Verstoring van de bloed-ruggenmergbarrière met behulp van gefocusseerde echografie met lage intensiteit in een rattenmodel

Samenvatting

Verstoring van de bloed-ruggenmergbarrière (BSCB) kan met succes worden bereikt met de intraveneuze toediening van microbellen en de toepassing van gefocusseerde echografie met lage intensiteit (LIFU). Dit protocol beschrijft de opening van de BSCB met behulp van LIFU in een knaagdiermodel, inclusief het opzetten van apparatuur, injectie van microbellen, lokalisatie van het doelwit en visualisatie van BSCB-verstoringen.

Samenvatting

Low-intensity focused ultrasound (LIFU) maakt gebruik van ultrasone pulsaties met lagere intensiteiten dan ultrageluid en wordt getest als een omkeerbare en nauwkeurige neuromodulerende technologie. Hoewel het openen van de LIFU-gemedieerde bloed-hersenbarrière (BBB) in detail is onderzocht, is er tot op heden geen gestandaardiseerde techniek voor het openen van de bloed-ruggenmergbarrière (BSCB) vastgesteld. Daarom presenteert dit protocol een methode voor succesvolle BSCB-verstoring met behulp van LIFU-sonicatie in een rattenmodel, inclusief beschrijvingen van diervoorbereiding, toediening van microbellen, doelselectie en lokalisatie, evenals visualisatie en bevestiging van BSCB-verstoring. De hier gerapporteerde aanpak is met name nuttig voor onderzoekers die een snelle en kosteneffectieve methode nodig hebben om doellokalisatie en nauwkeurige BSCB-verstoring in een klein diermodel met een gefocuste ultrasone transducer te testen en te bevestigen, de BSCB-werkzaamheid van sonicatieparameters te evalueren of toepassingen voor LIFU op het ruggenmerg te onderzoeken, zoals medicijnafgifte, immunomodulatie en neuromodulatie. Het wordt aanbevolen om dit protocol te optimaliseren voor individueel gebruik, vooral voor het bevorderen van toekomstig preklinisch, klinisch en translationeel werk.

Inleiding

Net als de bloed-hersenbarrière (BBB) reguleert de bloed-ruggenmergbarrière (BSCB) de beweging van circulerende opgeloste stoffen, cellen en plasmacomponenten in het spinale parenchym¹. Deze beschermende eigenschap is het resultaat van een gespecialiseerd systeem van strak gebonden, niet-gefenestreerde endotheelcellen die de spinale haarvaten bekleden². Doorgaans kunnen alleen lipofiele moleculen met een laag gewicht en een positieve lading beide barrières passeren³. Ondanks studies die suggereren dat de BSCB een iets hogere permeabiliteit heeft dan de BBB, beperken beide barrières de afgifte van therapieën aan het centrale zenuwstelsel⁴. Er zijn verschillende strategieën ontwikkeld om het transport van geneesmiddelen over de BSCB te vergroten, waaronder technieken voor het verhogen van de osmotische druk in de spinale haarvaten, de ontwikkeling van geneesmiddelen die interageren met bradykininereceptoren en de creatie van gefunctionaliseerde nanodeeltjes⁵.

BSCB-verstoring kan ook worden bereikt via de intraveneuze toediening van microbellen (MB's), gevolgd door sonicatie met gefocusseerde echografie met lage intensiteit (LIFU)⁶. Het akoestische veld dat door de ultrasone transducer wordt gegenereerd, veroorzaakt MB-oscillaties, die op hun beurt spanning uitoefenen op de endotheelwand en tight junctions losmaken⁷. Het losmaken van de tight junction creëert voorbijgaande openingen in de haarvaten, waardoor therapieën in het spinale parenchym kunnen doordringen (Figuur 1). Dit proces kan ook transendotheliale fenestraties creëren, transcytose verhogen en ATP-bindende cassettetransporters, zoals P-glycoproteïne^8,9, downreguleren. Een belangrijk voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om off-target effecten te minimaliseren door het focale gebied van sonicatie te richten op de interessante locatie in het ruggenmerg. Verschillende klinische onderzoeken hebben de werkzaamheid onderzocht van LIFU-gemedieerde BBB-opening voor de behandeling van pathologieën van het centrale zenuwstelsel, waaronder gliomen, amyotrofische laterale sclerose, de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson. Hoewel LIFU-gemedieerde BSCB-verstoring niet zo uitgebreid wordt gekarakteriseerd als LIFU-gemedieerde BBB-verstoring, hebben verschillende groepen succesvolle BSCB-verstoring gerapporteerd in knaagdier-, konijnen- en varkensmodellen^10,11,12. Over het algemeen groeit de belangstelling voor de techniek snel, vooral als een levensvatbare weg voor medicijnafgifte.

In dit protocol wordt een techniek beschreven voor LIFU-gemedieerde BSCB-verstoring in een rattenmodel. De procedure omvat gedetailleerde beschrijvingen van de voorbereiding van dieren, het instellen van LIFU-apparatuur, MB-toediening, doellokalisatie en extractie van het ruggenmerg. Bevestiging van doellokalisatie en BSCB-verstoring wordt geëvalueerd via Evans blue dye (EBD) extravasatie in het ruggenmerg. EBD is een niet-toxische verbinding die zich bindt aan serumalbumine en kan worden geïdentificeerd aan de hand van zijn rijke blauwe kleur visueel en rode autofluorescentie onder microscopie¹³.

De hier genoemde stappen bieden een snel en goedkoop alternatief voor traditionele ultrasone (VS) of magnetische resonantie (MR)-geleide LIFU-systemen. Als gevolg hiervan is deze methode nuttig voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het snel testen en bevestigen van de richt- en BSCB-verstoringsmogelijkheden van hun LIFU-transducer voordat ze extra apparatuur en materialen aanschaffen of LIFU-toepassingen in het ruggenmerg nastreven, zoals medicijnafgifte, immunomodulatie en neuromodulatie.

Protocol

Alle dierstudies zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC RA20M223). Voor dit onderzoek werden alleen volwassen vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten (gemiddeld gewicht: 250 g; leeftijd: 11 weken) gebruikt.

