Lentivirale vectorvoorbereiding voor efficiënte gen- en microRNA-modulatie van macrofagen in buikholte in vivo bij muizen

Samenvatting

We demonstreren een stapsgewijs protocol voor het onderzoek naar de genfunctie in macrofagen in peritoneaal weefsel in vivo, met behulp van lentivirale vectoren.

Samenvatting

Peritoneale weefsel-residente macrofagen hebben brede functies bij het handhaven van homeostase en zijn betrokken bij pathologieën in lokale en naburige weefsels. Hun functies worden bepaald door micro-omgevingssignalen; Het is dus essentieel om hun gedrag te onderzoeken in een in vivo fysiologische niche. Momenteel maken specifieke methodologieën voor het targeten van peritoneale macrofagen gebruik van transgene modellen van hele muizen. Hier wordt een protocol beschreven voor effectieve in vivo modulatie van de expressie van mRNA en kleine RNA-soorten (bijv. microRNA) in peritoneale macrofagen met behulp van lentivirusdeeltjes. Lentiviruspreparaten werden in HEK293T cellen gemaakt en gezuiverd op een enkele sucroselaag. In vivo validatie van de effectiviteit van het lentivirus na intraperitoneale injectie toonde een overheersende infectie van macrofagen aan die beperkt was tot lokaal weefsel. Targeting van peritoneale macrofagen was succesvol tijdens homeostase en thioglycolaat-geïnduceerde peritonitis. De beperkingen van het protocol, waaronder ontsteking op laag niveau veroorzaakt door intraperitoneale toediening van lentivirus en tijdsbeperkingen voor mogelijke experimenten, worden besproken. Over het algemeen presenteert deze studie een snel en toegankelijk protocol voor de snelle beoordeling van de genfunctie in peritoneale macrofagen in vivo.

Inleiding

Weefsel-residente macrofagen (Mφ) zijn een heterogene populatie van fagocytische immuuncellen die binnendringende ziekteverwekkers detecteren en erop reageren ^1,2. Bovendien spelen ze een essentiële rol bij weefselontwikkeling, remodellering en het handhaven van homeostase ^1,3. Veel weefsel Mφ zijn afkomstig van voorlopers van dooierzakjes tijdens de embryogenese en blijven gedurende het hele leven in het weefsel^{aanwezig 4,5}. Het fenotype en de functies van deze cellen worden bepaald door collaboratieve en hiërarchische interacties van specifieke transcriptiefactoren en de lokale micro-omgeving 6,7,8,9. Een groeiend begrip van deze afhankelijkheid vergroot de behoefte aan effectieve in vivo methoden voor genmanipulatie van Mφ binnen hun fysiologisch relevante niche.

Lentivirale vectoren zijn een vaak gebruikt hulpmiddel voor de manipulatie van nucleïnezuren in specifieke celpopulaties in vivo 10,11,12, met name vanwege hun vermogen om zowel delende als niet-delende cellen te infecteren en stabiel te integreren in het genoom van de gastheer ^13,14. In de afgelopen twee decennia is de technologie voor lentivirustoediening geoptimaliseerd en zijn alternatieve enveloppen en synthetische promotors onderzocht om de afstammingsspecifieke targeting te verhogen ^8,15. Vanwege zijn brede celtropisme is vesiculaire stomatitisvirus envelop glycoproteïne (VSV-G)^16,17 de "gouden standaard" envelop geworden die wordt gebruikt in de lentivirustechnologie.

In dit protocol¹⁸ worden VSV-G pseudogetypeerde lentivirale deeltjes gebruikt om gerichte en effectieve afgifte van kort haarspeld-RNA (shRNA) en microRNA (miR) aan peritoneale Mφ (pMφ) van muizen in vivo aan te tonen, bij steady-state¹⁹. Transgenexpressie werd aangedreven door de promotor van het miltfocusvormende virus (SFFV). Productieve infectie van cellen werd gedefinieerd door de expressie van van lentivirus afgeleid versterkt groen fluorescerend eiwit (GFP). Door gebruik te maken van deze aanpak konden in vivo lentivirusexperimenten gemakkelijk worden uitgelezen om de optimale dosis en het experimentele tijdsbestek te bepalen. Ten slotte onthulde in vivo lentivirale provocatie van muizen tijdens thioglycolaat-geïnduceerde ontsteking de natuurlijke neiging tot selectieve pMφ-infectie.

Protocol

Al het dierenwerk werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de instelling en het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken.

OPMERKING: Alle in vivo onderzoeken met lentivirus moeten worden uitgevoerd volgens de lokale en nationale richtlijnen voor het ethisch gebruik van dieren in onderzoek, en moeten worden nageleefd volgens alle voorschriften die verband houden met het gebruik van infectieus materiaal van categorie II. Het dierenwelzijn moet ook worden gecontroleerd in overeenstemming met de lokale regelgeving. In deze stap van het protocol moet uiterste voorzichtigheid worden betracht bij het werken met lentivirale deeltjes en scherpe voorwerpen.

1. Voorbereiding van HEK293T cellen voor transfectie

OPMERKING: Voer deze stappen uit onder een steriele biologische veiligheidskast voor weefselkweek.

1. Bereid volledig Dulbecco's Modified Eagle Medium (cDMEM) voor HEK293T cellen door de 450 ml DMEM te combineren met 10% (v/v) foetaal kalfsserum (50 ml) en een eindconcentratie van 100 E/ml penicilline/streptomycine.
2. Ontdooi HEK293T cellen ten minste 1 week voor de geplande transfectie. Zorg voor gezonde groeiomstandigheden en passage om de 2-3 dagen met behulp van trypsine + EDTA om de cellen los te maken van de kolf.
3. Zuig een dag voor de transfectie voorzichtig het groeimedium uit de cellen en was de cellen voorzichtig met steriel DPBS. Voeg 1-5 ml trypsine toe aan de kolf en incubeer bij 37 °C in een 5% CO₂ -incubator gedurende 2-5 minuten.
4. Voeg 5-10 ml cDMEM toe en draai de cellen gedurende 5 minuten op 350 x g . Verwijder de vloeistof en resuspendeer de celkorrel in 10 ml cDMEM. Tel de cellen en zaai 10-11 x 10⁶ levensvatbare HEK293T cellen per T175-kolf in 20 ml cDMEM.
5. Incubeer 's nachts bij 37 °C in een 5% CO₂ -incubator om de HEK293T cellen 70%-80% confluentie te laten bereiken.
6. Bevestig de volgende dag de samenvloeiing van cellen onder een lichtmicroscoop.
7. Verwijder het medium uit de kolf met een serologische stripette van 25 ml zonder de monolaag van de cellen te verstoren.
8. Voeg voorzichtig 10 ml DPBS toe en schud de plaat om de cellen te wassen, zorg ervoor dat u de monolaag van de cellen niet verstoort.
9. Verwijder DPBS met een serologische stripette van 25 ml.
10. Voeg 15 ml nieuw cDMEM toe aan de wand per T175-kolf om de monolaag van de cellen niet te verstoren en plaats de plaat terug in de incubator bij 37 °C.

