Standaardisatie van overdracht tussen laboratoria tussen flowcytometers voor detectie van lymfocyten bij Japanse encefalitis gevaccineerde kinderen

Samenvatting

In deze studie werd een methode ontwikkeld om de overdracht van experimentele instellingen en analysesjablonen tussen twee flowcytometers in twee laboratoria voor de detectie van lymfocyten bij Japanse encefalitis-gevaccineerde kinderen te vergemakkelijken. De standaardisatiemethode voor de flowcytometerexperimenten zal het mogelijk maken om onderzoeksprojecten effectief uit te voeren in meerdere centra.

Samenvatting

Een toenemend aantal laboratoria moet gegevens verzamelen van meerdere flowcytometers, vooral voor onderzoeksprojecten die in meerdere centra worden uitgevoerd. De uitdagingen van het gebruik van twee flowcytometers in verschillende laboratoria omvatten het gebrek aan gestandaardiseerde materialen, softwarecompatibiliteitsproblemen, inconsistenties in instrumentinstellingen en het gebruik van verschillende configuraties voor verschillende flowcytometers. Om een gestandaardiseerd flowcytometrie-experiment op te zetten om de consistentie en vergelijkbaarheid van experimentele resultaten over meerdere centra te bereiken, werd een snelle en haalbare standaardisatiemethode vastgesteld om parameters over verschillende flowcytometers over te dragen.

De methoden die in deze studie werden ontwikkeld, maakten de overdracht van experimentele instellingen en analysesjablonen mogelijk tussen twee flowcytometers in verschillende laboratoria voor de detectie van lymfocyten bij Japanse encefalitis (JE) -gevaccineerde kinderen. Een consistente fluorescentie-intensiteit werd verkregen tussen de twee cytometers met behulp van fluorescentiestandaardparels om de cytometerinstellingen vast te stellen. Vergelijkbare resultaten werden verkregen in twee laboratoria met verschillende soorten instrumenten. Met behulp van deze methode kunnen we de analyse voor het evalueren van de immuunfunctie van JE-gevaccineerde kinderen in verschillende laboratoria met verschillende instrumenten standaardiseren, de verschillen in gegevens en resultaten tussen flowcytometers in meerdere centra verminderen en een haalbare aanpak bieden voor de wederzijdse accreditatie van laboratoriumresultaten. De standaardisatiemethode van flowcytometerexperimenten zal zorgen voor de effectieve uitvoering van onderzoeksprojecten in meerdere centra.

Inleiding

De standaardisatie van flowcytometrie is nuttig voor de vergelijkbaarheid van resultaten verkregen van verschillende cytometers in verschillende laboratoria en studiecentra, en bevorderlijk voor de wederzijdse erkenning van resultaten om de werkefficiëntie te verbeteren. Steeds meer scenario's vragen om standaardisatie. Tijdens het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen is standaardisatie van flowcytometrie belangrijk, omdat een ontwikkelde en gevalideerde test het hele ontwikkelingsproces van geneesmiddelen van preklinische tot klinische analyse zal ondersteunen. Flowcytometrische methoden worden vaak overgedragen tussen de farmaceutische industrie en samenwerkende laboratoria¹. Bovendien is het essentieel om vergelijkbare gegevens te verkrijgen uit multicentrische klinische studies. In het Systemic Autoimmune Diseases Multicenter Clinical Research Project is bijvoorbeeld een standaardisatieworkflow ontwikkeld om vergelijkbare gegevens uit multicentrische flowcytometrie² te verkrijgen.

De standaardisatie van flowcytometriemethoden is een uitdaging. De uitdagingen die in laboratoria worden ervaren, worden toegeschreven aan het gebrek aan gestandaardiseerde materialen, softwarecompatibiliteitsproblemen, inconsistenties in instrumentconfiguratie en het gebruik van verschillende configuraties tussen verschillende flowcytometers en divergente gatingstrategieën tussen de centra ^3,4. Daarom is het belangrijk om een gap-analyse tussen laboratoria uit te voeren. Monstertoegang, kwaliteitssystemen, personeelskwalificaties en instrumentconfiguratie moeten worden herzien om ervoor te zorgen dat aan de vereisten wordt voldaan.