1. Assemblage en opstelling van gefocusseerde echografie met lage intensiteit

1. Schaf een gefocusseerd ultrasoon transducersysteem aan met specificaties die voldoende zijn om BSCB-opening bij ratten te bereiken. Voorgestelde parameters uit de literatuur zijn onder meer een centrale frequentie tussen 0,25-4 MHz en het vermogen om piekdrukken tussen 0,2-2,1 MPa 10,14,15,16,17 te produceren. Zorg ervoor dat het systeem de rij-/regelapparatuur omvat, die ten minste een golf-/signaalgenerator, radiofrequentieaandrijving/eindversterker en bijpassend netwerk omvat (Afbeelding 2A).
   OPMERKING: De hier beschreven opstelling maakt gebruik van een in de handel verkrijgbare transducer met meerdere elementen met een centrale frequentie van 250 kHz en een diameter van 64 mm (Afbeelding 2B).
2. Bevestig de 3D-geprinte sondehouder en waterkegel op de transducer (Figuur 2C). Zorg voor een waterdichte afdichting tussen de conus en de transducer.
   OPMERKING: Een aangepaste kegel- en sondehouder werd meegeleverd met de transducer die in dit experiment wordt gebruikt. De conus en sondehouder worden met schroeven aan de transducer bevestigd, die ook worden meegeleverd.
3. Steriliseer een 50 μm dik, akoestisch transparant polyestermembraan en bevestig het met een elastiekje op de bodem van de waterkegel.
4. Vul de waterkegel met ontgast en gedeïoniseerd water met behulp van de inlaat- en uitlaatbuizen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de kegel komen, omdat deze de akoestische koppeling tussen de transducer en het doel kunnen verstoren. Het polyestermembraan moet licht worden opgeblazen.
   NOTITIE: Om luchtbellen uit de kegel te verwijderen, leidt u de bellen naar de uitlaatklep terwijl u de kegel met water vult via de inlaatklep. Als er veel kleine belletjes aanwezig zijn, sluit dan alle kleppen en draai de conus totdat er één grote bellebel overblijft. Leid deze bel naar de uitlaatklep en ga verder met het vullen van de kegel.
5. Sluit de aandrijfapparatuur, waaronder de golfgenerator en RF-aandrijfversterker, aan op de transducer. De transducerkabel wordt aangesloten op de uitgangszijde van het overeenkomende netwerk en de signaalgenerator/eindversterker wordt aangesloten op de ingangszijde van het overeenkomende netwerk. De kabels moeten worden aangesloten op het bijbehorende kanaalnummer (Figuur 2D-G).
   OPMERKING: In het commerciële systeem dat in dit onderzoek wordt gebruikt, zijn de golfgenerator en de RF-aandrijfversterker componenten van het uitgangsvermogen van de transducer (TPO) (Figuur 2D).
6. Bevestig de sondehouder aan de stereotactische arm. Bevestig de stereotactische arm aan de bevestigingsplaat. Hierdoor kan de transducer tijdens sonicatie precies boven het knaagdier worden geplaatst.

2. Voorbereiding van dieren en chirurgische laminectomie

1. Verdoof de rat met een mengsel van isofluraan en medische lucht in een inductiekamer die is bevestigd aan een koolstoffilterbus. Stel het gasdebiet in op 400 ml/min en de isofluraanverdamper tussen 1,5%-2,5% voor anesthesie-inductie. De hoeveelheid tijd die in de kamer wordt doorgebracht vóór volledige sedatie is variabel, hoewel deze meestal varieert van 3-6 minuten.
2. Noteer het gewicht van de verdoofde rat en voer een teenknijptest uit. Als er schokken of bewegingen worden waargenomen als reactie op het knijpen, plaats de rat dan nog eens 1 minuut terug in de inductiekamer en herhaal de teenknijptest. Herhaal indien nodig om ervoor te zorgen dat de rat volledig verdoofd is en blijft.
3. Plaats een verwarmingskussen en een steriel absorberend kussen op de fixatieplaat. Plaats de rat op het absorberende kussentje, breng oogzalf aan en plaats een rectale thermometer om de lichaamstemperatuur te controleren.
   OPMERKING: Tijdens de duur van de chirurgische ingreep moeten de temperatuur en hartslag van de rat worden gecontroleerd (idealiter moet de hartslag tussen 330-480 slagen per minuut liggen en de temperatuur tussen 35,9-37,5 °C)^18,19. Pas het isofluraan of het verwarmingskussen dienovereenkomstig aan om vroegtijdig overlijden te voorkomen. Het verwarmingskussen kan worden ingesteld op een temperatuur van ongeveer 37 °C en moet indien nodig worden in- en uitgeschakeld om de optimale lichaamstemperatuur te behouden.
4. Palpeer de laatste rib van de rat, die aan de wervelkolom is bevestigd bij de 13e^borstwervel (T13). Gebruik een elektrisch scheerapparaat om de vacht van het dorsale oppervlak tussen de laatste rib en nek te scheren. Veeg de blootgestelde huid af met gaas gedrenkt in 10% jodopovidon.
5. Maak een incisie in de middellijn met een irisschaar en ontleed door de fascia totdat de processus spinosus en lamina zichtbaar zijn. Verwijder het bot met een offset bottang en een irisschaar met schuin blad totdat het ruggenmerg bloot ligt²⁰. De lengte van laminectomie en incisie varieert op basis van het aantal verschillende doelen dat moet worden gesoniseerd. In deze studie werd een laminectomie op drie niveaus uitgevoerd met behulp van een incisie van 3 cm.
   NOTITIE: Vermijd het aanraken van of druk uitoefenen op het ruggenmerg tijdens het verwijderen van bot om letsel te voorkomen. Als de achterpoten van de rat schokken tijdens de laminectomie, werd er te veel kracht uitgeoefend op de navelstreng of zenuwwortels.
6. Zet de rat vast aan de fixatieplaat door de processus spinosus naast de laminectomie vast te klemmen. Trek de wervelkolom lichtjes strak om kromming te minimaliseren voordat u de klemmen vergrendelt.