2. Transfectie van HEK293T cellen met behulp van niet-liposomaal lipidetransfectiereagens

1. Bereid in een centrifugebuis van 15 ml de lentivirale componenten: 2 μg lentiviraal plasmide, 1,5 μg pΔ8,91 (pCMV-Δ8,91) en 1 μg pMD2.G (pCMV-MD2.G) met Buffer EC (Transfection-reagenskit) tot een eindvolume van 600 μL.
2. Voeg 36 μL enhancer-oplossing toe. Meng de componenten met behulp van een pipet van 1 ml door herhaaldelijk een deel van de vloeistof op te zuigen en druppelsgewijs direct op de resterende oplossing terug te plaatsen. Laat 5 minuten op kamertemperatuur (RT) intrekken.
3. Voeg 120 μL transfectiereagens toe en meng ongeveer 20 keer zoals hierboven. Incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
4. Voeg 5,2 ml cDMEM toe en meng zoals hierboven met een serologische stripette van 5 ml.
5. Voeg met behulp van een wegwerptransferpipet het transfectiemengsel druppelsgewijs rechtstreeks toe aan de monolaag van de HEK293T cellen (vermijd de wanden van de kolf) en verdeel het mengsel op verschillende plaatsen in de kolf.
6. Verdeel het plasmide door de kolf zachtjes heen en weer te wiegen. Zorg ervoor dat er geen vloeistof in het deksel van de kolf komt.
7. Incubeer de kolf bij 37 °C gedurende 48 uur in een incubator van 5 % CO₂ . Bevestig de effectieve transfectie van HEK293T cellen door het verschijnen van een fluorescerende marker, hier GFP, binnen 24 uur na transfectie gecontroleerd onder een fluorescerende microscoop voor celbeeldvorming.
   OPMERKING: Voor constructen zonder de fluorescerende marker moeten HEK293T cellen worden getest op de aanwezigheid van het gebruikte markergen of op expressieverandering in het gen/eiwit van belang door middel van geschikte technieken, bijv. qPCR. Als alternatief kan succesvolle transfectie indirect worden geverifieerd tijdens het testen van de lentiviruscollectie op Jurkat-cellen in de latere stadia van het protocol door middel van de bovenstaande technieken.
   LET OP: Getransfecteerde HEK293T cellen worden als besmettelijk beschouwd en er moeten passende veiligheidsmaatregelen worden genomen bij het hanteren van deze cellen. Lokale regels moeten worden gevolgd, waaronder doorgaans het werken onder een biologieveiligheidskast van categorie II, het gebruik van dubbele handschoenen en een geschikte ontsmettingsoplossing voor desinfectie, bijvoorbeeld een verhoogde concentratie van afvalbleekmiddel (2,000 ppm) of een gelijkwaardige oplossing volgens de richtlijnen voor bioveiligheid van de instelling. Alle oplossingen en kunststoffen die in contact komen met lentiviruspreparaat moeten worden gedesinfecteerd volgens de bioveiligheidsprocedures van de instelling.

3. Verzameling van lentivirale deeltjes

1. Bereid een ontsmettingsoplossing, een bleekmiddel (natriumhypochloriet) met een hoge concentratie (2,000 ppm) of een gelijkwaardig middel volgens de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen voor in een emmer en plaats deze in de biologieveiligheidskast.
2. Bereid de biologieveiligheidskast voor door overtollige items te verwijderen, zoals lege buisrekken enz.
3. Label een centrifugebuis van 50 ml per T175 HEK293T cellen kolf vooraf en verwijder het deksel van de centrifugebuis. Plaats de buizen in een stabiel rek.
4. Haal de kolf uit de incubator en bevestig de GFP-expressie met behulp van een fluorescentiemicroscoop met een laser van 488 nm (figuur 1A). De intensiteit van het signaal hangt af van de transfectie-efficiëntie van de procedure en de gebruikte constructies.
5. Verzamel de media uit de cellen in de vooraf geëtiketteerde centrifugebuis van 50 ml. Kantel de T175 HEK293T kolf met getransfecteerde cellen zodat het medium zich in de benedenhoek van de kolf verzamelt. Gebruik een serologische stripette van 25 ml om het medium te verzamelen zonder de monolaag van de cel te verstoren. Sommige zwevende cellen kunnen op dit punt zichtbaar zijn. Breng het medium over in een schone centrifugebuis van 50 ml en sluit het deksel.
   1. Voeg met een serologische strip van 25 ml 25 ml verse, warme cDMEM toe aan de kolf. Zorg ervoor dat de mediumstroom op de wanden van de kolf wordt gericht om de monolaag van de cel niet te verstoren. Plaats de kolf met getransfecteerde HEK293T cellen terug in de incubator (37 °C, 5% CO₂).
      OPMERKING: Een tweede verzameling van lentivirus en verdere zuivering kan na nog eens 24 uur worden uitgevoerd volgens de procedure die in de bovenstaande stappen wordt beschreven.
6. Wanneer de verzameling van het lentivirus na 24 uur of 48 uur is voltooid, voegt u ontsmettingsoplossing toe aan de cellen en zorgt u ervoor dat deze de monolaag van de cel bedekt. Houd de kolf de volgende 24 uur horizontaal en gooi hem vervolgens weg volgens de toepasselijke voorschriften van categorie II.

