Semi-geautomatiseerde fenotypische analyse van functionele 3D-sferoïde celculturen

Samenvatting

We presenteren een protocol voor het kweken van hoogreproduceerbare sferoïden en hun fenotypische karakterisering met behulp van beeldopname en proteomics.

Samenvatting

We presenteren een protocol dat de eigenschappen en voordelen beschrijft van het gebruik van een standalone clinostat-incubator voor het kweken, behandelen en monitoren van 3D-celculturen. De clinostat bootst een omgeving na waarin cellen zich kunnen assembleren als zeer reproduceerbare sferoïden met lage schuifkrachten en actieve diffusie van voedingsstoffen. We tonen aan dat zowel kanker- als niet-kankerhepatocyten (HepG2/C3A- en THLE-3-cellijnen) 3 weken groei nodig hebben voordat ze functionaliteiten bereiken die vergelijkbaar zijn met levercellen. Dit protocol benadrukt het gemak van het gebruik van incubators voor 3D-cellen met camera's die de celgroei bewaken, aangezien snapshots kunnen worden gemaakt om sferoïden tijdens de behandeling te tellen en te meten. We beschrijven de vergelijking van THLE-3- en HepG2/C3A-cellijnen en laten zien hoe niet-kankercellijnen kunnen worden gekweekt en onsterfelijke kankercellen. We demonstreren en illustreren hoe proteomics-experimenten kunnen worden uitgevoerd op basis van een paar sferoïden, die kunnen worden verzameld zonder de celsignalering te verstoren, d.w.z. dat er geen trypsinisatie nodig is. We laten zien dat proteomics-analyse kan worden gebruikt om het typische leverfenotype van het metabolisme van de ademhalingsketen en de productie van eiwitten die betrokken zijn bij metaalontgifting te monitoren en beschrijven een semi-geautomatiseerd systeem om het gebied van de sferoïde te tellen en te meten. Al met al presenteert het protocol een toolbox die bestaat uit een fenotypische karakterisering via beeldopname en een proteomics-pijplijn om te experimenteren met 3D-celkweekmodellen.

Inleiding

Het is bewezen dat in-vitrocelculturen noodzakelijk en van onschatbare waarde zijn voor het vestigen van fundamentele kennis in de biologie. Veel van het wetenschappelijke begrip in de biologie en kanker in het bijzonder is afkomstig van het 2D-kweeksysteem, dat wil zeggen cellen die in een monolaag groeien. Hoewel 2D-kweek het dominante celkweeksysteem is geweest, heeft het veel nadelen die verdere biologische vooruitgang kunnen verstikken. 2D-culturen missen bijvoorbeeld cel-celinteracties die belangrijk zijn voor celsignalering en proliferatie¹. Tot op heden is aangetoond dat 3D-kweeksystemen differentiatie, geneesmiddelrespons, tumorinvasie en biologie beter modelleren 2,3,4,5. 3D-modellering van kwaadaardige kankers is vooral van vitaal belang vanwege de toename van de vergrijzing van de bevolking en de sterfte aan kanker. Hepatocellulair carcinoom (HCC) is wereldwijd een van de belangrijkste oorzaken van kankergerelateerde sterfte en heeft vaak een erbarmelijke prognose⁶. Van HCC is bekend dat het een laag genezingspercentage, een slechte respons op geneesmiddelen en een hoog recidiefpercentage ^{heeft 6,7,8}. Er zijn verschillende 3D-modellen voor normale lever en HCC ontwikkeld die de fysiologie van in vivo normaal en kwaadaardig leverweefsel nabootsen ^9,10.

Sommige van de huidige 3D-systemen omvatten vloeibare overlays, bioreactoren, hydrogel, steigers en 3D-geprinte structuren. Sferoïden die in bioreactoren worden gegenereerd, bieden specifiek unieke voordelen omdat ze de tumorverdeling van blootstelling aan voedingsstoffen, gasuitwisseling en celproliferatie/rust nabootsen¹¹. Bioreactoren zijn vooral geschikt voor kankermodellen vanwege hun gebruiksgemak, grote schaalbaarheid, diffusie van voedingsstoffen en toegankelijkheid¹¹. Bovendien kunnen bioreactoren experimenten met een hoge doorvoer, een grotere reproduceerbaarheid en minder menselijke fouten mogelijk maken. De bioreactor die in deze studie wordt gebruikt, is uniek omdat hij een systeem van verminderde zwaartekracht simuleert, waardoor storende schuifkrachten die worden toegepast in typische bioreactoren worden geminimaliseerd, waardoor een betere reproduceerbaarheid mogelijk is¹². De omnidirectionele zwaartekracht en vermindering van de schuifkrachten zorgen ervoor dat de cellen zich op een meer fysiologische manier kunnen ontwikkelen. Als bewijs ontwikkelen HepG2/C3A-cellen die volgens deze methodologie worden gekweekt bolvormige organellen die in vivo niveaus van ATP, adenylaatkinase, ureum en cholesterol produceren^13,14. Bovendien zijn medicamenteuze behandelingen in dit 3D-systeem geavanceerder en geautomatiseerd in vergelijking met 2D-culturen. In 2D-culturen moeten medicamenteuze behandelingen vaak een kort tijdsverloop hebben vanwege de noodzaak om te trypsiniseren en de gezondheid van cellen te behouden. Toch kunnen we in ons geval langdurige medicamenteuze behandelingen van sferoïden uitvoeren zonder de structuur en fysiologie van de cellen te hoeven verstoren. Daarom is een verschuiving van 2D- naar 3D-culturen nodig om biologische fenomenen in vivo beter te modelleren en de wetenschappelijke ontwikkeling te bevorderen.