3. Doellokalisatie met behulp van lasergeleiding

1. Pas de positie van de transducer aan met de stereotactische arm totdat deze zich precies boven de laminectomie bevindt (Figuur 3A). Het frame maakt beweging in de x-, y- en z-as mogelijk, evenals 180° rotatie in het verticale vlak en 360° rotatie in het horizontale vlak.
2. Bevestig het laserapparaat aan de onderkant van de waterkegel en laat het zakken totdat het laserpunt zichtbaar is. Pas de laterale positie van de transducer aan totdat het laserpunt zich boven de locatie bevindt die het doel is voor BSCB-verstoring (Figuur 3B,C).
   OPMERKING: Een CAD-bestand (computer-aided design) voor het laserapparaat is opgenomen in het aanvullende gedeelte (aanvullende afbeelding 1).
3. Verwijder het laserapparaat en vul de ruimte tussen de kegel en het ruggenmerg met ontgaste ultrasone gel (Figuur 3D). Voor een maximale koppeling moet u ervoor zorgen dat er geen luchtbellen in de gel aanwezig zijn.
   NOTITIE: In dit onderzoek werd de transducer met een aangebrachte waterkegel neergelaten tot 1 cm boven het snoer. Aangezien de waterkegel 30 mm lang was, bedroeg de totale afstand van de transducer tot het snoer 40 mm. De waterkegel werd op 1 cm afstand van het ruggenmerg geplaatst omdat de huid, fascia en spieren van de rat aan weerszijden van de incisie direct contact tussen de punt van de kegel en het koord voorkomen. Het gebruik van de getallen op de y-as van de stereotactische arm kan nuttig zijn om de verticale afstand bij te houden waarop de kegel 1 cm van het koord verwijderd is, vooral omdat de gel visuele bevestiging van de afstand van de kegel tot het koord moeilijk maakt.
4. Stel de parameters voor sonicatie in op de TPO. Een reeks waarden kan worden gebruikt om een succesvolle BSCB-verstoring te bereiken. Voor maximaal vermogen stelt u de sonicatiefrequentie in dicht bij de middenfrequentie van de transducer. De waarden die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn weergegeven in tabel 1.
   OPMERKING: De hier vermelde parameters zijn aangepast aan eerder werk met LIFU, met een middenfrequentie van 500 kHz, een duur van een toonuitbarsting van 500 μs, een inschakelduur van 50% en sonicatietijden van 5 of 10 minuten om het ruggenmerg van een knaagdier veilig te neuromoduleren²¹. Op basis van studies die met succes BSCB-verstoring hebben bereikt, zijn andere parameters die kunnen worden gebruikt centrale frequenties tussen 500 kHz-1 MHz, drukken van 0,2-2,1 MPa, burstlengtes van 10-25 ms en sonicatietijden van 2-5 min 6,10,11,22.

Parameter	Waarde
Frequentie (kHz)	250
Focus Afstand (mm)	40
Akoestische piekdruk (MPa)	0.47
Inschakelduur	40%
Burst-lengte (ms)	400
Periode(s)	1
Sonicatietijd (min)	5

Tabel 1: Sonicatieparameters die worden gebruikt voor BSCB-verstoring.

4. Toediening van microbellen

1. Bereid een MB-oplossing in overeenstemming met de instructies van de fabrikant. Breng geen lucht in de oplossing.
   OPMERKING: De MB's zijn kwetsbaar en klonteren samen in de buurt van de bovenkant van de injectieflacon/spuit als ze een paar minuten stil blijven staan. Schud de injectieflacon en de spuit regelmatig om een ongelijkmatige verdeling van MB's te voorkomen. MB's hebben een korte levensduur; Raadpleeg de handleiding van de fabrikant om de vervaltijd te bepalen.
2. Breng een staartaderkatheter van 22 G in en spoel met 0,2 ml gehepariniseerde zoutoplossing (500 IE/ml)²³. Om de kans op een succesvolle katheterisatie van de staartader te vergroten, dompelt u de staart in warm water en plaatst u een tourniquet aan de basis van de staart om de diameter van de ader te vergroten.
   OPMERKING: Katheterisatie van de staartader kan worden uitgevoerd voorafgaand aan laminectomie, positionering en targeting bij dieren om studietijd te besparen.
3. Injecteer 1 ml/kg 3% EBD in de katheter. Spoel met 0,2 ml gehepariniseerde zoutoplossing. De ledematen en ogen van de rat worden blauw. Bevestig een succesvolle katheterisatie van de staartader door te controleren op blauwe kleurverandering in de dorsale ruggenmerg van de rat (Figuur 4).
   OPMERKING: EBD kan ruim voor de MB-injectie worden geïnjecteerd en heeft geen invloed op de sonicatie. Bovendien, aangezien de Food and Drug Administration (FDA) momenteel geen sonicatie heeft goedgekeurd met geneesmiddelen die al in het systeem zitten, kan EBD ook worden toegediend na sonicatie. Dit zal resulteren in minder kleurstofopname, maar kan klinisch relevanter zijn.
4. Injecteer een bolus van 0,2 ml MB's in de katheter en spoel met 0,2 ml gehepariniseerde zoutoplossing. Start de sonicatie 1-2 minuten na de injectie van MB's. De opstelling die hier wordt gebruikt, verzamelt geen real-time sonicatiefeedback.
   OPMERKING: Studies voor BSCB-verstoring gebruiken doorgaans een hogere concentratie MB's dan geïndiceerd voor diagnostische beeldvorming. Enkele concentraties van veel voorkomende MB-merken die worden gebruikt voor BBB- en BSCB-verstoring in rattenmodellen zijn 0,02-0,2 ml/kg en 200 μl bolussen 10,15,24,25.

5. Ruggenmergextractie en weefselverwerking

1. Na voltooiing van de sonicatie, transcardieel doordrenken van de rat met 100 ml koude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) totdat het bloed volledig helder is. De lever, die door de kleurstof een rijke blauwe kleur heeft, moet vervagen tot een licht bruinachtig blauw²⁶.
   OPMERKING: Het doel van perfusie is om overtollig bloed uit het vaatstelsel van het ruggenmerg te verwijderen. Omdat EBD zich bindt aan albumine, verwijdert dit ook overtollig EBD. Dit zorgt ervoor dat elke EBD die visueel of door middel van fluorescentiemicroscopie in het ruggenmerg wordt gedetecteerd, afkomstig is van de extravasatie van kleurstof in het spinale parenchym.
2. Transcardieel perfuseren met 100 ml koude 4% paraformaldehyde (PFA). De ledematen van de rat zullen trillen tijdens deze fixatie als ze grondig worden gedaan. Deze perfusie met PFA euthanaseert de rat.
3. Verwijder het ruggenmerg en plaats het een nacht in 4% PFA bij 4 °C. Vervang de PFA de volgende dag door PBS.