Op dit moment hebben kinderen die zijn gevaccineerd met het Japanse encefalitis (JE) -vaccin een significant verminderde incidentie van JE⁵. Het monitoren van perifere bloedimmuuncellen kan helpen bij het begrijpen van de veranderingen in celgemedieerde adaptieve immuniteit na vaccinatie, en de correlatie tussen de veranderingen in perifere bloedlymfocytensubsets en de effecten van vaccinatie. Vanwege de beperkte stabiliteit van volbloedmonsters worden evaluaties van de werkzaamheid van het vaccin vaak in meerdere centra uitgevoerd. Voor deze analyse definieerden we naïeve CD8+ of CD4+ T-cellen als CD27+ CD45RA+, centrale geheugen T-cellen (T CM) als CD27+ CD45RA-, effectorgeheugen T-cellen (T_EM) als CD27- CD45RA-, en terminaal gedifferentieerde effectorgeheugen T-cellen (T EMRA) als CD27^- CD45RA⁺. CD19⁺ B-cellen kunnen worden onderverdeeld in populaties die CD27 versus IgD ^6,7 tot expressie brengen, naïeve B-cellen drukken CD27n-geheugen tot expressie B-cellen (mBC's) kunnen worden geïdentificeerd op basis van de expressie van IgD^6, en regulerende T-cellen (Tregs) kunnen worden geïdentificeerd als CD4 ⁺ CD25 ⁺⁺ CD127^{laag 8}. Om een gestandaardiseerd flowcytometrie-experiment op te zetten om de consistentie en vergelijkbaarheid van experimentele resultaten in meerdere centra te bereiken, werd een snelle en haalbare standaardisatiemethode vastgesteld om de overdracht van protocollen over verschillende flowcytometers voor de detectie van lymfocyten in het volbloed van JE-gevaccineerde kinderen te vergemakkelijken. Zes gezonde kinderen (2 jaar oud) werden gerekruteerd uit het Beijing Children's Hospital, Capital Medical University. Na het ontvangen van een prime en boost vaccinatie met een levend verzwakt JE SA14-14-2 vaccin minder dan 6 maanden eerder, werden perifere bloedmonsters verzameld van de vrijwilligers. Zeer vergelijkbare gegevens werden verkregen uit verschillende instrumenten volgens gestandaardiseerde procedures, wat nuttig is voor multicenter-beoordelingen.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (goedkeuringsnummer: 2020-k-85). Van geïnformeerde toestemming van menselijke proefpersonen werd afgezien omdat in deze studie alleen restmonsters na klinische tests werden gebruikt. Bij dit onderzoek zijn twee labo's betrokken. Het overdrachtslaboratorium is waar de gestandaardiseerde methode werd ontwikkeld met behulp van één flowcytometer. De cytometer in dit lab wordt hierna cytometer A genoemd. Het testmethodelaboratorium is het laboratorium dat methoden ontvangt met behulp van een andere flowcytometer en de cytometer in dit laboratorium wordt hierna cytometer B genoemd.