Dit artikel presenteert een methodologie voor het kweken van sterk reproduceerbare sferoïden (Figuur 1 en Figuur 2) en toont een semi-geautomatiseerd systeem om fenotypische 3D-structuren te karakteriseren (Figuur 3). Op beeldniveau geven we informatie over het tellen en meten van het oppervlak van sferoïden (Figuur 3). Door gebruik te maken van massaspectrometriemethoden laten we zien hoe proteomics kan worden gebruikt om specifieke biologische functies te beoordelen (Figuur 4). Door deze gegevens te verzamelen en te analyseren, hopen we het begrip van de biologie achter 3D-celkweeksystemen te verbeteren.

Protocol

1. Buffers en reagentia

1. Celgroeimedia voor HepG2/C3A-cellen: Bereid Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM, 4,5 g/L glucose) met 10% foetaal runderserum (FBS), niet-essentiële aminozuren (1% v/v), L-glutamine (1% v/v) en penicilline/streptomycine (0,5% v/v). Bewaar de groeimedia bij 4 °C.
2. Celgroeimedia voor THLE-3-cellen: Bereid bronchiale epitheelcelgroeimedium [BEGM] voor met zijn supplementen (boviene hypofyse-extract [BPE], hydrocortison, humane epidermale groeifactor [hEGF], epinefrine, transferrine, insuline, retinoïnezuur, triiodothyronine, gentamicinesulfaat-amfotericine [GA]) evenals 10% FBS, 5 ng/ml hEGF en 70 ng/ml fosfoetanolamine.
3. 500 mM DL-Dithiothreitol (DTT): Om 10 ml te bereiden, resuspendeert u 0,771 g DTT in 10 ml water van HPLC-kwaliteit. Bewaar aliquots van 100 μl bij -20 °C.
4. 200 mM iodoacetamide: Om 1 ml te bereiden, resuspendeert u 36 mg jodoacetamide in 1 ml 50 mM ammoniumbicarbonaat. Bewaar geresuspendeerd jodoacetamide niet.
5. 5% natriumdodecylsulfaat (SDS): Om 50 ml te bereiden, resuspendeert u 2,5 g SDS in 50 ml ammoniumbicarbonaat van 50 mM. Bewaren bij 4 °C.
6. 12% fosforzuur: Om 100 ml te bereiden, verdunt u 14,1 ml 85% fosforzuur in 85,9 ml water van HPLC-kwaliteit. Bewaren in een glazen fles bij kamertemperatuur (RT).
7. Bindingsbuffer: Voeg voor de bereiding van 1 L 900 ml geconcentreerde methanol toe aan 100 ml 10 mM ammoniumbicarbonaat of TEAB.
8. 0,1% Trifluorazijnzuur (TFA)-oplossing: Voeg 1 ml geconcentreerd TFA toe aan 999 ml water van HPLC-kwaliteit. Bewaren bij 4 °C.
9. 60% acetonitril/0,1% TFA-oplossing: Voeg 600 ml acetonitril van HPLC-kwaliteit (60% v/v) toe aan 399 ml water van HPLC-kwaliteit. Voeg vervolgens 1 ml geconcentreerd TFA toe aan deze oplossing en bewaar bij 4 °C.
10. Mobiele fase A (MPA) - 0,1% mierenzuur: Voeg 1 ml geconcentreerd mierenzuur toe aan 999 ml water van HPLC-kwaliteit en meng goed.
11. Mobiele fase B (MPB) - 80% acetonitril van HPLC-kwaliteit + 0,1% mierenzuur: Voeg 800 ml acetonitril van HPLC-kwaliteit toe aan 199 ml water van HPLC-kwaliteit. Voeg vervolgens 1 ml geconcentreerd mierenzuur toe aan deze oplossing en meng.

2. Bereiding van sferoïden

OPMERKING: Figuur 1A geeft de eerste stappen weer voor het bereiden en kweken van 3D-sferoïden uit cellijnen.

1. Ontdooi bevroren HepG2/C3A- en THLE-3-cellen en kweek ze als een monolaag met behulp van standaard groeimedia in een weefselkweekkolf of -schaal totdat ze ongeveer 80% confluentie bereiken.
   OPMERKING: Wanneer cellen samenvloeiing bereiken, controleer dan de algemene cellulaire morfologie en groeipatronen met behulp van een microscoop. Het wordt niet aanbevolen om cellen met hoge doorgangsnummers te gebruiken.
2. Was de cellen twee keer met Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, gebruik 5 ml voor een T75 cm² kolf of 10 cm schaal).
3. Voeg 5 ml 0,05% trypsine-EDTA verdund in HBSS (1:2 verdunning) toe en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C met 5% CO₂. Gebruik een microscoop om de celloslating te beoordelen en voeg 3 ml FBS of groeimedia (met 10% FBS) toe om de trypsinereactie te neutraliseren.
4. Breng de celsuspensie over in een buisje van 15 ml. Draai af op 270 x g bij RT gedurende 5 min.
5. Zuig het supernatans op en resuspendeer de cellen in 5 ml volledig groeimedium.
   OPMERKING: Als er te veel cellen zijn, verdun dan de celsuspensie voordat u gaat tellen.
6. Tel het aantal cellen en verdun de celsuspensie in volledige groeimedia om 1 x 10⁶ te verkrijgen in een maximaal volume van 1,5 ml.
7. Breng een ultralage bevestiging van 24-well ronde bodemplaat met microwells in evenwicht.
   1. Was de putjes met 0,5 ml groeimedia.
   2. Centrifugeer de plaat op 3.000 x g gedurende 5 minuten (dit verwijdert luchtbellen van het oppervlak van putjes).
8. Breng de celsuspensie (bereid in stap 1.4) over in de plaat en centrifugeer gedurende 3 minuten op 120 x g.
   OPMERKING: Het volume van de celsuspensie kan variëren afhankelijk van het celgetal, maar het is belangrijk om dit te beperken tot 1,5 ml.
9. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO₂ om de vorming van sferoïden te starten.

3. Sferoïdenkweek in bioreactoren (Figuur 2)

OPMERKING: Om de structuur van sferoïden te behouden, gebruikt u tips met een brede boring bij het hanteren van 3D-bollen.