4. Zuivering van lentivirus

1. Filter verzamelmedium uit stap 3.5.
   1. Verwijder de zuiger van de spuit van 50 ml en plaats een laag eiwitbindend polyethersulfon of polyvinylideenfluoride 0,45 μm steriel filter in het uiteinde van de spuit. Gebruik een serologische strip van 25 ml om het verzamelde medium uit stap 3.5.1 toe te voegen aan de spuit en de zuiger voorzichtig terug te plaatsen.
   2. Duw de plug langzaam om het medium door het filter in een verse centrifugebuis van 50 ml te leiden. Als de stroom aanzienlijk afneemt, plaatst u de spuit met het filter naar boven gericht en trekt u de zuiger voldoende naar buiten om het medium uit het filter te verwijderen.
   3. Vervang het filter op de spuit voorzichtig door een nieuw exemplaar en gooi het gebruikte filter weg in de ontsmettingsoplossing. Ga door met gemiddelde filtratie. Als u klaar bent, ontsmet u het filter en de spuit door het filter onder te dompelen en de spuit te vullen met de ontsmettingsoplossing.
2. Koel de ultracentrifuge voor door de temperatuur in te stellen op 4 °C en sluit het deksel om de temperatuur te laten acclimatiseren.
3. Voeg 3 ml 20 % scharoseoplossing (20 % g/v in ultrapuur water, filter gesteriliseerd met een filter van 0,22 μm) toe aan de bodem van de conische ultracentrifugebuis.
4. Gebruik een serologische stripette van 25 ml en leg een gefilterd medium op de sucroselaag en zorg ervoor dat de lagen niet worden verstoord.
   1. Gebruik de laagste snelheidsinstelling op de pipetjongen. Kantel de conische ultracentrifugebuis tot ongeveer 45° en voeg langzaam het gefilterde lentivirusbevattende medium uit stap 4.1 toe aan de buiswand. Zorg ervoor dat het medium en de sucrose zich niet vermengen en dat er een duidelijke scheiding van de lagen zichtbaar is (Figuur 1B). Naarmate het volume van de mediumlaag toeneemt, kantelt u de ultracentrifugebuis langzaam terug naar een rechtopstaande positie.
5. Als het totale volume, inclusief de sucrose en het medium, in de ultracentrifugebuis minder is dan 29 ml, vul dan bij met verse cDMEM om te voorkomen dat de buis tijdens het centrifugeren instort. Voor meerdere verzamelingen van T175 ml, meng gefilterde mediumpreparaten en gebruik meerdere ultracentrifugebuisjes. Vul de laatste ultracentrifugebuis indien nodig bij met het medium.
6. Zorg ervoor dat de ultracentrifuge-emmers schoon zijn; Er is geen medium residu op de bodem van de emmer of de doppen. Indien nodig, uitwissen met ~70 % alcohol. Plaats de juiste slangadapters op de bodem van elke emmer (Figuur 1C) en laat de ultracentrifugebuisjes voorzichtig in de emmers zakken.
7. Sluit de bakken goed af en hang ze op de daarvoor bestemde plaatsen op de spin-out rotor.
8. Zorg ervoor dat de emmers in evenwicht zijn met dezelfde hoeveelheden sucrose en medium. Een spin-out rotor mag nooit zonder bakken worden gebruikt, hoewel tegenoverliggende bakken leeg mogen worden gelaten²⁰ (Figuur 1D).
9. Plaats de rotor voorzichtig in de ultracentrifuge en zet het vacuüm aan. Stel de versnellings- en vertragingssnelheid van de ultracentrifuge in op de laagste stand en laat de lentiviruspreppen 90 minuten bij 4 °C op 85.000 x g draaien.
10. Wacht tot de ultracentrifuge de vereiste snelheid heeft bereikt (ongeveer 3-5 minuten) voordat u wegloopt om ervoor te zorgen dat de rotor correct is geplaatst en dat het centrifugeren niet eindigt.
11. Terwijl de ultracentrifuge draait, ruimt u de werkruimte op volgens de veiligheidseisen van categorie II en bereidt u de ruimte voor op de volgende stappen.
12. Wanneer het centrifugeren is voltooid, schakelt u het vacuüm uit en verwijdert u voorzichtig de rotor om de monsters niet te verstoren.
13. Onderzoek de ultracentrifuge op gemorste vloeistoffen en controleer of er geen lekken uit de emmers komen. In geval van morsen, dubbele handschoen en ontsmet de centrifuge en het buitenoppervlak van emmers met antivirale producten.
14. Haal de emmers uit de ultracentrifuge en transporteer de emmers voorzichtig naar de biologieveiligheidskast van categorie II.
    OPMERKING: Lentivirusdeeltjes verzamelen zich op de bodem van de ultracentrifugebuis. De korrel is niet zichtbaar voor het blote oog.
15. Giet de sucrose en het medium met één vloeiende beweging rechtstreeks in de afvalcontainer met de ontsmettingsoplossing.
16. Houd de ultracentrifugebuis omgekeerd, breng deze over naar de dubbele laag weefsel en laat deze 10 minuten drogen. Veeg ondertussen de binnenkant van de emmers af met een met water doordrenkte tissue en laat ze ondersteboven aan de lucht drogen.
17. Droog de resterende vloeistof van de rand van de ultracentrifugebuis voorzichtig af met een tissue voordat u deze rechtop zet. Desinfecteer het weefsel en het oppervlak eronder.
18. Resuspendeer de viruspellet in 1 ml serumvrije media of oplossing die nodig is voor verdere experimenten door de oplossing voorzichtig op en neer te pipetteren. Laat het 15 minuten bij RT staan in de categorie II biologie veiligheidskast.
19. Meng de lentiviruspreparaten voorzichtig met behulp van een pipet van 1 ml voordat u ze in 1,5 ml schroefdopbuisjes doet (bijv. cryobuisjes). Bereid de aliquots voor op het in vivo werk (veelvoud van 100 μL) en op de lentivirustiter in Jurkat T-cellen (1 x 20 μL) (zie stap 5).
20. Vermijd vries-dooicycli; lentivirale preparaten kunnen tot 6 maanden bij -80 °C worden bewaard zonder een negatief effect op de besmettelijkheid.

5. Titrratie van de productie van lentivirus in Jurkat T-cellen

1. Bereid het volledige Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (cRPMI-1640) voor Jurkat T-cellen voor door 500 ml RPMI-1640 aan te vullen met 10% (v/v) foetaal kalfsserum en een eindconcentratie van 100 E/ml penicilline/streptomycine.
2. Om een gezonde kweek van Jurkat T-cellen te garanderen, moet u de cellen tot 1 week voor infectie in cultuur houden.
3. Op de dag van de lentivirustitratie plaatst u levensvatbare Jurkat T-cellen in een plaat met 24 putjes bij 2 x 10⁵ cellen/putje in 200 μL per putje cRPMI-1640.
4. Gebruik vers opgevangen lentivirus of ontdooi de lentivirusflacon met 20 μl op ijs en meng voorzichtig door op en neer te pipetteren.
5. Gebruik seriële verdunning in cRPMI-1640 om Jurkat T-cellen te infecteren met 0,25 μL, 0,5 μL, 1 μL, 2,5 μL, 5 μL en 10 μL lentivirusvoorraad. Schud de plaat voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van het lentivirus te garanderen. Niet-geïnfecteerde Jurkat T-cellen dienen als negatieve controle.
6. Incubeer de plaat bij 37 °C. Vul na 4 uur elk putje bij met cRPMI tot een totaal volume van 400 μL. Plaats de plaat terug in de incubator bij 37 °C gedurende 3 dagen.
7. Bevestig na 48 uur na infectie de GFP-expressie onder een fluorescerend beeldvormingssysteem.
8. Verzamel 3 dagen na infectie elk putje van de plaat met 24 putjes in afzonderlijke verzamelbuisjes van 1,5 ml en centrifugeer de cellen bij 350 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten.
9. Gooi het supernatant weg. Resuspendeer de pellet in 300 μL 2% paraformaldehyde (PFA) bereid tot 2% (g/v) in DPBS en laat het 15 minuten in het donker op ijs staan.
10. Centrifugeer de cellen bij 350 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten en resuspendeer de pellet in een fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuffer (FACS) (steriel DPBS + 4% FCS + 1 mM steriele EDTA).
11. Analyseer de GFP-expressiefrequentie en de gemiddelde fluorescerende intensiteit van het met lentivirus geïnfecteerde lentivirus en zijn controlecellen met behulp van flowcytometrie (Figuur 2).