6. Visualisatie van BSCB-disruptie

1. Isoleer een gedeelte van 2 cm rond de plaats van sonicatie met een scheermesje. Splits de sectie langs de middellijn met het mes en de sectie in secties van 10 μm dik met behulp van een microtoom. Voor een heldere visualisatie kleurt u deze met hematoxyline-eosine (H&E)-kleuring.
   OPMERKING: De H&E-ruggenmergmonsters die in deze studie werden getoond, werden gedurende 3 minuten gekleurd met hematoxyline en gedurende 1 minuut met eosine²⁷.
2. Voor fluorescentiemicroscopie deparaffiniseert u de objectglaasjes met de ruggenmergsecties en gaat u de kleuring tegen met 25 μL 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) opgelost in het montagemedium (0,5 μg/ml). Incubeer bij 4 °C gedurende ten minste 10 min. Vermijd licht om bleken te voorkomen.
   OPMERKING: De deparaffinisatie kan worden vervangen door het gebruik van een cryostaat om bevroren secties te verkrijgen.
3. Gebruik een fluorescentiemicroscoop om alle objectglaasjes in beeld te brengen. EBD-autofluorescentie (excitatie: 470 nm en 540 nm; emissie: 680 nm) is zichtbaar in het rode kanaal, terwijl DAPI aanwezig is in het blauwe kanaal. Gebruik een lichtmicroscoop om de H&E-objectglaasjes in beeld te brengen.
   OPMERKING: Hoewel dit protocol een niet-overlevingsprocedure beschreef, werd het ook uitgevoerd met behulp van overlevingschirurgische technieken. Desinfecteer voor overlevingschirurgie de huid vóór de incisie met 3 afwisselende toepassingen van jodopovidon en dien buprenorfine subcutaan (0,05 mg/kg) toe vóór de operatie. Ga door met het toedienen van subcutane buprenorfine om de 12 uur ten minste 3 dagen na de operatie, met extra dagen als de rat tekenen van pijn vertoont. Als er een dwarslaesie optreedt, kunnen ratten urineretentie of abnormale gang vertonen. Dit zal zich uiten in slepende of vertraagde beweging van de achterpoten of voelbare, opgezwollen blazen. Als dit gebeurt, huisvest ratten dan met voedingswaarde verrijkte watergel voor voedsel en hydratatie en kolf twee keer per dag handmatig blazen totdat reflex mictie is hersteld. Als er sprake is van volledige verlamming van de achterpoten of hardnekkige pijn, euthanaseer de rat.

Resultaten

Dit artikel toont aan dat de gelijktijdige toepassing van LIFU-sonicatie en MB-toediening een effectieve techniek is voor gelokaliseerde BSCB-verstoring. De opening van de BSCB wordt aangegeven door de aanwezigheid van EBD-extravasatie in het spinale parenchym. De veranderingen zijn zowel visueel als onder fluorescentiemicroscopie zichtbaar. Het vasculatuur van het ruggenmerg is zichtbaar na laminectomie en toont de achterste ruggenmergader met meerdere kleinere bloedvaten die lateraal uitstralen (Figuur 4A). Intraveneuze injectie van EBD via de staartaderkatheter resulteert in een verrijkte vasculatuur met blauwe kleurstof (figuur 4B). Dit is een goed punt in de procedure om te verifiëren dat de laminectomie niet heeft geleid tot het scheuren van een spinale vasculatuur, omdat dit zou resulteren in blauw bloed dat zich over het navelstreng zou ophopen. Na sonicatie zou een blauwe vlek zichtbaar moeten worden boven de beoogde locatie, wat wijst op de extravasatie van EBD in het witte parenchym als gevolg van BSCB-verstoring (Figuur 4C). De grootte van deze vlek varieert op basis van een aantal factoren, waaronder de grootte van het brandpuntsgebied van de transducer en de hoeveelheid tijd na sonicatie. Om de kans op EBD-extravasatie te vergroten, moet men de tijd tussen sonicatie en ruggenmergextractie verlengen.

Hoewel PFA-perfusie geen noodzakelijke stap is om uit te voeren voorafgaand aan navelstrengextractie en daaropvolgende weefselanalyse, verwijdert het bloed uit het monster en verhoogt het het contrast tussen het witte spinale parenchym en de blauwe EBD-gekleurde gebieden. Alle ratten die MB-toediening en LIFU-sonicatie kregen, vertonen duidelijke extravasatie van EBD in het ruggenmerg, terwijl negatieve controles die MB's en EBD kregen zonder LIFU-sonicatie dat niet doen. Representatieve afbeeldingen zijn weergegeven in figuur 5. Sagittale sneden door de weefsels laten zien dat de EBD-extravasatie niet alleen oppervlakkig is, maar zich ook uitstrekt tot ver in de navelstreng zelf. Dit is te verwachten, aangezien het brandpuntsgebied van de transducer die in dit onderzoek wordt gebruikt, groter is dan de diameter van het ruggenmerg van de rat. Soms kunnen kleine hoeveelheden bloedingen worden gezien in de sagittale sneden. Dit kan te wijten zijn aan de laminectomie of de ultrasone sonicatie. Als de bloeding zich dicht bij de dorsale periferie van het koord bevindt, is dit waarschijnlijker te wijten aan de laminectomie.

Om EBD-extravasatie verder te evalueren, werden sagittale ruggenmergsecties gekleurd met DAPI (nucleaire marker) en afgebeeld met een fluorescerende microscoop. Alle snoeren die LIFU-sonicatie ontvingen (n = 3) vertoonden een significant grotere intensiteit van EBD-autofluorescentie (p = 0,016) dan snoeren die geen sonicatie ontvingen, met vergelijkbare intensiteiten van DAPI aanwezig in beide (Figuur 6). H&E-analyse onthulde verder geen neuronale schade, bloeding of holtelaesies aanwezig op de gesoniceerde locaties, wat de veiligheid van deze procedure ondersteunt. Voorbeelden van gewonde snoeren als gevolg van chirurgische verkeerde behandeling en een krachtige sonicatie worden ter vergelijking getoond. Bloedingen, weefselbeschadiging, holtelaesies en mogelijke vacuolisatie worden gelabeld. Hoewel het voorbeeld van high-power sonicatie geen bloeding laat zien, is dit ook gemeld als een effect van ultrasone verstoring.