1. Breng de bioreactor in evenwicht door de vochtigheidskamer 24 uur te vullen met 25 ml steriel water en de celkamer met 9 ml groeimedia voordat u de sferoïden erin overbrengt (Figuur 2A). Zorg ervoor dat u een spuit van 10 ml gebruikt die is gekoppeld aan een lange naald bij het vullen van vochtigheid en celkamers.
2. Incubeer de bioreactor, draaiend (15 rpm) in de 3D-incubator (figuur 2D,F), gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO₂.
3. Gebruik tips met een brede boring van 1 ml om de sferoïden voorzichtig op en neer te pipetten om de sferoïden los te maken van de ultralage bevestigingsplaat en breng de sferoïden over naar een weefselkweekschaaltje.
4. Was de ultralage bevestigingsplaat met 0,5 ml voorverwarmde groeimedia om overgebleven sferoïden op te vangen en breng ze over naar dezelfde schaal uit stap 3.3.
5. Beoordeel de grootte, compactheid en rondheid van sferoïden met behulp van een lichtmicroscoop (4x vergroting) en selecteer degene die voldoende gevormd zijn.
   NOTITIE: Cellen zijn voldoende gevormd als ze compact zijn en niet uit elkaar vallen tijdens het hanteren. Het is ook belangrijk dat sferoïden een eenheid vormen en niet samenklonteren. Een sferoïde grootte tussen 100-200 μm heeft de voorkeur wanneer deze naar de bioreactor wordt overgebracht.
6. Breng sferoïden over in de gebalanceerde bioreactor gevuld met 5 ml verse groeimedia. Na het overbrengen van de sferoïden, vult u de bioreactor volledig met verse groeimedia en zorgt u ervoor dat u geen bellen aan de bioreactor toevoegt wanneer u deze met media vult.
7. Plaats de bioreactor in de 3D-incubator en pas de rotatiesnelheid aan met behulp van de besturingseenheid (Figuur 2C). Stel voor HepG2/C3A-sferoïden de rotatiesnelheid in op 10-11 tpm; voor THLE-3 sferoïden, stel deze in op 11-12 rpm.
   NOTITIE: De rotatiesnelheid is correct ingesteld wanneer de sferoïden gelijkmatig in het midden van de bioreactor zijn verdeeld en de wanden niet raken. Figuur 2E toont een roterende bioreactor.
8. Vervang groeimedia elke 2-3 dagen door 10 ml oude media te verwijderen en te vervangen door 10 ml verse media; zorg ervoor dat u sferoïden niet verwijdert bij het verwisselen van media (Figuur 2B).
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een routine van media-uitwisseling te hebben (bijvoorbeeld 48 uur/48 uur/72 uur) en een gedetailleerd verslag bij te houden.
9. Pas de rotatiesnelheid aan telkens wanneer media worden vervangen. Verhoog de snelheid naarmate sferoïden groter en talrijker worden.
10. Na 15 dagen in kweek splitst u sferoïden in twee nieuwe bioreactoren.
    NOTITIE: Afhankelijk van de cellijn en de groeisnelheid kan de tijd variëren en moet deze individueel worden geoptimaliseerd.
11. Na 20 dagen zijn sferoïden klaar om te worden verzameld.

4. Beeldopname en telling van sferoïden

OPMERKING: De vereenvoudigde pijplijn voor het tellen van sferoïden wordt weergegeven in figuur 3A. Voor het tellen van sferoïden en het bepalen van het gebied (sectie 5) is het van cruciaal belang om de compactheid van de 3D-structuren te evalueren. Dit zal bijdragen aan een beter kleurcontrast, wat nodig is om de methode nauwkeurig te laten zijn.

1. Open de 3D-app die op de tablet is geïnstalleerd.
2. Selecteer de bioreactor en maak een momentopname.
   OPMERKING: Als alternatief kan er een foto worden gemaakt. De volgende parameters moeten in overweging worden genomen.
   1. Plaats een zwarte achtergrond achter de bioreactor (zwarte steun is voorzien in de bioreactordoos).
   2. Zorg ervoor dat er geen lichtreflectie op de celkamer is.
   3. Maak de foto zo dicht mogelijk bij de bioreactor.
3. Open een afbeelding in FIJI (ImageJ).
4. Bereid de afbeelding voor op analyse:
   1. Selecteer het gereedschap Ovaal . Teken een cirkel rond de stekker.
   2. Klik op Verwijderen op het toetsenbord om alles in de cirkel zwart te maken. Teken een cirkel rond de celkamer. Zorg ervoor dat alle sferoïden zich binnen de cirkel bevinden.
5. Voer een macro uit om sferoïden te tellen:
   1. Klik op Plug-ins > Macro > opnemen. Kopieer macrotekst van aanvullend bestand 1 naar de recorder.
   2. Druk op Maken en er wordt een nieuw venster geopend. Druk op Uitvoeren om de geopende afbeelding te analyseren.
   3. Er wordt een nieuw venster geopend met de resultaten (aantal, totale oppervlakte, gemiddelde grootte en procentuele oppervlakte).
6. Sluit de afbeelding en herhaal stap 4.4 en 4.5 voor elke afbeelding waarvoor het aantal sferoïden nodig is. Voor een eenvoudigere en snellere verwerking slaat u de macro op en voert u deze uit door op Plug-ins > Macro > Uitvoeren te klikken en de opgeslagen macro te selecteren.

5. Planimetrische bepaling van het sferoïde gebied

OPMERKING: De vereenvoudigde pijpleiding voor het bepalen van het sferoïde oppervlak wordt weergegeven in figuur 3B.