6. In vivo lentivirusinfectie van in weefsel levende peritoneale macrofagen

1. Plaats in een biologische veiligheidskast van categorie II insulinenaalden met een totaal volume van 200 μL serumvrij mediamedium dat de vereiste hoeveelheid lentivirus bevat (gebruik naalden voor eenmalig gebruik, 30 G voor dierenwelzijn en om vochtverlies in de naald te voorkomen).
2. Plaats de naaldhuls terug op de naald met behulp van de techniek met één hand schepje. Houd de naald op ijs en injecteer binnen 30 minuten.
3. Zet in de dierenfaciliteit een categorie II biologische veiligheidskast op voorafgaand aan de injecties (Figuur 1E).
   1. Leg een vel schoon zakdoekje neer. Maak het omhulsel op de insulinenaald met lentivirus los.
   2. Bereid een petrischaal voor met kleine stukjes tissue en een ontsmettingsmiddel op basis van chloorhexidinegluconaat, een tube van 50 ml met ontsmettingsoplossing (2,000 ppm bleekoplossing) en een scherpe veilige container.
4. Houd de muis in bedwang door de huid in de nek vast^{te pakken 21}. De goed in bedwang gehouden muis is onbeweeglijk en dit is vereist voor de veiligheid.
5. Met de buik naar boven, richt je de kop van het dier iets naar beneden. Injecteer het lentivirus intraperitoneaal in het kwadrant rechtsonder in de buikholte. Dit is om injectie in peritoneale holteorganen te voorkomen.
6. Voordat u de muis loslaat, vult u de spuit met ontsmettingsoplossing en gooit u deze veilig weg in de scherpe kluis.
7. Veeg de injectieplaats op de buik van de muis af met een tissue gedrenkt in een ontsmettingsmiddel en plaats het dier terug in de kooi.
8. Huisvest de met lentivirus geïnjecteerde muis in categorie II scantainer of individueel geventileerde kooien (IVC) (geïsoleerde kooien met zeer efficiënte luchtfiltratie) gedurende minimaal 72 uur na injectie. Plaats een geschikte informatiekaart op de voorkant van de kooi.
9. Verplaats de muis naar de nieuwe kooi van categorie I na 72 uur na infectie, afhankelijk van de lokale veiligheidsgoedkeuringen. Controleer muizen dagelijks gedurende in totaal 3 dagen vanaf injectie.

7. Verzameling van peritoneale cellen van met lentivirus geïnfecteerde muizen

LET OP: Voor verzamelingen binnen 72 uur na de injectie met het lentivirus, volg de institutionele categorie II biologische veiligheidsregels. Strooisel en houdkooi waar besmette dieren in de eerste 72 uur na de injectie met het lentivirus werden gehouden, moeten worden ontsmet volgens de biologische veiligheidsregels van institutionele categorie II.

1. Euthanaseer muizen volgens institutionele voorschriften, bijvoorbeeld door inademing van een toenemende concentratie CO₂, gevolgd door bevestiging van dood door cervicale dislocatie.
2. Reinig de buik van de muis met 70% isopropanol en snijd voorzichtig in de huid om het membraan van de buikholte bloot te leggen.
3. Spoel de peritoneale holte af met 6 ml ijskoude FACS-buffer met behulp van een spuit van 10 ml en een naald van 23 G. Vermijd het doorboren van organen.
4. Masseer zachtjes het buikvlies om cellen los te maken naar de FACS-buffer.
5. Verzamel de buikvliesvloeistof met dezelfde spuit en naald.
6. Verwijder de naald en breng de cellen over in een centrifugebuisje van 15 ml.
7. Houd de peritoneale spoelingen op ijs.
8. Verzamel andere benodigde organen en bewaar ze zoals geschikt voor het onderzoek.
9. Gooi kadavers van dieren weg in overeenstemming met de lokale dier- en veiligheidsrichtlijnen.

8. Kleuring en analyse van peritoneale cellen

1. Centrifugeer de peritoneale spoeling bij 350 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten, gooi het supernatans weg in de ontsmettingsoplossing en resuspendeer de cellen in 1 ml FACS-buffer.
2. Tel de verzamelde cellen en plaat 4 x 10⁵ cellen per putje in een V-bodem 96-wells plaat.
3. Voer levensvatbaarheidskleuring uit met behulp van een fixeerbaar reagens (bijv. Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit die hier wordt gebruikt) volgens de instructies van de fabrikant.
4. Als cellen in de afgelopen 72 uur zijn geïnfecteerd, fixeer de cellen dan gedurende 15 minuten in 2% PFA op ijs. Voeg een gelijk volume koude DPBS toe en centrifugeer opnieuw op 350 x g bij 4 °C gedurende 5 min.
5. Bereid de blokkeringsbuffer voor: Meng 4 μg/ml 2,4G2-antilichaam in 10% (v/v) rattenserum in FACS-buffer voor oppervlaktekleuring of permeabilisatiebuffer voor intracellulaire kleuring.
6. Resuspendeer elk putje met celpellet in 50 μl blokkeerbuffer en incubeer bij 4 °C gedurende 15 minuten.
7. Bereid een antilichaammengsel voor in 50 μl FACS-buffer (voor oppervlaktekleuring) of permeabilisatiebuffer (voor intracellulaire kleuring) per elk monster. Het uiteindelijke kleuringsvolume voor elk monster is 100 μL, inclusief 50 μL blokkeerbuffer. Bereken de antilichaamconcentraties dienovereenkomstig (tabel 1).
8. Voeg 50 μL antilichaammix toe aan monsters en 50 μL isotypecontroles en controlebuffer aan controlemonsters. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten op ijs in het donker. Voeg indien nodig ongekleurde cellen en isotypecontroles toe.
9. Was elk putje met 100-200 μL ijskoud DPBS en centrifugeer de plaat op 350 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Herhaal deze stap om eventuele ongebonden antilichamen weg te spoelen. Analyseer de monsters op een flowcytometer.

9. Extractie van cellen uit organen

1. Bereid 1 ml spijsverteringsmix per orgaan: Meng Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), 2 mg/ml collagenase type IV en 0,03 mg/ml DNase I (inclusief 1,5 mg/ml hyaluronidase voor de longvertering).
2. Breng het verzamelde orgaan over in 1 ml spijsverteringsmix en hak het fijn met een schaar.
3. Filtreer de cellen door een zeef van 40 μm en centrifugeer bij 350 x g bij 4 °C gedurende 5 min.
4. Als u cellen uit de long, milt of lever isoleert, lyseer dan rode bloedcellen met behulp van ACK-lysisbuffer (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM Na₂EDTA pH = 7,4). Filtreer de cellen door een zeef van 40 μm en centrifugeer bij 350 x g bij 4 °C gedurende 5 min.
5. Kleuring en analyseer de cellen zoals beschreven in rubriek 8.

Resultaten

Wanneer dit protocol volledig en correct wordt gevolgd, levert het in totaal 1,5 ml hoogwaardige lentivirusvoorraad op per enkel preparaat, voldoende voor twaalf in-vivo-injecties in het optimale volume dat in deze studie is bepaald¹⁸. Het succes van de transfectie kan vroeg in het protocol worden geëvalueerd. Gezonde en confluente HEK293T cellen zouden, indien aanwezig in de plasmiden, na 48 uur na plasmidetransfectie een gemakkelijk detecteerbaar markersignaal moeten vertonen (bijv. GFP gebruikt in dit onderzoek) (Figuur 1A). De lage intensiteit van het signaal, overmatige celloslating en lage confluentie in de vroege stappen van het protocol kunnen duiden op celdood en zullen resulteren in een lage opbrengst van het lentiviruspreparaat. Een deel van de celloslating voorafgaand aan optionele verzameling II (stap 3.5.1.) is zichtbaar en te verwachten.