Verder werd gedragsanalyse uitgevoerd op ratten die MB's, EBD en LIFU-sonicatie kregen. Hoewel deze methode weefselschade niet volledig uitsluit, wordt wel getest of er motorische stoornissen zijn opgetreden als gevolg van deze procedure. Ratten werden geregistreerd terwijl ze gedurende een periode van 5 dagen elke dag 5 minuten in een kooi liepen, en de locomotorische functie werd beoordeeld op basis van de locomotorische schaal van Basso Beattie Bresnahan (aanvullend videobestand 1). Alle ratten (n = 5) kregen de hoogste score vóór sonicatie, post-sonicatie en elke dag van de overlevingsperiode (Figuur 7).

Ten slotte werden de thermische effecten van de sonicatieparameters die in deze studie werden gebruikt, gemeten met behulp van twee ex vivo monsters van het ruggenmerg van ratten en een digitale thermometersonde met een fijne punt die in het koord werd gestoken.  De temperatuur van de ruggenmergmonsters werd gedurende 5 minuten vóór, tijdens en na sonicatie gevolgd, gedurende in totaal 15 minuten. Er werden minimale temperatuurveranderingen waargenomen. In feite was er in beide monsters een verandering van ≤1,3 °C als gevolg van sonicatie, waardoor de kans op hyperthermisch letsel als gevolg van sonicatie afnam (figuur 8).