1. Maak foto's zoals beschreven in stap 3.5.
2. Stel voordat u begint een globale schaal in om het gebied van de sferoïden te meten.
   1. Open in FIJI een afbeelding met een schaalbalk met de gewenste vergroting. Selecteer het lijngereedschap. Teken over de schaalbalk (de lijn moet net zo lang zijn als de schaalbalk).
   2. Open Analyseren > Schaal instellen. Schrijf de bekende afstand (de lengte van de lijn wordt automatisch ingevoerd in de Afstand in pixels. Zorg ervoor dat u Global aanvinkt.
   3. Druk op OK. Nu is de schaal ingesteld voor het beeld dat zal worden geanalyseerd.
3. Om de planimetrische bepaling te starten, voert u de macro uit (aanvullend bestand 2).
   1. Klik op Batch> Batch > macro verwerken. Kies de map met de foto's die u wilt analyseren. Deze map is de invoer.
   2. Kies de map die in stap 5.3.1 is gemaakt als uitvoer. Druk op Verwerken.
4. Evalueer als kwaliteitscontrole of het gemeten sferoïde gebied overeenkomt met het originele beeld.
   OPMERKING: Macro sluit sferoïden aan de rand uit waar slechts een deel van de sferoïde kan worden gemeten.

6. Verzameling van sferoïden

OPMERKING: Het wordt sterk aangeraden om sferoïden te verzamelen met behulp van brede boringen om hun 3D-structuur te behouden. Het verzamelen kan worden gedaan met behulp van de plug aan de voorkant van de bioreactor (Figuur 2A).

De grootte van sferoïden bij verzameling kan variëren, afhankelijk van de cellijn, het startaantal cellen en het splitsingsproces (dagen in kweek, aantal sferoïden per bioreactor en splitsingsverhouding).

1. Om sferoïden te verzamelen, verwijdert u 5 ml media uit de bioreactor via de bovenste poort met behulp van een spuit die is gekoppeld aan een lange naald. Zorg ervoor dat u sferoïden naar het onderste midden van de bioreactor laat zinken (in de buurt van de onderste poort).
2. Open de poort aan de voorkant en verzamel sferoïden met behulp van een punt met een brede boring van 1 ml. Plaats de sferoïden in microcentrifugebuisjes. Centrifugeer de sferoïden gedurende 5 minuten bij 500 x g en gooi het medium weg.
3. Was de sferoïden met 200 μL HBSS om de FBS te verwijderen. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 500 x g en gooi het supernatant weg.
4. Vries de sferoïde pellet snel in met vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C tot verwerking.

7. Levensvatbaarheid van sferoïden

OPMERKING: De levensvatbaarheid van sferoïde werd bepaald door de activiteit te meten van het adenylaatkinase (AK) dat vrijkomt door beschadigde cellen (Figuur 4A). Vanwege de diffusiegradiënt is AK-meting efficiënt wanneer sferoïden kleiner zijn dan 900 μm in diameter¹². Als de sferoïden groter worden, of als er twijfel bestaat over de levensvatbaarheidsmeting, kan een ATP-test worden uitgevoerd¹⁵.

1. Vang het sferoïde supernatans op en breng 20 μl over naar een plaat met 96 putjes met witte wanden (platte bodem helder). Voeg 100 μL adenylaatkinasedetectiereagens toe aan elk putje en homogeniseer door zachtjes op en neer te pipetteren.
2. Verwijder de luchtbellen door centrifugeren in het snelheidsvacuüm gedurende 2 minuten bij RT. Incubeer de platen gedurende 20 minuten bij RT.
3. Plaats de plaat in de luminometer (plaatlezer, luminescentiemodus) en start het programma. Stel de parameters in volgens de instructies van de fabrikant van de kit.
   OPMERKING: Bij bioluminescente levensvatbaarheidstests kan de directe luminometerlichtopbrengst (meestal RLU's) worden gebruikt om de celrespons te berekenen. Aangezien adenylaatkinase alleen lekt uit cellen waarvan de celintegriteit is aangetast, is het mogelijk om een totale adenylaatkinasecontrole te bereiken door een lysisreagens te gebruiken.

8. Eiwitextractie

OPMERKING: Figuur 1B geeft de workflow weer voor de verwerking van sferoïden en eiwitextractie.

1. Verzamel sferoïden (sectie 6) op dag 36. Resuspendeer sferoïden in 25 μL 5% SDS om de cellen te lyseren.
   1. Na het toevoegen van 5% SDS, homogeniseert u de pellet door op en neer te pipetteren. In sommige gevallen, wanneer het moeilijk is om de sferoïden te lyseren, gebruik dan een kleine stamper.
2. Incubeer de monsters met 20 mM DTT gedurende 1 uur om eiwitten te verminderen. Mix door op en neer te pipetteren.
3. Incubeer monsters met 40 mM jodoacetamide gedurende 30 minuten, beschermd tegen lichte tot alkylaateiwitten. Mix door op en neer te pipetteren.
4. Voeg 12% fosforzuuroplossing (10x) toe aan de monsters in een eindconcentratie van 1,2%.
5. Verdun de monsters in zes delen bindingsbuffer en meng voorzichtig.
6. Laad het monster op een S-Trap-filterplaat en draai het gedurende 30 s rond op 500 x g .
   OPMERKING: Als het totale volume van het monster in stap 8.4 groter is dan de capaciteit van het kolomvolume, laad dan monsters in batches en herhaal stap 8.6 totdat alles door de kolom is gehaald.
7. Was de monsters twee keer met 150 μL bindingsbuffer. Centrifugeer na elke wasbeurt gedurende 30 s op 500 x g en gooi de doorstroming weg.
8. Incubeer de monsters met 1 μg trypsine van sequentiekwaliteit, verdund in 50 mM ammoniumbicarbonaat, gedurende een nacht bij 37 °C.
   OPMERKING: Ten minste 20 μg eiwit wordt aanbevolen als uitgangsmateriaal voor uitgebreide proteoomanalyse. Hiervoor is 1 μg trypsine de ideale hoeveelheid voor een efficiënte spijsvertering. Verwijder eventuele luchtbellen tussen de buffer en het kolombed.
9. Elute peptiden met 40 μL 50 mM ammoniumbicarbonaat en poolt in dezelfde verzamelbuis.
10. Centrifugeer gedurende 30 s op 500 x g . Elute peptiden met 40 μL 0,1% TFA en bundel ze in dezelfde verzamelbuis.
11. Centrifugeer gedurende 30 s op 500 x g . Eluer de peptiden met 40 μL 60% acetonitril en 0,1% TFA en bundel ze in dezelfde verzamelbuis.
12. Centrifugeer gedurende 30 s op 500 x g . Droog gepoolde eluaten in het snelheidsvacuüm en bewaar de monsters bij -80 °C tot verwerking.