1. Perifere bloedmonsterverzameling en celvoorbereiding

1. Verzamel perifere bloedmonsters (2 ml) van JE-gevaccineerde kinderen en niet-gevaccineerde kinderen in EDTA-K 2-antistollingsbuizen door standaard venapunctie.
2. Meng het volbloedmonster door de buisjes 10x ondersteboven te draaien. Voeg 100 μL volbloed toe aan een buis van 12 mm x 75 mm. Maak elk monster in tweevoud.
3. Voeg 10 μL briljante vlekbuffer (BV-buffer) toe aan een buis van 12 mm x 75 mm. Voeg 5 μL van elk antilichaam (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; verdunningsfactor: 1:20) en 20 μL antilichaam (CD25, CD45RA; verdunningsfactor: 1:5) toe aan de BV-buffer. Vortex zachtjes.
   OPMERKING: De volumes en informatie van de antilichaamreagentia zijn weergegeven in tabel 1.
4. Voeg de antilichaamcocktail toe aan de buis met het volbloedmonster. Vortex zachtjes en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten in het donker.
5. Verdun de 10x lyseeroplossing 1:10 met gedestilleerd water om 1x lyseeroplossing te bereiden. Lyseer de bloedmonsters door 2 ml 1x lyserende oplossing toe te voegen. Vortex zachtjes en incubeer gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
6. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 × g en decanteer het supernatant.
7. Resuspensie van de pellet in 2 ml 1x PBS, centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 × g en decanteer het supernatant.
8. Resuspensie van de pellet in 0,5 ml 1x PBS en meng grondig. Bewaren bij 2 °C tot 8 °C. Stuur de monsters naar de twee laboratoria voor flowcytometrische analyse.
   OPMERKING: Het negatieve controlemonster en het enkelgekleurde controleorgaan moeten gelijktijdig worden verwerkt.

2. Voorbereiden van compensatiekralen en enkelvlekbediening

1. Label V500-anti-CD45 single-stained, APC-H7-anti-CD3 single-stained, FITC-anti-CD4 single-stained, R718-anti-CD8 single-stained, BV605-anti-CD27 single-stained, APC-anti-CD45RA single-stained, PE-anti-CD25 single-stained, BV421-anti-CD127 single-stained, BB700-anti-CD19 single-stained, en PE-CY7-anti-IgD single-stained tubes.
2. Voeg 100 μL 1x Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) buffer met 1% foetaal runderserum (FBS) toe aan een 5 ml polystyreen reageerbuis met ronde bodem.
3. Voeg 50 μL van de negatieve kralen en 50 μL van de anti-muis Ig, κ kralen toe aan elke buis en vortex.
4. Voeg 2 μL van elk gelabeld antilichaam (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) toe aan een enkelgekleurde buis. Draai het mengsel voorzichtig en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur (20 °C tot 25 °C).
5. Resuspendeer de kralen in 2 ml 1x PBS, centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten en decanteer het supernatant.
6. Resuspendeer de kralen in 0,5 ml 1x PBS en meng grondig. Bewaren bij 2 °C tot 8 °C.

3. Het gebruik van identieke configuratienamen op de verschillende cytometers in twee laboratoria

1. Maak een nieuwe configuratie aan in de software van cytometer A. Klik op de knop Cytometer en kies configuraties weergeven om het configuratievenster weer te geven.
2. Klik in de configuratielijst met de rechtermuisknop op de map met basisconfiguraties, kies Nieuwe map en wijzig de naam ervan.
3. Klik met de rechtermuisknop op de basisconfiguratie en kies Kopiëren.
4. Klik met de rechtermuisknop op de nieuwe map en plak de basisconfiguratie om een nieuwe configuratie te maken. Wijzig de naam van de nieuwe configuratie "Standardized Method Transfer".
5. Sleep de parameternaam, zoals FITC, van de lijst Parameters naar de juiste detector (530/30).
6. Bewerk aanvullende parameters (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 en BV605) naar de nieuwe configuratie.
7. Volg deze methode om een nieuwe configuratie te maken op een ander flowcytometermodel met dezelfde naam "Standardized Method Transfer". Zorg ervoor dat de configuratie voor elke detector dezelfde parameters bevat.
   OPMERKING: Als u de experimentsjabloon op de twee verschillende flowcytometermodellen wilt identificeren, moet u ervoor zorgen dat de naam consistent is.
8. Gebruik onder de cytometerconfiguraties CST-kralen (Cytometer Setup and Tracking) om de basislijn van de cytometer te definiëren en de prestaties van de cytometer bij te houden. Klik op de knop Cytometer en kies CST om de werkruimte voor het instellen en bijhouden van de cytometer weer te geven.
9. Voeg drie druppels (150 μL) set-setparels toe aan 0,5 ml 1x PBS in een 5 ml polystyreen reageerbuis met ronde bodem. Plaats de kralenbuis op de cytometer.
10. Kies in het venster Setup Control de optie Baseline definiëren en klik op Uitvoeren.