In dit protocol worden drie plasmiden gebruikt voor het genereren van lentivirusdeeltjes: pCMV-ΔR8.91 verpakkingsplasmide dat codeert voor structureel HIV-1-eiwit (Gag), accessoire-eiwitten Tat en Rev, en reverse transcriptase-polymerase (Pol)²²; pMD2.G-codering VSV-G-envelop onder CMV-promotor¹³; en pHR'SIN-cPPT-SEW-plasmide (coderend voor verbeterde GFP-marker)¹⁹ dienovereenkomstig gemodificeerd voor de expressie van shRNA of microRNA.

Lentiviruspreparaten worden getitreerd in de Jurkat T-cellijn vanwege hun hoge besmettelijkheid²³. Succesvol lentiviruspreparaat zal een infectiepercentage van meer dan 95% bereiken met een dosis van slechts 5 μL (Figuur 2A). De gemiddelde fluorescerende intensiteit van de geïnfecteerde cellen blijft toenemen met de hogere doses (Figuur 2B,C). Indien nodig kunnen virale titers worden gemeten met behulp van real-time PCR van geïntegreerde virale componenten, bijv. de SFFV-promotor, die lineair correleerde met het percentage GFP-expressieve cellen en logaritmisch met GFP MFI (Figuur 2D). Afhankelijk van het construct, met name die met een groot inzetstuk²⁴, kunnen sommige lentiviruspreparaten een verminderde infectiviteit vertonen in Jurkat T-cellen, zoals aangetoond voor het Cre-GFP-construct dat in deze studie wordt gebruikt (Figuur 2E,F). In een dergelijk geval kunnen meerdere preparaten van lentivirusdeeltjes worden gecombineerd en geresuspendeerd in 1 ml. We raden aan om de immuunrespons op die preparaten in vivo te valideren voordat er wordt geëxperimenteerd. Uiteraard kunnen lentiviruspreparaten met alternatieve ingangsreceptoren voor VSV-G die hier worden gebruikt, verschillende infectie-efficiëntie vertonen in de Jurkat T-cellijn, afhankelijk van de receptorexpressie op de cellen. De cellijnen die voor de titratie worden gebruikt, moeten zo worden gekozen dat ze de receptor tot expressie brengen die door de lentivirusdeeltjes wordt gebruikt om de cellen binnen te dringen en bij voorkeur geen of een zeer lage expressie van de restrictiefactoren hebben²⁵.

Succesvolle productie van lentivirale deeltjes wordt verder aangetoond door infectie van pMφ (gedefinieerd als CD11b⁺ F4/80⁺ en Tim4⁺ populatie)¹⁸ (Figuur 3A). We hebben vastgesteld dat intraperitoneale injectie van 100 μL lentiviruspreparaat (in een totaal volume van 200 μL serumvrije media) het hoogste percentage en de hoogste intensiteit van het GFP-signaal in deze cellen oplevert (Figuur 3B,C). Injecties met hogere doses (150 μL en 200 μL lentiviruspreparaat) hadden geen gunstige invloed op de GFP-expressie in de pMφ. Experimenten met tijdsverloop 4 uur, 3 dagen, 7 dagen en 14 dagen na intraperitoneale (i.p) injectie met 100 μL lentivirus onthulden een significant percentage GFP-expressie residente pMφ op dag 3 en 7, gevolgd door het verdwijnen van de geïnfecteerde populatie op dag 14 (Figuur 3D, E). Interessant is dat GFP-expressie pMφ meestal verdwijnt op dag 14 na infectie, deels als gevolg van immuunherkenning van de GFP-marker. Inderdaad, lentivirusexperimenten met GFP-marker in T-Reg-selectieve, Foxp3-DTR-eGFP-muizen voorkomen afstoting van geïnfecteerde residente pMφ tot ten minste dag 21 (Figuur 3F). Voor lentiviruspreparaten met verminderde effectiviteit in Jurkat-cellen zou een hogere hoeveelheid nodig zijn om het verwachte infectiepercentage in vivo te bereiken. Echter, zoals aangetoond met Cre-GFP lentiviruspreparaat, afhankelijk van het constructontwerp, kan zelfs een dosis van 300 μL 7 dagen na i.p-injectie een slecht resultaat opleveren (Figuur 3G). We hebben eerder succesvol gebruik van dit protocol aangetoond voor overexpressie en knockdown van genen in vivo in pMφ van muizen, waaronder lentivirale shRNA-gemedieerde Map3k8 en Gata6 knockdown, en Gata6 overexpressie¹⁹. Hier laten we zien dat dit protocol ook met succes kan worden gebruikt voor overexpressie van muizenmicroRNA 146b (mmu-miR-146b) en voor knockdown van intercellulaire adhesiemolecuul 1 (ICAM1, CD54) met behulp van lentiviraal afgeleid shRNA in resident pMφ (Figuur 3H,I).

Infectie van primaire cellen, zoals macrofagen, vereist een hogere lentivirus-input, vermoedelijk vanwege de aanwezigheid van restrictiefactoren in deze cellen. Restrictiefactoren zijn natuurlijke beschermingsmechanismen van cellen die interfereren met de levenscyclusstappen van virussen, zoals reverse transcriptie of integratie, wat leidt tot remming van genexpressie van de constructen.

Verdere in vivo validatie van het protocol toonde geen effect van de i.p-lentivirusafgifte op de levensvatbaarheid van peritoneale immuuncellen (Figuur 4A) en wees op duidelijke infectiviteit van residente pMφ-subpopulaties (gedefinieerd door de expressie van CD73- en Tim4-markers) (Figuur 4B,C). Belangrijk is dat productieve lentivirusinfectie beperkt was tot ingezeten Mφ op de injectieplaats, zoals blijkt uit het ontbreken van significante GFP-expressie in mesenteriale lymfeklier (mLN), long, lever of milt Mφ na 7 dagen na provocatie (Figuur 4D). Gezien het feit dat in veel gevallen genetische targeting van Mφ vereist is om te worden uitgevoerd onder inflammatoire omstandigheden, hebben we de effectiviteit van dit protocol onderzocht bij muizen die intraperitoneaal werden uitgedaagd met 0,1 ml 4% thioglycolaat. Injectie met thioglycolaat veroorzaakt een instroom van inflammatoire monocyt-afgeleide Mφ- en monocytaire cellen die kunnen worden onderverdeeld in 5 verschillende populaties (Figuur 4E). Flowcytometrie-analyse onthulde een refractair fenotype van monocytaire cellen (Ly6C^{hi-populaties} 1 en 2) voor lentivirusinfectie, in lijn met eerdere bevindingen in menselijke cellen²⁶. Daarentegen bleven residente Mφ en monocyten (groepen 3-5) het meest vatbaar voor infectie (Figuur 4F).