Figuur 1: Gefocusseerd ultrageluid-gemedieerd openingsmechanisme voor de bloed-ruggenmergbarrière met lage intensiteit . (A) Schematisch overzicht van low-intensity focused ultrasound (LIFU) sonicatie van het ruggenmerg van ratten. (B) Het mechanisme voor het openen van de bloed-ruggenmergbarrière (BSCB) via LIFU-sonicatie van intraveneuze microbellen (MB's). MB's oscilleren als reactie op LIFU, waardoor tight junctions tussen endotheelcellen breder worden. Deze verstoring van de BSCB maakt de extravasatie van nanodeeltjes, therapeutische medicijnen of Evans-blauwe kleurstof mogelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 2: Low-intensity focused ultrasound benchtop setup en connectiviteit. (A) Schematische weergave van typische gefocusseerde ultrasone componenten. (B) Overzichtsfoto van de opstelling met gefocusseerde echografie, inclusief: 1. transducer power output (TPO), 2. bijpassend netwerk, 3. LIFU-omvormer, 4. het stereotaxische instrument, 5. mobiele klemmen. (C) Transducer, inclusief: 1. sondehouder, 2. ringtransducer, 3. waterkegel, 4. waterinlaatbuis, 5. wateruitlaatbuis, 6. membraan vastgezet met een rubberen band. (D) Voorkant van de TPO, inclusief: 1. RF-afgeschermde behuizing, 2. aanraakgevoelig voorpaneel met instelbaar menu, 3. draaiknop voor parametrering, 4. start/stop-uitgangsschakelaar. (E) Achterkant van de TPO, inclusief: 1. kanaaluitgangsconnectoren, 2. aarde, 3. USB-ingangspoort voor softwarebesturing, 4. interne trigger, 5. sync-uitgangsconnector, 6. voedingsingang en voeding, 7. aan/uit-schakelaar. (F) Overeenkomende netwerkuitgang, met draden die overeenkomen met kanaalnummers. (G) Overeenkomende netwerk XDR-ingang, met draden die overeenkomen met kanaalnummers Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Lokalisatie van het doel met lasergeleiding . (A) Stereotactische arm met bewegingsbereik in alle drie de assen en rotatiemogelijkheden. Het wordt aangebracht op de bevestigingsplaat eronder. (B) Laserapparatuur voor de identificatie van de focuszone. De laser bevindt zich op de punt van de transducer en is in lijn met het brandpuntsgebied. (C) Afbeelding van de laser op het blootliggende ruggenmerg, die aangeeft dat het brandpunt van de transducer nu op deze locatie is gericht. (D) De transducer wordt neergelaten totdat de punt van de kegel zich 1 cm boven het snoer bevindt en de opening wordt gevuld met gel om een maximale koppeling te garanderen. De afstand van de transducer tot het ruggenmerg is 40 mm (brandpuntsafstand). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Evans blauwe kleurstof extravasatie in het ruggenmerg na sonicatie . (A) Foto van T9-T11 laminectomie-incisie bij ratten, waarbij het blootliggende ruggenmerg en de achterste dorsale ader duidelijk zichtbaar zijn. (B) Het omringende weefsel en de vasculatuur van het ruggenmerg worden blauw na intraveneuze injectie van Evans blauwe kleurstof (EBD). (C) EBD-extravasatie in ruggenmergparenchym op de plaats van sonicatie, wat aangeeft dat BSCB-verstoring is opgetreden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Ruggenmergextractie en visualisatie van BSCB-opening na perfusie. (A) Uitgesneden ruggenmerg van controlerat zonder LIFU-behandeling. Deze rat kreeg alleen MB's en EBD. Mid-sagittale doorsnede van de streng ingebed in paraffine wordt getoond in de inzet, en er is geen EBD-extravasatie zichtbaar. (B) Uitgesneden ruggenmerg van rat met LIFU-behandeling. Deze rat kreeg ook MB's en EBD. De kolom van EBD-extravasatie is zichtbaar en gelokaliseerd in het gesoniseerde gebied. Mid-sagittale plak van het koord ingebed in paraffine wordt weergegeven in de inzet, met een pijl die wijst naar de EBD-concentratie die zichtbaar is op de gesoniceerde locatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6: Detectie en evaluatie van BSCB-opening. (A) Ruggenmerg gekleurd met DAPI (nucleaire marker, blauw). Minimale EBD-autofluorescentie (rood) is zichtbaar. Deze rat kreeg geen LIFU. (B) Ruggenmerg gekleurd met DAPI (nucleaire marker, blauw). Gelokaliseerde EBD-autofluorescentie (rood) op de gesoniseerde doellocatie is zichtbaar. Deze rat kreeg LIFU en MB's. (C) Het ruggenmerg van een rat zonder LIFU gekleurd met hematoxyline (nucleïnezuurkleuring) en eosine (niet-specifieke eiwitkleuring) (H&E). Er zijn geen neuronale schade, bloedingen of holtelaesies zichtbaar. (D) Het ruggenmerg van een rat met LIFU gekleurd met H&E. Er zijn geen neuronale schade, bloeding of holtelaesies zichtbaar. (E) Ruggenmerg van een rat met chirurgisch letsel gekleurd met H&E. Pijlen wijzen op voldoende bloedingen en weefselbeschadiging. (F) Het ruggenmerg van een rat met schade als gevolg van krachtige sonicatie gekleurd met H&E. Pijlen wijzen op holtelaesies en de inzet toont mogelijke vacuolisatie. (G) Staafdiagrammen die de intensiteit van DAPI en EBD in het ruggenmerg van ratten met en zonder LIFU-sonicatie laten zien. Er is significant meer EBD-intensiteit in het LIFU-ruggenmerg in vergelijking met de negatieve controle (p = 0,016), ondanks een vergelijkbare DAPI-intensiteit (p > 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Gedragstest voor en na sonicatie . (A) Basso, Beattie, Bresnahan-apparaatopstelling, waarin ratten werden geregistreerd terwijl ze 5 minuten van onderaf liepen. (B) Stilstaand beeld van een opgenomen video. Deze video werd gebruikt om de motorische coördinatie en gang van de rat te beoordelen op de schaal van Basso, Beattie, Bresnahan. (C) Boxplot (n = 5) toont geen verandering in motorische scores pre-sonicatie, post-sonicatie of gedurende een overlevingsperiode van 5 dagen bij ratten die MB's en LIFU-behandeling kregen (p > 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Temperatuuranalyse met behulp van ex vivo ruggenmerg. Grafiek met temperatuurveranderingen in twee ex vivo ruggenmergmonsters gedurende een duur van 5 minuten voor, tijdens en na sonicatie. De parameters die voor sonicatie worden gebruikt, staan vermeld in tabel 1. Voor monster 1 waren de gemiddelde temperaturen voor, tijdens en na sonicatie respectievelijk 21,9 °C ± 0,1 °C, 22,1 °C ± 0,1 °C en 22,0 °C ± 0,1 °C. Voor monster 2 waren de temperaturen voor, tijdens en na de sonicatie respectievelijk 21,9 °C ± 0,1 °C, 22,5 °C ± 0,3 °C en 22,4 °C ± 0,2 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: CAD-bestand van laserrichtapparatuur. (A) Zicht op het laserapparaat van onderaf. Elke laser kan in het centrale gat in het midden worden geplaatst. (B) Zijaanzicht van het laserapparaat. (C) Afmetingen van het laserapparaat, met eenheden in inches. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend videobestand 1: Video van een rat die in het Basso-, Beattie- en Bresnahan-apparaat loopt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Hier worden de apparatuur en stappen beschreven die nodig zijn voor effectieve en gerichte BSCB-verstoring met behulp van gefocusseerde echografie met lage intensiteit (LIFU) in combinatie met toediening van microbellen (MB). Dit protocol is flexibel en kan worden geoptimaliseerd voor individueel gebruik met transducers met verschillende specificaties. Andere technieken voor LIFU-gemedieerde BSCB-verstoring zijn gebaseerd op het gebruik van magnetische resonantiebeeldvorming (MRI)-geleide systemen voor doellokalisatie, wat een dure hulpbron is¹⁶. De voordelen van de hier gepresenteerde techniek liggen in de snelle real-time visuele bevestiging van BSCB-verstoring en het gemak van targeting vanwege het open karakter van de procedure. Bovendien is het laserapparaat eenvoudig te gebruiken en te construeren en is er een CAD-bestand opgenomen in het aanvullende gedeelte. Als gevolg hiervan kunnen onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van eerste tests op de richtmogelijkheden van hun LIFU-transducer in een klein diermodel, dit protocol gebruiken als een hulpmiddel om snel de positionering van de focuszone op een interessante locatie te bevestigen. Deze techniek kan ook worden gebruikt door laboratoria die beginnen met het bestuderen van klinische toepassingen van LIFU, zoals medicijnafgifte, voordat ze investeren in complexere geleidingsmodaliteiten zoals Amerikaanse of MR-systemen. Momenteel bieden door de VS geleide modaliteiten een veelbelovender en kosteneffectiever pad in vergelijking met MR-systemen, hoewel deze laatste vaker in de literatuur worden gezien.

Er zijn verschillende cruciale stappen in deze procedure die zorgvuldig moeten worden uitgevoerd om een succesvolle BSCB-verstoring te garanderen. Het is absoluut noodzakelijk om onnodige druk op het ruggenmerg te vermijden tijdens de chirurgische laminectomie. Te veel fysieke manipulatie van het koord vergroot de kans op schade aan de BSCB. Schade verschijnt als een donkerbruine vlek in de navelstreng na extractie als gevolg van bloeding en verhoogde EBD-extravasatie. Bovendien moet worden gezorgd voor een maximale koppeling tussen de transducer en het blootliggende ruggenmerg. Als gevolg hiervan moet ervoor worden gezorgd dat bubbels uit de waterkegel en ultrasone gel worden verwijderd. Er mogen geen openingen zijn tussen de onderkant van de waterkegel en het snoer om volledige overdracht van de akoestische golf te garanderen. Tijdens de staartaderkatheterisatie moet worden voorkomen dat er per ongeluk lucht wordt doorgelaten met de gehepariniseerde zoutoplossing, EBD of MB-oplossingen. De injectie van lucht verhoogt de kans op een longembolie die resulteert in de dood van knaagdieren vóór het einde van de procedure^{aanzienlijk 28}.