4. Standaardisatie-experiment met cytometer A in het overdrachtslaboratorium

1. Voer een prestatiecontrole uit met behulp van de cytometerinstelling en trackingparels om te controleren of de cytometer goed presteert.
2. Klik in het browservenster van de software met de rechtermuisknop op de cytometerinstellingen en kies Toepassingsinstellingen om een werkblad te maken.
3. Pas met behulp van een niet-gekleurd monster de pmt-spanningen (fotomultiplicatorbuis) van FSC, SSC en alle fluorescentieparameters aan. FSC: 260; SSC: 460; FITC: 490; PE: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; APC: 600; R718: 620; APC-H7: 620; BV421: 466; V500: 420; en BV605: 505.
4. Klik met de rechtermuisknop op de cytometerinstellingen van het experiment en kies toepassingsinstellingen om deze op te slaan.
5. Klik op de experimentknop en kies het instellingenmenu voor compensatie . Kies vervolgens Compensatiebesturingselementen maken om automatisch compensatiebesturingselementen toe te voegen.
6. Registreer gegevens voor alle compensatiecontrolekralen.
7. Klik op het experiment en kies compensatie-instelling. Bereken vervolgens automatisch de compensatie.
8. Recordgegevens voor besturingselementen met één kleur in cellen.
9. Gebruik CD45RA APC om de compensatiewaarde van R718 te wijzigen in 15% APC. Gebruik CD19 BB700 om de compensatiewaarde van APC-H7 te wijzigen in 14% BB700. Gebruik CD8 R718 om de compensatiewaarde van APC-H7 te wijzigen in 60% R718.
10. Registreer gegevens voor de CST-kralen.
11. Maak een globaal werkblad van de doelwaardesjabloon voor de heldere CST-kralen.
12. Teken met behulp van een FSC/SSC-plot de polygoonpoort voor de CST-heldere kralen. Verkrijg histogramplots van 10 fluorescentiekanalen voor de CST heldere kralen: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 en BV605. Maak intervalpoorten in de histogramplots. Maak de statistiekenweergave door de mediaan van de intervalpoorten weer te geven.
13. Voer de monsters uit op de flowcytometer; Verzamel in totaal 25.000 lymfocyten.
14. Maak een globaal werkblad van de analysesjabloon voor de voorbeelden.
15. Gebruik de volgende voorbeeld gating strategie:
    1. Teken met behulp van een CD45/side scatter-area (SSC-A) dot plot de polygoonpoort om de intacte lymfocytenpopulatie te identificeren terwijl puin wordt uitgesloten.
    2. Teken met behulp van een CD3/CD19 dot plot een rechthoekige poort om CD3⁺ T-cellen en CD19⁺ B-cellen te selecteren.
    3. Teken met behulp van een CD4/CD8 dot plot een quad gate om CD4+ of CD8⁺ T cellen te selecteren (cellen met een hoge fluorescentie voor deze markers, respectievelijk).
    4. Teken met behulp van een CD45RA/CD27 dot plot een quad gate om CD8+ of CD4+ T cellen onder te verdelen in naïeve (CD27⁺CD45RA+), T_CM (CD27⁺ CD45RA-), T_EM (CD27-CD45RA^-), en T_EMRA (CD27-CD45RA⁺) cellen.
    5. Teken met behulp van een CD25/CD127 dot plot een quad gate om CD4⁺ T-cellen onder te verdelen in Treg-cellen (CD4⁺CD25+⁺CD127^laag).
    6. Teken met behulp van een CD27/IgD dot plot een quad gate om CD19+ B cellen onder te verdelen in naïeve B cellen (CD27-IgD+) en geheugen B cellen (CD27⁺IgD^-).
16. Sla de experimentele sjabloon op cytometer A op.
17. Gebruik de cd-rom om de experimentele sjabloon te exporteren.