Gedetailleerde flowcytometrische analyse detecteerde GFP-expressie voornamelijk in residente peritoneale Mφ en major histocompatibility complex (MHC) klasse II⁺ residente pMφ (MHCII⁺ F4/80⁺ Tim4⁺) (tot 60% op dag 3 na injectie) (Figuur 5A). Er werd weinig tot geen GFP-signaal gedetecteerd in andere peritoneale celpopulaties, waaronder beenmerg-afgeleide peritoneale Mφs/DC's (MHCII⁺, CD11b⁺, CD11c⁺), B-cellen (CD19⁺), T-cellen (CD3⁺), mestcellen (CD11b^-, FcεR1⁺), eosinofielen (Siglec-F⁺), ^NK-cellen (CD19-, NK1.1⁺) en neutrofielen (Ly6G⁺) (Figuur 5A,B). De levensduur van de GFP-expressie (Figuur 5C) in alle populaties volgde deze van residente peritoneale Mφ (Figuur 1D). Een voorbijgaande toename van de neutrofielenfrequentie werd geregistreerd na 4 uur na i.p-injectie van 100 μl (in een totaal volume van 200 μl serumvrije media) van lentivirus (figuur 5D), wat wijst op een vroege milde ontsteking bij uitgedaagde dieren. Ten slotte ervoer residente pMφ een grote daling van de frequentie tussen dag 7 en 14 na infectie (figuur 5E), wat wijst op het beste experimentele venster tussen dag 3 en 7 na injectie.

Figuur 1: Lentivirusproductie in HEK293T cellen. (A) Representatieve immunofluorescentiefoto's van HEK293T cellen 48 uur na succesvolle transfectie (fluorescentiemicroscoop [488 nm excitatiepiek, 510 nm emissiepiek], 20x vergroting, schaalbalk = 400 μm). (B) Foto van een conische ultracentrifugebuis met een laag 20% sucrose (onder, doorzichtig) en een laag medium verzameld uit getransfecteerde HEK293T cellen (boven, rood). (C) Foto van het correct inbrengen van de conische ultracentrifuge in de emmer, inclusief adapter. (D) Foto's waarop de juiste en onjuiste balancering van de ultracentrifugerotor te zien is. (E) Foto van de optimale opstelling van de Cat II-kast en materialen voor in vivo injecties voor een rechtshandige persoon. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Ipseiz N et ^al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Lentivirustitratie in Jurkat T-cellen. (A) Representatieve flowcytometrische analyse van Jurkat T-cellen 72 uur na infectie met toenemende doses lentivirus dat een GFP-plasmide bevat, waarbij het percentage GFP⁺ -cellen (GFP⁺) wordt weergegeven, (B) gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van GFP^+- cellen en (C) een representatief histogram van GFP-expressie. (D) Spreidingsdiagram met MFI (links Y) en het percentage cellen dat is geïnfecteerd met een lentivirus dat GFP tot expressie brengt (rechts Y) versus het aantal gedetecteerde kopieën van het virus per pg DNA (x-as). (E) Een representatief histogram van Jurkat T-celinfectie met suboptimaal Cre-GFP lentivirus (Cre-GFP LV) preparaat en controle GFP-lentivirus (GFP LV) en (F) samenvattende gegevens die het percentage Cre-GFP-lentivirusgeïnfecteerde Jurkat T-cellen (GFP⁺) aantonen. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Ipseiz N et ^al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Infectie-efficiëntie van de residente pMФ. (A) Poortstrategie van residente pMφ (CD11b⁺, Tim4⁺, F4/80⁺) en Tim4^-, F4/80⁺ cellen. Cellen werden afgesloten op singlets, gevolgd door CD11b⁺. (B) Representatieve dot plots, en (C) een samenvatting van de infectiefrequentie (% GFP+-cellen) en intensiteit (MFI) van GFP^+- cellen geïsoleerd 3 dagen na in vivo infectie met verschillende hoeveelheden GFP-lentiviruspreparaat. (D) Representatieve dot plot, en (E) een samenvatting van de infectiefrequentie (% GFP+-cellen) en intensiteit (MFI) van GFP+-cellen geïsoleerd op verschillende tijdstippen na in vivo infectie met 100 μL lentivirus in een totaal volume van 200 μL serumvrij mediamedium. (F) Een samenvatting van het aantal cellen op dag 7, 14 en 21 na intraperitoneale toediening van GFP-expressie lentivirus in Foxp3-DTR-eGFP-muizen met het aantal GFP-expressie pMφ en inflammatoire macrofagen en dendritische cellen (InfMØs/DC's [F480^laag]). (n= 1-2 per groep). (G) Representatieve dot plot van suboptimale in vivo infectie van Gata6-KO ^{mye 19} resident pMφ met 300 μL Cre-GFP lentivirus 7 dagen na i.p-injectie. (H) RT-qPCR-kwantificering van mmu-miR-146b-5p-expressie van residente peritoneale Mφ die in vivo wordt uitgedaagd met 100 μL lentivirus dat codeert voor muizen microRNA-146b (miR-146b) of controle (C). Residente pMφ (witte cirkels) en Tim4^-, F4/80⁺ cellen (grijze cirkels). (I) Een representatieve dot plot van succesvolle downregulatie van ICAM1 op pMφ bij vrouwelijke 129S6 muizen, 7 dagen na i.p injectie van lentivirus dat gericht shRNA bevat. Controle shRNA wordt getoond. De overlay toont isotypecontrole. Gegevens uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, n≥2 muizen. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Ipseiz N et ^al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Infectie-efficiëntie van de residente pMφ-subpopulaties. (A) Percentage van het totale aantal afzonderlijke cellen en ingezeten Mφ levensvatbaar 7 dagen na 100 μL serumvrije media (-) of GFP-lentivirus (+) i.p-injectie. (B) ^{Gating-strategie} met vier belangrijke populaties van pMφ die in vivo worden aangetroffen: CD73⁺Tim4⁺, CD73-Tim4-, CD73⁺Tim4^-, CD73-Tim4⁺, en (C) overeenkomstige infectiefrequentie (% GFP+^-cellen) en intensiteit (MFI van GFP+-cellen) van deze populaties. (D) Percentage GFP+-cellen in meerdere organen 7 dagen na injectie met 100 μL lentivirus i.p. Afkortingen: mLN, mesenteriale lymfeklier. (E) Muizen werden gedurende 5 dagen i.p geïnjecteerd met 0,1 ml 4% thioglycolaat, gevolgd door i.p-injectie met lentivirus. Gating-strategie van pMφ en monocyten na 3 dagen na injectie met lentivirus i.p. (F) Infectiefrequentie, MFI en celnummeranalyse van GFP+-monocyten (Ly6C⁺) en Mφ (Ly6C^-). Gegevens uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, n≥3 muizen. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Ipseiz N et ^al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Impact van lentivirusinjectie op peritoneale ontsteking. Muizen werden in vivo i.p geïnjecteerd met GFP die lentivirus tot expressie brengt. (A) Infectiefrequentie van celpopulaties in de peritoneale holte na verschillende hoeveelheden lentivirusinjecties (50 μL, 100 μL, 150 μL of 200 μL). (B) Intensiteit van GFP-expressie in productief geïnfecteerde celpopulaties 7 dagen na i.p-injectie. (C) Infectiefrequentie van celpopulaties in de peritoneale holte op verschillende tijdstippen na i.p-injectie. (D) en (E) Percentage cellen op verschillende tijdstippen na i.p-injectie. Alle lentivirus-injecties werden uitgevoerd met hetzelfde totale volume van 200 μL, aangevuld met een serumvrij mediamedium. Tenzij anders aangegeven, werd een dosis van 100 μL lentivirus gebruikt. Controlemuizen ("C") kregen 200 μL zuiver serumvrij mediamedium. Gegevens uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, n≥3 muizen. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Ipseiz N et ^al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Antilichaam doelwit	Fluorofoor	Kloon	Gebruikte verdunning	eindconcentratie [μg/ml]
HIV-1 Kernantigeen	RD1	FH190-1-1	1/100	1
I-A/I-E	PerCpCy5.5 zei:	M5/114.15.2	1/400	0.5
Ly6G	PerCpCy5.5 zei:	1A8 Niet beschikbaar.	1/400	0.5
CD3e	PerCpCy5.5 zei:	17A2 Niet beschikbaar.	1/200	1
CD3e	PE/Cy7	500A2	1/400	0.5
CD11c	PE/Cy7	N418	1/800	0.25
CD11c	BV605 NL	N418	1/400	0.5
CD226 zei:	AF647	10 Euro 5	1/400	1.25
Tim4 zei:	AF647	RTM4-54	1/600	0.83
CD4	APC	GK1.5 NL	1/400	0.5
CD11b	AF700	M1/70	1/700	0.71
CD11b	PerCpCy5.5 zei:	M1/70	1/400	0.5
F4/80	Pacifisch blauw	BM8	1/700	0.71
F4/80	BV605 NL	BM8	1/400	0.25
F4/80	BV711	BM8	1/400	0.5
CD73 zei:	eFluor450 zei:	TY/11.8	1/400	2.5
CD19 NL	V450	1D3	1/400	0.5
CD19 NL	APC	1D3	1/400	0.5
CD8a	eFluor450 zei:	53-6.7	1/400	0.5
SiglecF	BV421	E50-2440	1/400	0.5
NK1.1	APC/Cy7	PK136 NL	1/400	0.5
FceR1	eFluor450 zei:	MAART-1	1/400	0.5
ICAM1	PE	1A29 Niet beschikbaar.	1/100	2
Rat IgG1, κ isotype controle	PE		1/100	2