9. Monster opruimen

OPMERKING: Alvorens over te gaan tot de proteomics-analyse, is het noodzakelijk om het zout in de monsters te verwijderen. Zouten kunnen interfereren met de analyse van hoogwaardige vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (HPLC-MS) omdat ze ioniseren tijdens elektrospray, waardoor het signaal van peptiden wordt onderdrukt. De opzet voor ontzouten die in deze studie werd gebruikt, werd eerder gedemonstreerd door Joseph-Chowdhury en collega's¹⁶.

1. Voordat u begint, moet u ervoor zorgen dat er een schone opvangplaat met 96 putjes is om de stroom tijdens de volgende stappen op te vangen. Meng de C18-hars (50 mg/ml in 100% acetonitril) op een magnetische roerplaat.
2. Voeg 70 μL van de C18-harssuspensie toe per putje van de filterplaat met 96 putjes, doe dit snel om ervoor te zorgen dat C18-hars zich niet op de bodem van de pipet ophoopt.
3. Zet de stofzuiger voorzichtig aan om spatten te voorkomen. Gooi de doorstroom weg die is opgevangen op de opvangplaat met 96 putjes.
4. Was de hars met 100 μL 0,1% TFA. Schakel het vacuüm voorzichtig in om spatten en vermenging van monsters te voorkomen en gooi de doorstroming weg.
5. Resuspendeer elk monster in 100 μl 0,1% TFA. Controleer en zorg ervoor dat de pH tussen 2-3 ligt.
6. Laad elk monster in elk putje van de filterplaat. Schakel het vacuüm voorzichtig in om spatten en vermenging van monsters te voorkomen en gooi de doorstroming weg.
7. Wassen met 100 μL 0,1% TFA. Zet de stofzuiger voorzichtig aan om spatten en vermenging van monsters te voorkomen. Gooi de doorstroom weg.
8. Vervang de opvangplaat met 96 putjes door een nieuwe plaat met 96 putjes om de ontzoute monsters op te vangen.
9. Voeg 60 μl acetonitril/0,1% TFA per putje toe. Om de monsters uit de C18-hars te elueren, zet u de stofzuiger voorzichtig aan om spatten te voorkomen.
10. Vang de doorstroom op en droog in een snelheidsvacuüm bij RT. Ga verder met LC-MS/MS of bewaar de plaat bij -80 °C totdat u klaar bent om de monsters te verwerken.

10. Proteomics-analyse via vloeistofchromatografie in combinatie met massaspectrometrie

OPMERKING: Om de gegevens voor dit manuscript te genereren, werd een nLC-MS/MS-systeem gebruikt met een tweekoloms systeemopstelling met een 300 μm ID x 0,5 cm C18 valkolom en een 75 μm ID x 25 cm C18-AQ (3 μm) analytische nanokolom die in eigen huis is verpakt.

1. Bereid de mobiele fasen voor om op de HPLC te worden uitgevoerd:
   Mobiele fase A (MPA): 0,1% mierenzuur in water van HPLC-kwaliteit
   Mobiele fase B (MPB): 0,1% mierenzuur in acetonitril van HPLC-kwaliteit
2. Programmeer de HPLC-methode als volgt: 4%-34% MPB over 120 min, 34%-90% MPB over 5 min, isocratische 90% MPB over 5 min; debiet: 300 nL/min.
3. Stel de MS-acquisitiemethode in om data-onafhankelijke acquisitie (DIA) uit te voeren om MS/MS-spectra van de gedetecteerde peptidesignalen te genereren.
4. Resuspendeer 1 μg monsters in 10 μL 0,1% TFA voordat u de monsters in de nLC autosampler plaatst.
5. Voer de nLC-MS-methode uit zoals geprogrammeerd voor canonieke proteomics-acquisitie:
   1. Stel de volledige MS-scan in op 300-1100 m/z in de orbitrap, met een resolutie van 120.000 (bij 200 m/z) en een automatisch versterkingsregeling (AGC) doel van 125.
   2. Stel MS/MS in de orbitrap in met een sequentieel isolatievenster van 50 m/z met een AGC-doel van 400 en een Higher-energy collisional dissociation (HCD)-energie van 30.

11. Data-analyse

1. Importeer de onbewerkte nLC-MS/MS-bestanden in piekdetectiesoftware die compatibel is met het gebruikte MS-platform.
2. Selecteer de juiste database (mens, muis, enz.).
3. Stel N-terminale acetylering in als variabele modificatie en carbamidomethylcysteïne als vaste modificatie.
4. Specificeer trypsine als het spijsverteringsenzym met twee gemiste splitsingen toegestaan.
5. Stel de massatolerantie in op basis van de massaanalysator die wordt gebruikt voor de spectra-acquisitie.
6. Exporteer de analyse als spreadsheet en verwerk de gegevens indien nodig verder.