Een veelvoorkomend probleem dat zich tijdens deze procedure kan voordoen, is het falen van een succesvolle EBD-injectie. Voor personen met minimale ervaring met staartaderkatheterisatie zal het uitvoeren van deze stap voorafgaand aan de laminectomie, positionering of targeting van dieren tijd besparen. EBD kan ook ruim voor MB-injectie worden geïnjecteerd zonder de sonicatie te beïnvloeden. Het gebruik van de tourniquet en het warmwaterbad dat in dit protocol wordt voorgesteld, zal helpen de staartaderen te verwijden en het slagingspercentage te verhogen. Bovendien vermindert uitdroging bij ratten de kans op een juiste plaatsing van de katheter. Een intraperitoneale injectie met zoutoplossing 10-15 minuten voorafgaand aan de staartaderkatheterisatie kan helpen. Tijdens de katheterisatie moet men 2 inch boven het uiteinde van de staart beginnen en in caudale tot craniale richting bewegen. Bewegen in de tegenovergestelde richting verkleint de kans op succes als gevolg van mogelijke aderinstorting of bloeding.

Een andere veel voorkomende uitdaging is het ontbreken van EBD-extravasatie ondanks sonicatie. Dit kan erop wijzen dat de parameters die worden gebruikt voor sonicatie onvoldoende zijn voor BSCB-verstoring. Als de sonicatiefrequentie bijvoorbeeld is ingesteld op een waarde die sterk verschilt van de centrale frequentie van de transducer, zal het sonicatievermogen te laag zijn om MB's te oscilleren en tight junction los te maken. Bovendien, hoe meer interfaces tussen de transducer en het snoer (bijv. waterkegel, membraan, gel, luchtbellen in water/gel), hoe lager de werkelijke sonicatie-intensiteit op het doel zal zijn. Het minimaliseren van deze interfaces, bijvoorbeeld door het gebruik van ontgaste gel en het grondig verwijderen van luchtbellen in de kegel, zal helpen om het volledige potentieel van de sonicatie over te brengen. Het protocol moedigt ook aan om de tijd tussen sonicatie en perfusie te verlengen om meer tijd te hebben voor EBD-extravasatie in het spinale parenchym. Hoewel BSCB-verstoring een voorbijgaande procedure is, zijn de hiaten enkele uren aanwezig voordat ze worden gesloten. Een lange wachttijd verhoogt de blootstelling aan isofluraan, maar resulteert ook in een grotere EBD-extravasatie in de navelstreng. Als alternatief kan EBD-extravasatie aanwezig zijn ondanks het ontbreken van sonicatie met LIFU. Om dit probleem op te lossen, moet tijdens de laminectomie voorzichtig worden omgegaan met onopzettelijke schade aan de BSCB. Mogelijke oplossingen zijn onder meer het optillen van de ruggengraat van de rat tijdens het klemmen om de hoeveelheid ruimte tussen de laminae en het koord te vergroten, evenals een kortere laminectomie. Een grondige PFA-perfusie vermindert ook achtergrondkleuring door EBD-verrijkt bloed uit het vaatstelsel in het ruggenmerg te verwijderen. Tijdens de transcardiale perfusie moet ervoor worden gezorgd dat het hart niet per ongeluk wordt gescheurd, wat kan leiden tot lekkage van PBS of PFA.

Het is belangrijk op te merken dat deze studie een enkele centrumervaring vertegenwoordigt voor LIFU-gemedieerde BSCB-verstoring. Bovendien test of optimaliseert dit protocol geen verschillende sonicatie-energieparameters en MB-concentraties. Als gevolg hiervan worden onderzoekers aangemoedigd om verschillende parameters en concentraties te onderzoeken bij het uitvoeren van deze techniek om de lokalisatie van het doelwit en BSCB-verstoring te optimaliseren voor hun specifieke onderzoeksbehoeften, vooral als de eerste resultaten nadelige effecten hebben. Groepen die bijvoorbeeld geen temperatuurveranderingen willen zien, kunnen verschillende parameters testen totdat ze een set vinden die aan dit criterium voldoet en voldoende BSCB-verstoring bereikt. Bovendien kunnen aanvullende experimenten worden uitgevoerd om de veiligheid van deze techniek te bevestigen. Zo kan de steekproefomvang worden vergroot, kan de overlevingsperiode worden verlengd en kunnen elektromyografie/loopanalysestudies worden uitgevoerd. Voor een langere overleving is het belangrijk om in gedachten te houden dat sommige onderzoeken aantonen dat hoge doses EBD soms chronische systemische toxiciteit kunnen veroorzaken, dus een lagere dosis kan verstandig zijn²⁹.

Een andere beperking van deze procedure is de invasieve aard van de laminectomie (die vereist is voor elke techniek die LIFU gebruikt voor het openen van BSCB, aangezien echografie niet door bot kan dringen). Het invasieve karakter van deze procedure kan worden verminderd door de duur van de laminectomie te beperken. Het uitvoeren van de laminectomie in de bovenste thoracale wervels, die korter en dunner zijn, kan de tijd die nodig is voor laminectomie verkorten tot minder dan 10 minuten. Vanwege de fragiele aard van de MB's en hun korte halfwaardetijd, is de tijd tijdens dit protocol beperkt. De injectie van MB's moet 1-2 minuten vóór de behandeling met LIFU plaatsvinden en nieuwe MB's moeten vóór elke sonicatie worden toegediend als er meerdere LIFU-behandelingen worden uitgevoerd. Voor experimenten met BSCB-verstoring voor meerdere ratten moeten mogelijk meerdere MB-flacons worden voorbereid. Omdat microbellen duur zijn, heeft het de voorkeur om de chirurgische workflow te wijzigen om de tijd tussen sonicaties te minimaliseren om het aantal gebruikte MB's te besparen.

De hier beschreven techniek is in de eerste plaats bedoeld als onderzoeksprotocol. Hoewel het laserrichtapparaat niet in alle klinische omgevingen de traditionele richtmodaliteiten zal vervangen, kan het in andere situaties nuttig zijn. Voor niet-invasieve operaties kunnen traditionele MRI-modaliteiten betrouwbaar worden gebruikt voor targeting³⁰. Voor invasieve operaties waarbij een laminectomie wordt uitgevoerd, kan het laserpuntapparaat dat in dit protocol wordt beschreven, worden gebruikt om snel het midden van de focale zone van sonicatie over een specifiek gebied te lokaliseren (bijvoorbeeld een tumor of een plaats van ruggenmergletsel) met het oog op medicijnafgifte of immunomodulerende therapie, terwijl het eventuele MR-begeleiding die zou plaatsvinden, aanvult.