Tabel 1: Lijst van antilichamen

Discussie

Weefsel-residente macrofagen voeren een reeks homeostatische en inflammatoire weefselspecifieke functies^{uit 1,2} gedicteerd door hun fysiologische omgeving ^6,7,8,9. In dit protocol werd een effectieve methode¹⁸ geïntroduceerd voor manipulatie van peritoneale residente macrofagen in vivo met behulp van lentivirusdeeltjes om de functie van macrofagen in hun biologische micro-omgeving te onderzoeken.

Het is essentieel voor het succes van het protocol om gezonde HEK293T cellen te gebruiken. Het is de beste gewoonte om de cellen ten minste een week voor de start van dit protocol te ontdooien om celherstel en goede aantallen te garanderen. Cellen moeten één dag voor de geplande transfectie in een geschikte hoeveelheid medium worden gezaaid en moeten op de dag van transfectie ongeveer 80% confluentie bereiken. Onder- of overconfluente celpreparaten zullen resulteren in een verminderde lentivirusopbrengst. Voor het beste resultaat raden we aan om HEK293T cellen te transfecteren met het transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant. Essentiële stappen van de transfectie zijn onder meer de juiste menging van de plasmiden en reagentia en druppelsgewijze toevoeging van het mengsel rechtstreeks aan de monolaag van de HEK293T cellen. Calciumfosfaattransfectie van HEK293T cellen^27,28 zou in dit protocol kunnen worden gebruikt. De gebruiker moet zich er echter van bewust zijn dat de effectiviteit van deze methode kan variëren en dat dit kan leiden tot een verminderde transfectie-efficiëntie.

Veiligheidsmaatregelen moeten in het protocol worden overwogen vanaf de dag van HEK293T celtransfectie. Deze omvatten het werken in een veiligheidskast van categorie II, het dragen van dubbele handschoenen bij het hanteren van besmet materiaal en het juiste bleken van het verontreinigde materiaal (met ontsmettingsoplossing, bijvoorbeeld bleekoplossing van 2,000 ppm) gedurende minimaal 4 uur. Gebruikers dienen hun instellingsreglement te raadplegen met betrekking tot het werken met ziekteverwekkers en afval van categorie II.

In dit protocol wordt het lentiviruspreparaat eerst gezuiverd met behulp van een filter van 0,45 μm om HEK293T celresten te verwijderen. Het gebruik van kleinere filters (0,22 μm) en cellulose-estermembranen moet worden vermeden, omdat dit leidt tot het verlies van lentivirusdeeltjes. Het wordt aanbevolen om laag-eiwitbindende polyethersulfon- of polyvinylideenfluoridefilters^{te gebruiken 29}. De tweede zuiveringsstap wordt uitgevoerd op de enkele sucroselaag van 20% in een ultracentrifuge om resterende onzuiverheden te verwijderen, wat vooral belangrijk is voor de daaropvolgende in vivo toediening van het lentiviruspreparaat. In de instellingen waar geen ultracentrifuge beschikbaar is, hebben andere³⁰ op sucrose gebaseerde lentiviruszuivering beschreven met behulp van een standaard laboratoriumcentrifuge. Dit zou als alternatief in dit protocol kunnen worden geïmplementeerd. Lentiviruspreparaat wordt getitreerd in Jurkat T-cellen op basis van de expressie van het markersignaal (bijv. GFP dat in dit protocol wordt gebruikt). Voor constructen zonder markers kunnen fysieke lentivirusdeeltjes worden geëvalueerd door kwantificering van het HIV-1 p24gag-eiwit met ELISA-kit³¹, flowcytometrieanalyse van HIV-1-kernantigeen¹⁸ of meting van de veranderingen in het beoogde gen (bij voorkeur met behulp van de methoden waarmee veranderingen in individuele cellen kunnen worden gemeten, bijv. flowcytometrie of microscopie). Als titratie van de controlegroep en het lentivirus significant verschillen in Jurkat T-cellen, kunnen de volumes die voor de in vivo onderzoeken worden gebruikt, worden aangepast om de meest vergelijkbare infectie tussen lentiviruspreparaten te bereiken.