Resultaten

In dit protocol beschrijven we de eigenschappen van een innovatieve stressvrije 3D-celincubator, een systeem dat speciaal is ontworpen voor het kweken van 3D-sferoïden (Figuur 2). We optimaliseerden het protocol voor het 3D-kweken van THLE-3- en HepG2/C3A-cellijnen. Het hier beschreven protocol is eenvoudig te gebruiken en maakt de reproduceerbaarheid en kosteneffectieve kweek van > 100 sferoïden per bioreactor mogelijk. Eenmaal in de bioreactor worden sferoïden op dezelfde manier behandeld als cellen die in 2D-kweek worden onderhouden. Optimale groeiomstandigheden worden bereikt door de media twee tot drie keer per week te verwisselen (Figuur 2B) en de rotatiesnelheid aan te passen aan de groei en grootte van sferoïden (Figuur 2C). Dit systeem, waarbij 3D-sferoïden worden gekweekt in roterende bioreactoren (Figuur 2E,F), biedt een optimale groeiomgeving voor 3D-structuren door sferoïde bloot te stellen aan een gelijke en zeer lage hoeveelheid schuifkracht.

We hebben eerder laten zien hoe sferoïden kunnen worden gebruikt voor de analyse van chromatinemodificatie¹⁶. Hier demonstreren we in detail hoe leversferoïden kunnen worden verkregen en hoe proteomics-experimenten kunnen worden uitgevoerd voor de analyse van het volledige proteoom (Figuur 1). In het kort werd het protocol geïnitieerd door gebruik te maken van THLE-3 of HepG2/C3A platte cellen totdat de kweek 80% confluentie bereikte. Om cellen als sferoïden te kweken, werden ongeveer 2.000 cellen geplateerd in een ultralage bevestigingsplaat met microwells om ze in staat te stellen zichzelf te aggregeren, en vervolgens werden gevormde sferoïden overgebracht naar een bioreactor (Figuur 1A). Hoewel ze functioneel actief zijn na 3 weken in kweek, zoals eerder aangetoond¹⁷, laten we resultaten zien van sferoïden die na 36 dagen in kweek zijn verzameld voor dit protocol. Na het verzamelen werden sferoïden naar beneden gesponnen en werden zowel pellet als supernatans opgeslagen voor analyse. De levensvatbaarheid van de cellen werd beoordeeld aan de hand van het supernatans voor de kwantificering van adenylaatkinase dat vrijkomt door beschadigde cellen, zoals eerder beschreven¹⁷. Cellulaire eiwitten werden geëxtraheerd uit de celpellet en het volledige proteoom werd geanalyseerd door middel van massaspectrometrie met hoge resolutie (Figuur 1B).

Dit protocol demonstreert ook een semi-geautomatiseerde methode voor het tellen van sferoïden (Figuur 3A) met behulp van het openbare beeldverwerkingsprogramma FIJI (Fiji Is Just ImageJ)¹⁸. Voor de analyse moet een foto van goede kwaliteit van het sferoïde worden gemaakt en er moet rekening worden gehouden met enkele parameters zoals vermeld in rubriek 5. Vervolgens, na het voorbereiden van de foto voor analyse, wordt een macroscript (aanvullend bestand 1) gebruikt voor het tellen van de sferoïden. De macro werkt door eerst een map te maken met de naam FIJI Spheroids counting, in de map waar de sferoïde foto's zich bevinden. In deze map wordt alle informatie uit de analyse opgeslagen; dit omvat een foto van de sferoïden die zijn geteld, met een ID-nummer op elke sferoïde. Het bevat ook een Excel-bestand met de naam sferoïde tellen. Dit bestand bevat het pixelgebied en het ID-nummer voor elke sferoïde die is geteld. De gegevens die overeenkomen met één geanalyseerde afbeelding worden weergegeven in elk tabblad van het bestand. Het tabblad is gelabeld op basis van de naam van de geanalyseerde afbeelding. Aangezien de grootte van de sferoïde kan worden aangetast door vele factoren, waaronder het aantal structuren in een bloedvat en medicamenteuze behandeling, is het ook belangrijk om hun oppervlak te controleren (planimetrie). Het macroscript dat hier wordt gepresenteerd (aanvullend bestand 2) werkt door de zwarte gebieden te meten, die overeenkomen met sferoïden in de afbeelding (Figuur 3B). De uitvoer wordt verzameld in een bestand met de naam planimetrie.xlsx, dat het gemeten gebied, de omtrek en de diameter van elke sferoïde bevat. Er is ook een meting genaamd Feret, die wordt gebruikt om de diameter te berekenen. Feret heeft de langst mogelijke diameter, terwijl minFeret de kortste is. De diameter is het gemiddelde van deze twee. In de uitvoermap bevindt zich, naast het planimetrie.xlsx bestand, ook een foto van de sferoïden die zijn gemeten.

Alvorens over te gaan tot de proteoomanalyse, werd de levensvatbaarheid van sferoïden geëvalueerd in de loop van de kweektijd. Niveaus van AK nemen toe tot dag 17, tot ongeveer 7% van de celdood, en vervolgens neemt de dood af tot niveaus van minder dan 5% (Figuur 4A), wat in overeenstemming is met eerder gepubliceerd werk¹⁷. Dit protocol toont ook de volledige proteoomanalyse voor het monitoren van het celfenotype. Ten eerste werden de proteomen van THLE-3 en HepG2/C3A platte cellen en sferoïden vergeleken. Door de eerste hoofdcomponent (PC1) te analyseren, is het duidelijk dat er een strikte scheiding is van sferoïde monsters van platte celculturen, en het lijkt erop dat de correlatie van celtype (THLE-3 en HepG2/C3A) niet relevant is (Figuur 4B). Hoewel THLE-3- en HepG2/C3A-sferoïden niet samenklonteren, delen ze vergelijkbare profielen die consistent zijn met de leverfunctie. We demonstreren in dit protocol het voorbeeld van metallothioneïnen, die een rol spelen bij metaalontgifting door de lever. We identificeerden in de proteomics-analyse 2 isovormen die tot overexpressie werden gebracht in sferoïden in vergelijking met platte cellen (MT1E en MT1X) (Figuur 4C). We tonen ook de Gene Ontology (GO) verrijking van beide cellijnen gekweekt als sferoïden. Het koolhydraatmetabolische proces, dat de tricarbonzuurcyclus (TCA-cyclus), de elektronentransportketen (cellulaire ademhaling) en het pyruvaatmetabolisme omvat, is een veel voorkomende term en is verrijkt met zowel HepG2/C3A- als THLE-3-sferoïden (Figuur 4D,E). Cellulaire ontgifting, vetzuur- en cholesterolmetabolisme zijn andere functies die in beide sferoïden zijn verrijkt. Het is bekend dat deze functies samen cruciaal zijn voor de leverfunctie.