5. Overbrengen van de experimentele sjabloon naar cytometer B in het laboratorium van de testmethode

OPMERKING: De experimentele sjabloon bevat instrumentinstellingen, de analysesjabloon en de doelwaardesjabloon van mediane fluorescentie-intensiteit (MFI).

1. Voer een prestatiecontrole uit met behulp van CST-kralen om te controleren of de cytometer goed presteert.
2. Importeer de experimentele sjabloon en maak een experiment voor cytometer B met behulp van de sjabloon.
3. Gebruik dezelfde partij CST-kralen om de fluorescerende parameterspanningen voor elk fluorescentiekanaal aan te passen aan het vorige MFI-instrument.
   OPMERKING: De MFI-waarden variëren binnen ±5% (de MFI van heldere kralen voor en na overdracht wordt weergegeven in tabel 2).
4. Pas de spanning voor FSC aan met behulp van het niet-gekleurde monster, indien nodig.
5. Klik met de rechtermuisknop op de instellingen van de experimentele cytometer en kies toepassingsinstellingen om de toepassingsinstellingen op te slaan.
6. Gebruik CD45RA APC om de compensatiewaarde van R718 te wijzigen in 15% APC. Gebruik CD19 BB700 om de compensatiewaarde van APC-H7 te wijzigen in 24% BB700. Gebruik CD8 R718 om de compensatiewaarde van APC-H7 te wijzigen in 60% R718.
7. Voer de monsters uit op de flowcytometer; Verzamel in totaal 25.000 lymfocyten.

6. Consistentie tussen de experimentele resultaten verkregen op de twee cytometers

1. Beoordeel de verschillen in lymfocytensubsets tussen instrumenten met behulp van eenrichtings-ANOVA (p < 0,05).

Resultaten

Figuur 1 toont een globaal werkblad van de doelwaardesjabloon voor de CST heldere kralen. Met behulp van een FSC/SSC-plot wordt een polygoonpoort getekend om de CST-heldere kralen te selecteren. Histogramplots van 10 fluorescentiekanalen werden verkregen voor de CST heldere kralen: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 en BV605. De doelwaarde voor elke parameter wordt weergegeven door de mediaan binnen de histogrampoorten in tabel 2 weer te geven. De screen...

Discussie

Immunofenotypering van perifere bloedlymfocytensubgroepen kan helpen de veranderingen in celgemedieerde adaptieve immuniteit na vaccinatie bij kinderen te begrijpen. In klinische toepassingen doen zich onverwachte situaties voor, zoals het niet tijdig detecteren van monsters of het vervangen van een flowcytometer; Daarom zijn snelle gestandaardiseerde methoden nodig die overdrachten tussen flowcytometers in verschillende laboratoria vergemakkelijken 9,10,11.^...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	compensatie
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	flow Cytometry A in het overdrachtslaboratorium
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD	655051	definieer flow cytometer baseline en volg cytometer prestaties
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Fluorescente antilichaam
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27	BD	562656	Fluorescente antilichaam
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45	BD	560777	Fluorescente antilichaam
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B in het testmethodelaboratorium
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Fluorescente antilichaam
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8	BD	751953	Fluorescente antilichaam
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA	BD	550855	Fluorescente antilichaam
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3	BD	560176	Fluorescente antilichaam
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4	BD	566320	Fluorescente antilichaam
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25	BD	555432	Fluorescente antilichaam
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD	BD	561314	Fluorescente antilichaam
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Kleuringsbuffer
Centrifuge	Eppendorf	5810	Celcentrifugatie
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifugebuis
CS&T IVD Beads	BD	662414	standaardkralen om cytometerinstellingen in verschillende flow cytometers in te stellen
Lysing Solution 10x Concentrate	BD	349202	lyse rode bloedcellen
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL testbuis