De belangrijkste beperking van het protocol is de waargenomen verdwijning van GFP⁺ residente peritoneale Mφ binnen 14 dagen na injectie met i.p lentivirus. Voor langetermijnstudies moeten muizenlijnen met een stabiele genetische verandering in een specifiek celtype of weefsels worden overwogen³². Omdat peritoneale macrofagen bijvoorbeeld geen Foxp3 (een T-Reg-eiwit) tot expressie brengen, gebruikten we Foxp3-DTR-eGFP-muizen³³ en bevestigden we dat de expressie van GFP 21 dagen na infectie behouden blijft in peritoneale Mφ (Figuur 3F). Het is echter belangrijk op te merken dat de lentivirussen andere vreemde componenten bevatten en dat deze uitbreiding van de persistentie van geïnfecteerde cellen in de Foxp3-DTR-GFP-muizen mogelijk niet permanent is. Een bijkomend zwak punt van deze methode is een laag ontstekingsniveau dat kan worden waargenomen in de peritoneale holte na injectie met lentivirus, zoals blijkt uit de instroom van neutrofielen 4 uur na injectie (Figuur 5D), wat kan betekenen dat herhaalde infecties het ontstekingsgerelateerde verlies van GFP-expressie residente peritoneale Mφ zouden versnellen. Hoewel we geen type I-interferonen (IFN's) in de peritoneale holte hebben gedetecteerd, is eerder aangetoond dat VSV-G pseudogetypeerde lentivirusdeeltjes enkele van de IFN-gestimuleerde genen in menselijk Mφ induceren in afwezigheid van detecteerbare IFN's³⁴. Hiermee moet rekening worden gehouden bij het gebruik van dit protocol voor experimenten waarin antivirale immuunresponsen worden onderzocht. Het optreden van acute en aanhoudende ontsteking na i.p-injectie van lentiviruspreparaat kan duiden op besmetting van het preparaat.

Gebieden voor probleemoplossing zijn onder meer: 1) voor een lage lentivirustiter, zorgen voor de gezondheid van HEK293T cellen en effectieve transfectie (bijv. markerexpressie, indien aanwezig, in HEK293T cellen). Als het infectiepercentage laag blijft, houd dan rekening met de grootte van het construct. Constructen met grotere inserts of complexere secundaire structuren kunnen de uiteindelijke lentivirustiter en infectiviteit beïnvloeden²⁴. Daarom moet elk construct onafhankelijk en parallel aan zijn respectieve controlevector worden getest; 2) Als een hoge hoeveelheid van het lentivirus nodig is, wordt aanbevolen om meerdere T175-kolven met HEK293T cellen te bereiden en de productie dienovereenkomstig op te schalen. Om variatie van de lentiviruspreparaten te voorkomen, is het de beste gewoonte om de definitieve collecties samen te voegen voordat ze worden gealiquoteerd en opgeslagen. Voor een dergelijke grotere productie moet het plasmidenmengsel (deel 2) worden bereid in buisjes van 50 ml om een effectieve menging van de componenten te garanderen.

Ondanks het brede tropisme richten VSV-G pseudogetypeerde lentivirale deeltjes zich voornamelijk op weefselmacrofagen, zoals eerder aangetoond voor alveolair³⁵, en hier¹⁸ voor pMФ wanneer ze via de respectieve routes worden toegediend. Veranderingen in de envelop op lentivirusdeeltjes kunnen in sommige gevallen leiden tot verminderde transductie van macrofagen in vivo³⁶ en zijn niet nodig voor dit protocol. Vergeleken met andere virale benaderingen voor in vivo genmanipulatie in macrofagen (besproken in³⁷), biedt het gebruik van lentivirale vectoren een stabiele integratie van het transgen in weefselmacrofagen³⁵, efficiënte transgenexpressie en de limiet voor de grootste vectorgrootte (ongeveer 8 Kb).

Peritoneale Mφ spelen een belangrijke rol bij de preventie, het ontstaan, de progressie en het verdwijnen van verschillende ziekten, waaronder buikkanker, pancreatitis en peritonitis³⁸. Dit protocol beschrijft een effectief hulpmiddel voor genmodificatie in muizen pMφ, waarmee onderzoek naar de biologische processen achter deze pathologieën binnen een fysiologisch relevante micro-omgeving kan worden gedaan. Hoewel lentivirale vectoren zelf een interessant instrument worden voor klinische interventies³⁹, belemmeren de veiligheidsproblemen vanwege de oorsprong van het immunodeficiëntievirus en een stabiele genoomintegratie de therapeutische implementatie ervan. Een beter begrip van de macrofaagresponsen op lentivirale genmodulatie zou de toepassing van dit zeer effectieve hulpmiddel in een klinische setting kunnen bevorderen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L of 0.02 mM)	Thermo Fisher Scientific	25300054
0.22 µm steriele millex GP-filter	Merck	SLGS033SS
0.45 µm steriele millex GP-filter	Merck	SLHP033RS
0.5 mL U-100 insulinesyringe met naald, 0,33 mm x 12,7 mm (29 G)	BD	324892
1 liter Sharps Container	N/A	N/A
2.4G2 antilichaam (TruStain FcX anti-muis CD16/32)	Biolegend	101320
40 µm zeef	Thermo Fisher Scientific	22363547
AimV medium (onderzoekskwaliteit), AlbuMax Supplement	Thermo Fisher Scientific	31035025
Blocking buffer	zelf bereid
Brewer thioglycollaat medium	Sigma-Aldrich	B2551	4% stockoplossing bereid in water, geautoclaveerd en ingevroren bewaard.
CD11b	Biolegend	101222	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD11b	BD	550993	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD11c	Biolegend	117317	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD11c	Biolegend	117333	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD19	BD	560375	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD19	Biolegend	152410	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD226	Biolegend	128808	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD3e	BD	560527	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD3e	Biolegend	152313	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD4	Biolegend	100412	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD73	eBioscience	16-0731-82	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
CD8a	eBioscience	48-0081-82	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
Celcultuurkolf (T175 kolf, 175 cm2, 550 mL)	Greiner Bio One	658175
Centrifugebuizen, conische bodembuizen 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	358126
Centrifuges	Beckman Coulter		Ultracentrifuge en TC centrifuge
Collageenase type IV	Sigma-Aldrich	C5138
Conische centrifugebuizen (15 mL en 50 mL)	Greiner Bio One	11512303 & 11849650
Cryotubes	Greiner Bio One	123277	of cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Effectene transfectiereagens	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
F4/80	Biolegend	123133	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
F4/80	Biolegend	123147	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
FceR1	eBioscience	48-5898-80	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
Foetaal kalfsserum (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	30 min bij 56 °C verwarmd en sterieel gefilterd door 0.22 µm filter
Flow cytometer	Thermo Fisher Scientific	Attune NxT
Flow cytometry (FACS) buffer	zelf bereid
Fluorescente weefselcultuurmicroscoop	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Pincet	N/A	N/A	Gebruikersvoorkeur
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Gibco, Life Technologies	14175-053
HEK293T cellijn			Ten minste een week gekweekt voorafgaand aan transfectie. Mycoplasma vrij
HIV-1 Core antigeen	Beckman Coulter	6604667
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506
Hydrex chirurgische scrub, chlorhexidine gluconate 4% w/v huidreiniger	Ecolab	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
ICAM1	Becton Dickinson	554970	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
Jurkat T cellijn			Ten minste een week gekweekt voorafgaand aan gebruik. Mycoplasma vrij
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kit	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
Muizen			hier gebruikt C57BL/6 vrouwtjes, 8-12 weken oud (Charles Rivers), tenzij anders aangegeven
Microcapillaire pipetten (volumebereik 0.5-1.000 µL)	Fisher Scientific & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	Zie tabel 1 voor de verdunning en concentratie
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P