm x 89 mmBeckman Coulter358126
CentrifugesBeckman CoulterUltracentrifuge en TC centrifuge
Collageenase type IVSigma-AldrichC5138
Conische centrifugebuizen (15 mL en 50 mL)Greiner Bio One11512303 & 11849650
CryotubesGreiner Bio One123277of cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamineThermo Fisher Scientific41965-062
Dnase ISigma-Aldrich11284932001
Effectene transfectiereagensQiagen301425
F4/80Biolegend123123Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
F4/80Biolegend123133Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
F4/80Biolegend123147Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
FceR1eBioscience48-5898-80Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
Foetaal kalfsserum (FCS) Thermo Fisher Scientific10270-10630 min bij 56 °C verwarmd en sterieel gefilterd door 0.22 µm filter
Flow cytometerThermo Fisher Scientific Attune NxT
Flow cytometry (FACS) bufferzelf bereid
Fluorescente weefselcultuurmicroscoopThermo Fisher ScientificEVOS FL
PincetN/AN/AGebruikersvoorkeur
Hank's balanced salt solution (HBSS)Gibco, Life Technologies14175-053
HEK293T cellijnTen minste een week gekweekt voorafgaand aan transfectie. Mycoplasma vrij
HIV-1 Core antigeenBeckman Coulter6604667
HyaluronidaseSigma-AldrichH3506
Hydrex chirurgische scrub, chlorhexidine gluconate 4% w/v huidreinigerEcolab3037170
I-A/I-EBiolegend107625Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
ICAM1Becton Dickinson554970Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
Jurkat T cellijnTen minste een week gekweekt voorafgaand aan gebruik. Mycoplasma vrij
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kitThermo Fisher ScientificL34975
Ly6GBiolegend127615Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
Muizenhier gebruikt C57BL/6 vrouwtjes, 8-12 weken oud (Charles Rivers), tenzij anders aangegeven
Microcapillaire pipetten (volumebereik 0.5-1.000 µL)Fisher Scientific & Starlab11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1Biolegend108724Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
ParaformaldehydeSigma-AldrichP

Referenties

  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Jantsch, J., Binger, K. J., Muller, D. N., Titze, J. Macrophages in homeostatic immune function. Front Physiol. 5, 146(2014).
  3. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  4. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  5. Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).
  6. Amit, I., Winter, D. R., Jung, S. The role of the local environment and epigenetics in shaping macrophage identity and their effect on tissue homeostasis. Nat Immunol. 17 (1), 18-25 (2016).
  7. Gosselin, D., et al. Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities. Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).
  8. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  9. Davies, L. C., et al. Peritoneal tissue-resident macrophages are metabolically poised to engage microbes using tissue-niche fuels. Nat Commun. 8 (1), 2047(2017).
  10. Shi, J., Hua, L., Harmer, D., Li, P., Ren, G. Cre driver mice targeting macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 263-275 (2018).
  11. Wang, X., et al. Recent advances in lentiviral vectors for gene therapy. Sci China Life Sci. 64 (11), 1842-1857 (2021).
  12. Kosaka, Y., et al. Lentivirus-based gene delivery in mouse embryonic stem cells. Artif Organs. 28 (3), 271-277 (2004).
  13. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  14. Yamashita, M., Emerman, M. Capsid is a dominant determinant of retrovirus infectivity in nondividing cells. J Virol. 78 (11), 5670-5678 (2004).
  15. Wilson, A. A., et al. Lentiviral delivery of RNAi for in vivo lineage-specific modulation of gene expression in mouse lung macrophages. Mol Ther. 21 (4), 825-833 (2013).
  16. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  17. Finkelshtein, D., Werman, A., Novick, D., Barak, S., Rubinstein, M. LDL receptor and its family members serve as the cellular receptors for vesicular stomatitis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7306-7311 (2013).
  18. Ipseiz, N., et al. Effective in vivo gene modification in mouse tissue-resident peritoneal macrophages by intraperitoneal delivery of lentiviral vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 21-31 (2020).
  19. Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
  20. BeckmanCoulter. , https://www.mybeckman.uk/resources/technologies/centrifugation/principles/rotor-balancing (2023).
  21. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
  22. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biotechnol. 15 (9), 871-875 (1997).
  23. Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  24. Optimized production and concentration of lentiviral vectors containing large inserts. J Gene Med. al Yacoub, N., Romanowska, M., Haritonova, N., Foerster, J. 9 (7), 579-584 (2007).
  25. Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV restriction factors and mechanisms of evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940(2012).
  26. Sonza, S., et al. Susceptibility of human monocytes to HIV type 1 infection in vitro is not dependent on their level of CD4 expression. AIDS Res Hum Retroviruses. 11 (7), 769-776 (1995).
  27. Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.1(2003).
  28. Brown, L. Y., Dong, W., Kantor, B. An Improved protocol for the production of lentiviral vectors. STAR Protoc. 1 (3), 100152(2020).
  29. Moce-Llivina, L., Jofre, J., Muniesa, M. Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions. J Virol Methods. 109 (1), 99-101 (2003).
  30. Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Sci Rep. 5, 13875(2015).
  31. Czubala, M. A., et al. TGFbeta induces a SAMHD1-independent post-entry restriction to HIV-1 infection of human epithelial langerhans cells. J Invest Dermatol. 136 (10), 1981-1989 (2016).
  32. Bouabe, H., Okkenhaug, K. Gene targeting in mice: a review. Methods Mol Biol. 1064, 315-336 (2013).
  33. Kim, J. M., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y. Regulatory T cells prevent catastrophic autoimmunity throughout the lifespan of mice. Nat Immunol. 8 (2), 191-197 (2007).
  34. Decalf, J., et al. Sensing of HIV-1 entry triggers a Type I Interferon response in human primary macrophages. J Virol. 91 (15), e00147-e00217 (2017).
  35. Wilson, A. A., et al. Amelioration of emphysema in mice through lentiviral transduction of long-lived pulmonary alveolar macrophages. J Clin Invest. 120 (1), 379-389 (2010).
  36. Markusic, D. M., van Til, N. P., Hiralall, J. K., Elferink, R. P., Seppen, J. Reduction of liver macrophage transduction by pseudotyping lentiviral vectors with a fusion envelope from Autographa californica GP64 and Sendai virus F2 domain. BMC Biotechnol. 9, 85(2009).
  37. Burke, B., Sumner, S., Maitland, N., Lewis, C. E. Macrophages in gene therapy: cellular delivery vehicles and in vivo targets. J Leukoc Biol. 72 (3), 417-428 (2002).
  38. Bain, C. C., Jenkins, S. J. The biology of serous cavity macrophages. Cell Immunol. 330, 126-135 (2018).
  39. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

peritoneale macrofagengenmodulatiein vivo-toedieningHEK293T-cellenintraperitoneale injectieultracentrifugatieGFP-fluorescentie
Lentivirale vectorvoorbereiding voor efficiënte gen- en microRNA-modulatie van macrofagen in buikholte in vivo bij muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.