Figuur 1: Workflow voor sferoïdenkweek en monstervoorbereiding . (A) Experimentele aanpak van 3D-celcultuur. Platte celculturen bij de gewenste samenvloeiing werden trypsiniseerd en gezaaid op een ultralage hechting met 24 putjes die microwells bevatten, waar cellen zichzelf assembleren tot sferoïden. Na 24 uur werden sferoïden overgebracht naar een bioreactor en gekweekt totdat ze klaar zijn voor analyse. (B) Na het verzamelen werden sferoïden gepelleteerd en werden zowel pellets als kweeksupernatans opgeslagen tot verwerking. Histonen¹⁶en niet-histonen-eiwitten werden geëxtraheerd, verteerd tot peptiden en geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie met hoge resolutie. Ruwe bestanden verkregen uit de massaspectrometrie werden doorzocht in de menselijke database en de gegevens werden verder verwerkt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: 3D-celkweeksysteem . (A) Onderdelen van de bioreactor. De bioreactor bestaat uit een gasuitwisselings- en bevochtigingskamer met waterparels en een te openen celkamer met twee pluggen voor media-uitwisseling en sferoïdenverzameling. (B) Uitwisseling van bioreactormedia. De bioreactor wordt gevuld met 10 ml groeimedia met behulp van een spuit met een naald. (C) De app voor systeembeheer. De rotatiesnelheid, het CO2-niveau, de temperatuur, het alarmlogboek en andere functionaliteiten kunnen worden geregeld met behulp van de besturingseenheid. (D) Het plaatsen van de bioreactor in de 3D-incubator. Elke bioreactor heeft een bijbehorende motor die de bioreactor langzaam kan laten draaien. (E) Bioreactor in beweging met het toerental (rpm) geregeld door een (C) tablet. Het toerental (rpm) wordt aangepast aan de grootte van de sferoïden. (F) Bioreactoren in de 3D-incubator. In de 3D-incubator passen maximaal 6 individueel aangestuurde bioreactoren. Foto met dank aan Jason Torres Photography. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Fenotypische karakterisering van sferoïden via beeldopname . (A) Semi-geautomatiseerde telling van sferoïden. Na het maken van snapshots van de sferoïden in de bioreactor, wordt het beeld voorbereid voor analyse in FIJI. Elke sferoïde wordt geteld en voor elk van hen wordt een ID-nummer verstrekt. Er wordt een macro gebruikt en de resultaten worden weergegeven met de ID voor de getelde sferoïde, het label (naam van de afbeelding die is geanalyseerd) en het gebied (het aantal pixels dat in de sferoïde is geteld). (B) Planimetrische bepaling van het sferoïde oppervlak. Met behulp van een macro worden het gebied, de omtrek en de diameter van een specifieke sferoïde bepaald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Proteoomanalyse van leversferoïden . (A) De levensvatbaarheid van sferoïden werd berekend op basis van de afgifte van adenylaatkinase (AK) op kweeksupernatant. De resultaten zijn de middelen van dubbele datapunten ± SD. (B) Principal component analysis (PCA) werd uitgevoerd om het proteoom van THLE-3 en HepG2/C3A platte cellen en sferoïden te vergelijken. (C) Relatieve overvloed aan metallothioneïnen, dit zijn eiwitten die tot expressie worden gebracht door de menselijke lever. Gegevens worden weergegeven als middelen ± SEM. (D) Functioneel gegroepeerde netwerkverrijking toont GO-verrijking voor HepG2/C3A-sferoïden en (E) THLE-3-sferoïden, waarbij alleen het label van de meest significante term per groep wordt weergegeven. Het netwerk is aangelegd met behulp van ClueGo¹⁹. De grootte van de knoop vertegenwoordigt de betekenis van de term verrijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Macroscript voor het tellen van sferoïden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Macro voor planimetrische bepaling van sferoïden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het begrijpen van de biologie achter driedimensionale (3D) cellulaire structuren is uiterst belangrijk voor een uitgebreidere kennis van hun functionaliteiten. Er is een groeiende belangstelling voor het gebruik van 3D-modellen voor het bestuderen van complexe biologie en het uitvoeren van toxiciteitsscreening. Bij het kweken van cellen in 3D moet met veel factoren rekening worden gehouden, waaronder de fenotypische beoordeling van het modelsysteem. Een fenotype wordt gedefinieerd als een groep waarneembare kenmerken van een specifiek organisme, zoals morfologie, gedrag, fysiologische en biochemische eigenschappen²⁰.

In dit protocol laten we zien hoe proteomics-experimenten kunnen worden uitgevoerd met enkele sferoïden en kunnen worden gebruikt om het typische leverfenotype te monitoren. Massaspectrometrie is een veelgebruikte methode geworden voor 3D-celkarakterisering, waardoor een verscheidenheid aan biologische vragen kan worden onderzocht 12,16,21,22. Voor een uitgebreide proteoomanalyse wordt aanbevolen om ten minste 20 μg eiwituitgangsmateriaal te gebruiken, waarvan 1 μg in de massaspectrometer wordt geïnjecteerd. Het is belangrijk om te vermelden dat het toevoegen van minder monster kan leiden tot verlies van gevoeligheid, en het toevoegen van meer monster zou de kwaliteit van de chromatografie geleidelijk verslechteren en uiteindelijk leiden tot blokkering van de kolom. In deze studie toonden we aan dat de HepG2/C3A- en THLE-3-sferoïden verrijkt zijn met belangrijke eiwitten uit de glycolyse- en TCA-cyclus, die specifieke leverroutes zijn en van cruciaal belang zijn voor het handhaven van de bloedglucosespiegels en voor de energieproductie^23,24. In feite levert massaspectrometrie-analyse niet alleen informatie op eiwitniveau op, maar maakt het ook mogelijk om posttranslationele modificaties van eiwitten te onderzoeken, zoals eerder aangetoond door onze groep¹⁶.