Over het algemeen beschrijft dit protocol een effectieve en succesvolle techniek voor BSCB-verstoring en bevat het verschillende opties voor bevestiging van de BSCB-opening, zowel in real-time als nabewerking. Omdat de BSCB functioneert als een barrière voor toegang tot het ruggenmergparenchym, is verstoring van de BSCB een mogelijke methode om de toediening van therapieën te verbeteren. Weber-Adrian et al. gebruikten bijvoorbeeld LIFU met een frequentie van 1,114 MHz en een burstlengte van 10 ms om genafgifte aan de cervicale wervelkolom te mediëren⁶. Evenzo toonden Smith et al. aan dat LIFU met een frequentie van 580 kHz, gemiddelde akoestische piekdrukken rond 0,46 MPa en een burstlengte van 10 ms zou kunnen helpen bij de afgifte van een monoklonaal antilichaam, trastuzumab, aan het ruggenmerg in een knaagdiermodel van leptomeningeale metastasen¹⁰. De meeste onderzoeken hebben zich gericht op het gebruik van LIFU, in plaats van HIFU, vanwege het vermogen van LIFU om de BSCB tijdelijk te permeabiliseren en tegelijkertijd schade aan het onderliggende weefsel te voorkomen. Doorgaans gebruikt LIFU intensiteiten tussen 0.125-3 W/cm², terwijl HIFU intensiteiten gebruikt van 100-10,000 W/^cm2 of hoger³¹. Als gevolg hiervan oefent HIFU zijn effecten voornamelijk uit door weefsel te verwarmen, terwijl LIFU, met de gelijktijdige toediening van MB's, werkt door mechanische cavitatie-effecten. Gelijktijdige toediening van therapieën met MB's kan resulteren in een grotere extravasatie van het geneesmiddel in het spinale parenchym, evenals het potentieel om MB's met geneesmiddel te laden en de MB's met echografie te lyseren voor gerichte toediening van het geneesmiddel.

De sonicatieparameters, MB-concentratie en het type transducer dat in dit onderzoek wordt gebruikt, kunnen worden gewijzigd op basis van experimentele behoeften. Een transducer met een kleiner brandpuntsgebied kan bijvoorbeeld de voorkeur hebben voor experimenten waarbij meer controle nodig is over gelokaliseerde targeting, terwijl een transducer met een hoger vermogen kan worden gebruikt voor experimenten die een krachtige verstoring in een kortere tijd vereisen. Vanwege de flexibiliteit die dit protocol biedt, is er een groot potentieel voor gebruik in preklinisch, klinisch en translationeel onderzoek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.9% Heparinized Sodium Chloride	Baxter	FKB0953G	Flush tail vein catheter with heparinized saline to prevent clotting.
100 mL Luer Lock Tip Syringe (2)	Wilburn Medical	WUSA/120	One syringe can be used to inject PBS and one for PFA (during transcardial perfusion)
1x Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	10010001	For transcardial perfusion.
22 G catheter	Med Vet International	50-209-1694	Use to place a tail vein catheter.
97% Isoflurane	Thermo Scientific Chemicals	247-897-7	While rat is under isoflurane, be careful not to administer too much. A high dose can euthanize the rat.
Betadine 7.5%	Purdue Products	4677
Class A clear threaded glass vial	Fisherbrand	14-955-314	Use to store spinal cord extraction.
Digital balance scale	Kent Scientific	SCL-4000
Electric razor	Wahl Home Products	79449-200	Shave fur off skin at incision site before surgery
Eosin-Y with Phloxine	Epredia	71304
Evans blue dye	MP Biomedicals	02151108-CF	Although it is non-toxic, it will stain skin blue if direct contact occurs.
Fixation Plate Assembly with 0.5 mm Forceps	PSI Impactors	7001-2	Affix the stereotactic arm to this frame
Gauze	Fisherbrand	13-761-52
Heating pad	Kent Scientific	RT-0515
Hematoxylin	Epredia	7211
Iris Scissors with Angled Blades	ProDentUSA	12-15315
Isoflurane induction system	Kent Scientific	SOMNO-RATKIT
Laser targetting apparatus	NA	custom	CAD design file provided in supplemental section. Simply place a laser inside the apparatus created from the file.
Lubricating eye ointment	Systane	N/A
Luer Lock 3-Way Stopcock	Sigma	SAS7521-10EA	Can use to fill water cone through inlet valve
Lumason microbubbles kit	Bracco	0270-7099-16
Microscope cover glass	Fisherbrand	12-545J
Microscope slides	Fisherbrand	12-550-15
Microtome	Epredia	23-900-671
Mounting medium with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-2000-2
Mylar membrane	Chemplex	3016	Can cut membrane to appropriate size if too large for cone
NeuroFUS 2.52" diameter 250 kHz transducer	Sonic Concepts	CTX-250	Transducer system includes custom water cone and probe holder
NeuroFUS PRO v2.0 system	Sonic Concepts	NFS102v2	Includes Transducer Power Output, Matching Network and associated cables
Offset Bone Nippers	Fine Science Tools	16101-10	Use to remove spinous processes and laminae for laminectomy
Paraffin	Polysciences	24364-1	Can place spinal cord sample in paraffin to slice into thin sections for histology.
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J61899-AK	For transcardial perfusion.
Rat Surgical Kit	Kent Scientific	INSRATKIT	Consists of tweezer #5, needle holder, McPherson-Vannas scissors, Iris scissors, ALM self-retaining retractors, Iris forceps, and blunt probe. These products should be sufficient to perform a laminectomy.
Razor blade	Fisherbrand	12-640	Use to cut spinal cord extraction to desirable length and split section down midline.
Rectal thermometer	Kent Scientific	RET-2	Maintain rat temperature between 35.9–37.5 °C
Rubber band	Fisherbrand	50-205-1983
Single animal vaporizer unit	Kent Scientific	SF-01
Stereotactic arm	Kopf Instruments	Model 963
Sterile absorbent pad	McKesson	4033-CS150	Place under rat and above heating pad and fixation plate before laminectomy
Ultrasound gel	Aquasonic	PLI 01-34	Ensure gel is free of bubbles to the best of your ability.