Een ander aspect waarmee rekening moet worden gehouden in fenotypische 3D-studies is het aantal en de grootte van sferoïden. Naast het reproduceerbaarder maken van experimenten, is het tellen van het aantal sferoïden en het bepalen van hun grootte essentieel om te bepalen wanneer de cultuur in meerdere bioreactoren moet worden gesplitst, aangezien het aantal 3D-structuren in een vat van invloed kan zijn op de grootte en metabolische activiteitsniveaus van sferoïden. Het is echter belangrijk om te benadrukken dat het aantal en de grootte van sferoïden afhangen van de cellijn, het startaantal cellen, het splitsingsproces en het tijdstip van verzameling. Details van HepG2/C3A-sferoïde cultuur, zoals het aantal cellen per sferoïden, eiwitgehalte en grootte als functie van de leeftijd, werden verstrekt door Fey, Korzeniowska en Wrzesinski²⁵. Voor een nauwkeurige en succesvolle analyse met behulp van de semi-geautomatiseerde methode die hier wordt beschreven, is de meest kritische stap een goed beeld van sferoïden. Voor de eenvoud kan de foto worden gemaakt met een telefoon of tablet, maar de resolutie moet zo hoog mogelijk worden gehouden. Omdat beelden snel te verkrijgen zijn, maken ze grootschalige screeningsexperimenten mogelijk om specifieke fenotypische kenmerken te visualiseren of reacties op medicamenteuze behandeling te onderzoeken. Daarom is er, vanwege het toenemende aantal celgebaseerde assays, de afgelopen 10 jaar een aantal open-source software ontwikkeld voor beeldanalyse²⁶. In dit protocol beschrijven we een semi-geautomatiseerd systeem dat de software FIJI¹⁸ gebruikt om de grootte van sferoïden te tellen en te meten. We presenteerden scripts (eenvoudige programmeercommando's) om een reeks algoritmische bewerkingen te definiëren die kunnen worden toegepast op een beeldverzameling, waardoor de analyse een eenvoudig en snel proces wordt. Afhankelijk van de karakteristiek van de sferoïde moet echter een handmatige meting worden uitgevoerd. Als de sferoïden bijvoorbeeld te doorschijnend zijn, zal het FIJI-script onnauwkeurig zijn. Trouwens, een van de belangrijkste criteria om deze methode te laten werken, is de compactheid van de sferoïden. Deze eigenschap zal bijdragen aan een beter kleurcontrast tussen de sferoïden en de achtergrond, wat nodig is om de methode nauwkeurig te laten zijn.

Samenvattend werd naast het presenteren van een methodologie voor het kweken van hoogreproduceerbare sferoïden, ook een semi-geautomatiseerd systeem beschreven in combinatie met fenotypische karakterisering via beeldopname en proteomics. We verwachten dat deze toolbox voor het analyseren van 3D-cellen robuuster zal worden met volledig geautomatiseerde beeldanalysesoftware en massaspectrometers van de volgende generatie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubes	Bio-Rad	2239480
10 mL syringe	Fisher Scientific	1481754	Luer lock tip, graduated to 12 mL
1000 µL wide bore pipet tips	Fisher Scientific	14222703
200 µL wide bore pipet tips	Fisher Scientific	14222730
96-well Orochem filter plate	Orochem	OF1100
96-well skirted plate	Axygen	PCR-96-FS-C
96-well vacuum manifold	Millipore	MAVM0960R
Ammonium bicarbonate	Sigma	A6141-25G
Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM)	Lonza	CC-3170
Cell culture grade water	Corning	25-055-CV
ClinoReactor	CelVivo	N/A	Bioreactor for 3D cell culture
ClinoStar incubator	CelVivo	N/A	CO2 incubator for 3D cell culture
DTT	Sigma	D0632-5G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Fisher Scientific	MT17205CV
Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells	Corning	4441
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	MT35010CV
Formic acid	Thermo	28905
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	MT21022CV
hEGF	Corning	354052
HERAcell vios 160i	Thermo	51033557	CO2 incubator for 2D cell culture
HPLC grade acetonitrile	Fisher Scientific	A955-4
HPLC grade methanol	Fisher Scientific	A452-1
HPLC grade water	Fisher Scientific	W5-4
Iodoacetamide	Sigma	I1149-5G
L-glutamine	Fisher Scientific	MT25015CI
Non-essential amino acids	Fisher Scientific	MT25025CI
Oasis HLB Resin 30 µm	Waters	186007549
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer	Thermo	IQLAAEGAAPFADBMBHQ	High resolution mass spectrometer
PAULA microscope	Leica
Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	MT3002CI
PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader	PerkinElmer
pH paper	Hydrion	93
Phosphoetanolamine	Sigma	P0503
Phosphoric acid	Fisher Scientific	A260-500
Pipette gun	Eppendorf	Z666467 (Milipore Sigma)
Refrigerated centrifuge	Thermo	75-217-420
Reprosil-Pur resin	MSWIL	R13.AQ.003	120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 μM bead size
SDS	Bio-Rad	1610301
Sequencing grade modified trypsin	Promega	V511A
SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates)	Thermo	15308325	Savant SPD1010
Sterile hood	Thermo	1375
Sterile serological pipettes	Fisher Scientific	1367549
S-trap	Protifi	C02-micro-80
Syringe needle (18 G)	Fisher Scientific	14817100	3" length, 0.05" diameter
Trifluoroacetic acid (TFA)	Thermo	28904
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Vortex	Sigma	Z258415
Water bath	Fisher Scientific	FSGPD10